Name: 세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 배우세요 세포 외 단백질 마이크로어레이 기술을 사용하여 저친화력 수용체-리간드 상호작용을 고처리량으로 선별하는 방법을. 단백질-마이크로비드 복합체를 활용해 일시적 단백질 상호작용 검출 민감도를 높이고, 소량의 단백질로 수백 개의 슬라이드를 생성할 수 있습니다.

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우리 감사 Philamer Calses와 고베 yuen의 비판적 원고를 읽고. 우리는 우수한 기술 조언을 랜디 엔 감사입니다.

1. 휴먼 Extracellular 단백질의 라이브러리의 생성
<ol><li>세포 표면 수용 체 또는 단백질 microarray 라이브러리를 구축 하는 관심사의 단백질 분 비의 목록을 컴파일하십시오. 특정 단백질 가족 (예를 들어 면역 글로불린 superfamily) 또는 단백질 선택적으로 표현 특히 세포 연구에 대 한 유형을 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>세포 표면 수용 체에 대 한 신호 펩 티 드 및 소프트웨어 도구를 사용 하 여 막 횡단 영역을 식별 하 여 세포 외 도메인 (ECD) 경계를 결정 합니다. 관련의 일부, 자유롭게 사용할 수 있는 온라인 도구, 재료의 표15,,1617,18에서 참조.</li>
	<li>관련 벡터에 관심과 클론의 유전자에 대 한 ECD를 음성 합성. 분 비 단백질 또는 일반적인 선호도 태그의 수에 융합 ECD의 STM 수용 체 적절 한 벡터와 페 셀의 조건된 미디어에서 또는 잠재-곤충 세포 식 시스템에서 정화 될 수 있습니다. 참고: 포유류 세포 기반 시스템 (HEK/293 또는 조 세포)는 적절 한 단백질 접기의 가능성과 glycosylation 등 관련 posttranslational 수정 추가 극대화 하기 위해 권장 됩니다.</li>
	<li>표준 선호도 정화 방법으로 단백질 정화. 자동 또는 반자동 절차 관심9,,1920의 단백질 집합 생성을 확장할 수 있는 단백질의 수백의 정화에 적합을 설명 하는 이전 노력 21. 참고: SDS 페이지, 크기 배제 크로마토그래피 (S), 또는 다 각 레이저 빛 (쇼핑몰)를 뿌리는 권장 모든 비 공유 집계를 평가 하 고 단백질 준비의 전반적인 품질에 대 한 제어.</li>
	<li>200 또는 400 μ g/mL, 가능 하면 단백질을 조정-20 ° c.에 극저온 튜브에서 장기 저장을 위한 80% 글리세롤과 주식 희석 이러한 마스터 주식 진술 하 고 필요한 경우에 액세스 해야 합니다.</li>
	<li>각 단백질 (100 μ)의 aliquots 96 잘 접시 (주식 접시)을 전송 하 고 접착 호 일 인감 microarray 슬라이드 준비까지-20 ° C에서 저장. 주식 판 freeze-thaw 주기를 최소화 하 고 단백질 안정성 보장을 생성 됩니다.</li>
</ol>2. 세포 외 단백질 Microarray 인쇄
<ol><li>표준 microarrayer를 사용 하 여 슬라이드 인쇄. 여기에 설명 된 프로토콜에 대 한 활용 악기 57 슬라이드/실행의 용량이 고 48 탐지 핀을 잡고 프린트 헤드를 사용 합니다. 이 핀 ~ 100 μ m 직경 구분 ~ 350 μ m의 반점 거리의 관광 명소를 생성 하 고 로드 당 0.25 μ를 그립니다. 이 구성에서 슬라이드 당 8000 명소까지 가질 수 있습니다.</li>
	<li>주식 판에서 작업 플레이트 (384 잘 접시, 10 μ 샘플/잘)를 생성 합니다. 슬라이드 인쇄는 microarrayer를 사용 하 여 이전에 수동으로이 단계를 수행 합니다. 그런 다음, 단백질 (단백질 반점의 탈수를 방지)을 60% 습도 epoxysilane 슬라이드에 퀼 형 스포팅 핀 자리. 참고: Cy3 표시 된 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 발견하실 수 있습니다 각 단백질 샘플 (PBS/40% 글리세롤에 5 μ g/mL) 간의 중복에 마스크 피팅 (4 절 참조)에 대 한 배열 시각화. 좋지만,이 단계는 선택 사항입니다.</li>
	<li>인쇄, 후 습도 환경에서 단백질 microarray 슬라이드를 제거 하 고 하룻밤 비활성화 표면에 PBST에 5% 우유와 함께 그들을 차단 합니다. 참고: 선호 접근 차단 솔루션을 슬라이드 표면에 침전의 정밀한 안개를 생성 하는 초음파 fogger를 사용 하는.</li>
	<li>동결을 방지 하기 위해 50% 글리세롤에-20 ° C에 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>3입니다. Multivalent 미끼 복합물의 준비
참고: extracellular 단백질 사이 상호 작용 종종 낮은 친 화력에 의해 특징. 단백질 A 코팅 microbeads에 바인딩 갈망, Fc 태그 ECD로 쿼리 단백질, 캡처 기반으로 multivalent 접근을 증가 하 여 이러한 상호 작용의 검색을 사용 하려면 개발된4했다.
<ol><li>Label 캐리어 IgG Cy5 monoreactive 염료와 검색에 사용 되 고 염 열을 사용 하 여 무료로 염료를 구분. 280, 650 nm에 자외선 흡 광도 측정 하 여 염료 단백질 비율을 결정 합니다. 참고: 2.0과 4.0 사이의 단백질-염료 비율이 일반적으로 사용 됩니다. 100000 x g 15 분 라벨링 과정으로 인해 잠재적인 가용성 집계 제거에서 Cy5 어원이 같은 말을 회전 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>단백질 쿼리 단백질의 일정 금액에 대 한 A의 적정에 의해 최적의 microbead 단백질 비율을 결정 합니다. 아니 무료 Fc 태그 단백질의 남아 있는 구슬의 최소 saturating 볼륨 biolayer 간섭계에 의해 결정 경쟁력 분석 결과 사용 하 여 측정으로 심사에 사용 됩니다.</li>
	<li>Fc 태그 쿼리와 Cy5 IgG 단백질 A microbeads와 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 30 분 PBS에 튜브 회전자에 혼합 배양 하 여 microbead-단백질 복합물을 형성 한다.</li>
	<li>이 단지를 형성, 최종 농도 20 μ g/ml에서 쿼리 단백질을 사용 합니다. 쿼리 단백질과 Cy5 IgG의 어 금 니 비율을 계산 하려면 분할 IgG의 분자량에 의해 쿼리 단백질의 분자량 (150000 Da)와 Cy5-IgG 필요의 농도 결정 하기 위해 40 μ g/mL를 곱합니다.</li>
	<li>샘플 한 (1 mg/mL) 부 화 직전에 microarray와 Fc 융합 단백질 배열에 있을 수 있는 모든 무료 단백질 A 구슬의 바인딩 방지 (4.2 섹션 아래 참조) 슬라이드 하는 수용 성 단백질을 보충 한다. 참고: 최종 반응 볼륨 활용 교 잡 역 또는 보육 실에 따라 달라질 수 있습니다. 계측 자료의 테이블에 에서 설명 된 비교적 작은 볼륨 (슬라이드 당 ~ 200 μ)을 사용 하 여 샘플 보육을 수 있습니다.</li>
</ol>4. 심사 및 처리에 Microarray를 세포 외 단백질
참고: 자동 처리 플랫폼을 제공 하는 제조 업체의 숫자가 있다. 교 잡 역, 사용할 수 없는 경우 다음 단계를 수동으로 수행할 수 있습니다, 그리고 항상 물속에 충분 한 양의 슬라이드를 유지 하는 버퍼는 보장.
<ol><li>따뜻한 실내 온도에 슬라이드와 교 잡 역에 로드 하기 전에 잔여 글리세롤을 제거 하려면 PBS/0.1% 트윈 20 (PBST)와 린스.</li>
	<li>다음 심사 프로토콜 사용 하 여:<ol>
<li>PBST 1 분 동안 씻어.</li>
		<li>1 mg/mL 단백질 A PBS/5% 우유의 200 μ를 로드 하 고 있는 microarray에 있을 수 있는 Fc 태그 단백질 바인딩에서 microbeads uncomplexed 단백질을 방지 하기 위해 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>1 분 동안 PBST 5 번 씻어.</li>
		<li>쿼리: microbeads 1 mg/mL 단백질의 복잡 한의 200 μ를 로드 하 고 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>PBST 1 분 동안 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교 잡 후 슬라이드를 물으로 씻어, 개별 50 mL 원뿔 튜브에 놓고 5 분 900 x g에서 회전 하 여 건조 합니다.</li>
	<li>마지막으로, 각각 532와 635 nm, 흥미로운 여 microarray 스캐너 Cy3 (해당 되는 경우 BSA Cy3 인쇄 되었다) 검출에 적합 한와 Cy5 형광 슬라이드를 스캔 합니다.</li>
	<li>동반 microarray 데이터 분석을 사용 하 여 데이터 분석을 수행 합니다. (.Gal 파일)로 관련 배열 목록 데이터 추출 소프트웨어에 로드 됩니다. 이 단계에서 Cy3 BSA 명소 블록을 찾을 때 필요한 기능의 수동 정렬 다음 소프트웨어에서 자동 맞춤 옵션을 사용 하 여를 사용 합니다. 추가 분석을 위해.gpr 파일로 파일을 저장할.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>GPR 파일 및 프로세스 r microarray 데이터4,5의 분석을 위해 일반적으로 이용 하는 limma 패키지를 사용 하 여 데이터를 저장 합니다.<ol>
<li>전처리, 교정 및 슬라이드 내의 정규화 배경 할. 이후 각 단백질은 중복된 장소에서 인쇄, 두 복제 측정 라이브러리에서 해당 단백질에 대 한 하나의 점수를 만들 결합.</li>
		<li>각 슬라이드에 대 한 점수를 계산 하 고 슬라이드 사이 높은 점수를 받은 후보자의 교차로 대 한 결과 분석.</li>
		<li>슬라이드 변화에 대 한 제어를 별도 인쇄 실행에서 중복 된 microarrays를 사용 하 고 두 화면에서 데이터를 나타내는 교차 플롯을 사용 하 여 최종 안타를 호출.</li>
		<li>마지막으로, 추가 수준을 필터링 제외는 배열 내에서 무차별 단백질을 수행 합니다. 이러한 일반적인 바인더 충돌로 특정 임계값을 초과 하는 단백질 주파수 독립 화면에서 사용자에 의해 정의 된 대로 식별 됩니다. 참고:이 프로토콜은 톰 외. 20135에서 자세히 설명 되어 있습니다. 호출 하는 일반적인 바인더는 누적의 결정에 따라 우리의 경우에서 적중률, 먹이 그리고 5%의 데이터 기반 제거 임계값 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

대형화, S.R-R 및 N.M-M. 제네 텍 직원과 Genentech Inc./로슈 그룹에 자신의 공유 있습니다.

고아 수용 체의 상당수는 인간 게놈에 남아 고 소설 상호 작용 파트너 이전 특징이 ligands과 세포 외 단백질에 대 한 등장을 계속 합니다. 항상성, 뿐만 아니라 질병, 이어지는 dysregulation 셀룰러 통신을 지정 하는 메커니즘을 이해 하 고 따라서 새로운 또는 향상 된 알려 필수적 이다 모형 유기 체 및 인간 상호 작용 수용 체 ligand 정의 치료 옵션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 널리 사용 되는 기술에 의해 세포 외 단백질 상호 작용의 탐지 세포 수용 체와 그들의 상호 작용 협동자의 생화학에 관련 된 기술 과제 때문에 주로 중요 한 방 벽을 대표 했다. 이 보고서에서 우리는 쿼리 PPIs의 향상 된 검색을 위한 microbead 복합물의 활용에 강조를 가진 관심사의 단백질의 심사에 대 한 세포 외 단백질 microarray 사용 하 여를 설명합니다.
수용 체 수용 체 상호 작용을 프로 빙 많은 순수 관련 쌍 micromolar 범위<sup class="xre...

여기에 검토 하는 방법은 세포 외 단백질 microarray 형식,이 라이브러리에 대 한 관심의 대상의 심사에 대 한 방법으로 다음의 컬렉션의 인쇄를 설명 합니다. 우리는 낮은 바인딩 선호도 특징 상호 작용 검출을 위한 중요 한 단계로 단백질 multimerization를 확인 했습니다. 이러한 상호 작용의 탐지를 향상 시키기 위해, 우리 microbeads를 사용 하 여 관심사의 쿼리 단백질의 multimerization에 따라 프로토콜을 설명 합니다.
분 비 되며 세포 표면 표현 단백질 (총칭 하 여 세포 외 단백질에 게 불리는) 그들의 상호 작용 협동자 함께 셀룰러 통신, 신호 및는 microenvironment와의 상호 작용의 주요 레 귤 레이 터. 그들은, 따라서, 많은 생리와 병리학 과정 조절에 필수적인입니다. 인간 게놈 (≈5, 000 단백질)의 4 분의 1 약 extracellular 단백질에 대 한 인코딩, 체계적으로 전달 된 약물에 게 그들의 의미 및 접근성, 대표 약물 개발1에 대 한 주요 대상. 따라서, 세포 외 단백질 단백질 목표 시장, "druggable proteome"로 알려진에 승인 된 약물에 대 한 알려진 약리 작업의 70% 이상 대표. 그들의 중요성 및 풍부에도 불구 하 고 세포 외 단백질-단백질 상호 작용 (ePPI) 네트워크 현저 하 게 underrepresented 사용 가능한 데이터베이스에 남아 있습니다. 이것은 근본적으로 대부분의 사용 가능한 기술2를 사용 하 여 그들의 특성화 하는 걸로 extracellular 단백질의 복잡 한 생 화 확 적인 성격 때문 이다. 첫째, 막 단백질은 어려운 solubilize, 종종 거친 세척 조건 및 세제;를 포함 하는 프로세스 둘째, 세포 외 단백질 종종 부족 관련 포스트 번역 상 수정 때이 단백질은 표현에 일반적으로 결 석 있다 glycosylation 분리 시스템을 사용 합니다. 마지막으로, 같은 공동 수용 체 면역 세포에 수용 체 사이 상호 작용은 종종 과도 하 고 특징이 매우 낮은 선호도 (하 ~ 1 μ M에서 KD > 100 μ M 범위). 모두,이 단백질과 그들의 바인딩 파트너 가장 널리 렌더링의 자연 친 화력 정화/질량 분석 (AP/MS) 또는 효 모-2-하이브리드, 세포 외 공간에서 상호 작용의 탐지에 대 한 부적 절 한 같은 기술을 활용 2 , 3.
이러한 기술적 과제를 극복 하 고 extracellular 단백질에 대 한 새로운 상호 작용의 발견을 촉진 하기 위해, 우리는 높은 범위 extracellular 단백질 microarray4,5를 개발 했습니다. Microarrays 소량 샘플, 고밀도 표면 생성의 이점을 제공 하 고 높은 처리량 연구를 일반적으로 받을. 주로 특정 단백질 가족6,7, 또는 cytosolic 상호 작용에 초점을 맞추고 이기는 하지만 단백질 microarray 기반 연구 이전 여러 모델에 대 한 유기 체를 위한 단백질 상호 작용에 관련 된 통찰력 제공 8. 반면, 제한 된 작업은이 기술을 사용 하 여 세포 외 단백질 상호 작용을 조사 하기 위해 수행 되었습니다. 우리 정화 분 비 단백질의 포괄적이 고 매우 다양 한 라이브러리를 구축 하 여 ePPIs의 연구를 활성화 하는 단백질 microarray 방법을 개발 하 고 하나의 막 횡단 (STM) 수용 체 표현으로 재조합 세포 외 도메인 (ECD)에 융합 친 화력 정화4공통 태그 단백질 microarray 스크린의 성공 고품질 단백질 라이브러리의 설립에 크게 의존합니다. 라이브러리 및 쿼리 단백질의 표현을 위한 포유류 세포 또는 곤충 세포 우선적으로 선택 되었다 분리 식 시스템, 포스트 번역 상 수정 glycosylation 또는 이황화 채권 등의 적절 한 추가 되도록. SDS 페이지, 크기 배제 크로마토그래피 및 멀티 앵글 레이저 광 산란 일반적으로 재조합 단백질 품질을 평가 하기 위해 활용 하는 기술이 있습니다. 단백질 라이브러리는 다음 epoxysilane 슬라이드에 발견 하 고 장기간 사용-20 ° C에 저장. 0.4 mg/mL의 위 단백질 농도 프로토콜 아래에 설명 된 권장 됩니다. 따라서, 낮은 표현 단백질 농도 단계 샘플 인쇄 및 저장 하기 전에 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 기술의 주요 장점은 작은 양의 필요한 단백질 (단백질의 50 μ g은 수행 하기에 충분 한 > 2000 화면), 최소 쿼리 단백질 소비 (중복 화면 당 20-25 μ g)와 함께. 프로토콜 및 장비를 사용 하 여 설명, 그리고 제공 하는 라이브러리를 사용할 수 있는 개별 쿼리 단백질에 대 한 결과 1 작업 일 안에 생성 될 수 있습니다.
Extracellular 환경에 있는 단백질 상호 작용을 감지 하는 주요 과제는 가장 일반적으로 사용 되는 방법론에 의해 식별을 방해 그들의 특질 상 약하거나 과도 자연에서 발생 합니다. 바인딩 갈망을 크게 증가 약한 단백질 상호 작용9,,1011의 검출 감도 향상 시킵니다. 우리 multimerize 하는 방법을 개발 하는이 원칙에 따라 (Fc 융합으로 표현) 쿼리 단백질 단백질 A 코팅 구슬4,5를 사용 하 여. 무작위 라벨 쿼리 단백질의 어떤 잠재적인 비활성화를 방지, 우리 대신는 무관 한 인간 면역 글로불린 G와 Cy5 라벨을 추가 쿼리 단백질 함께 단백질 A 구슬에 따라서의 직접 활용으로 인해 모든 아티팩트를 제거는 관심사의 단백질에 염료. 여러 공동 수용 체 쌍의 micromolar 선호도 감안할 때, multivalent 단지 크게 신호 대 잡음 비, Fc-퓨전 쿼리 단백질 용 해 단백질4상영에 비해 향상 시킬.
요약 하자면,이 프로토콜의 목표 microarray 슬라이드 포함 하는 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 위해 기존의 세포 외 단백질 라이브러리의 준비를 설명 하는입니다. 우리는 슬라이드 인쇄, extracellular 단백질 라이브러리에 대 한 관심사의 단백질의 심사에 대 한 프로토콜에 대 한 단계를 검토 합니다. 또한, 우리는 연구에서 단백질의 증가 된 갈망을 달성 하기 위해 microbeads에 따라 ePPIs의 향상 된 검색 하는 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 세포 외 단백질 microarray 기술 심사 및 낮은 허위 양성 비율와 소설 ePPI 감지만 그램 양의 아래 쿼리 단백질을 이용 하 여 빠르고, 강력 하 고 효과적인 접근 방식을 나타냅니다. 조사입니다. 이 기술 수용 체12,13,14, 바이러스 성 immunoregulators 포함 하 여 다양 한을 위한 이전에 알려지지 않은 세포 기능 및 신호 경로에 관련 된 통찰력을 제공 하는 여러 연구를 자극 했다 그리고 드 orphanize 관심사의 어떤 세포 외 단백질을 이용 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>초순수 MB 등급 글리세롤</td><td>USB Corporation</td><td>56-81-5</td><td>단백질 저장</td></tr><tr><td>SeptoMark 차단 버퍼&nbsp;</td><td>Zeptosens</td><td>BB1, 90-40</td><td>차단 버퍼 마이크로어레이 슬라이드</td></tr>, <tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Roche</td><td>03-117-957-001</td><td>마스크 장착용 슬라이드 제어(옵션),</td></tr> <tr><td>폴리프로필렌 멀티웰 플레이트</td>, <td>Greiner Bio One</td>, <td>82050-678</td><td>단백질 저장</td></tr><tr><td>, 폴리프로필렌 멀티웰 플레이트</td>, <td>Arrayit,</td><td>MMP384</td>, <td>슬라이드 인쇄</td></tr>, <tr><td>NanoPrint, LM60 또는 이와 유사한 연락처 마이크로어레이어,</td><td>Arrayit,</td><td>NanoPrint, LM60 또는 이와 유사한 접촉, 마이크로어레이어,</td><td>슬라이드 인쇄</td></tr><tr><td>, 마이크로 스포팅 핀</td>, <td>어레이잇</td>, <td>마이크로 스포팅 핀</td>, <td>슬라이드 인쇄</td></tr><tr><td>, ZeptoFOG 차단 스테이션</td>, <td>Zeptosens</td>, <td>ZeptoFOG 차단 스테이션, 탈</td>지 분유 <td>인쇄 후</td>1210 블록 슬라이드</tr>, <tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0031</td><td>차단 솔루션</td></tr><tr><td>에폭시실란 코팅 유리 슬라이드</td><td>Nextrion Slide E</td><td>1064016</td><td>Microarray 슬라이드</td></tr><tr><td>유리 홀더 및 슬라이드 랙 세트</td><td>Wheaton</td><td>900303</td><td>Slide storage</td></tr><tr><td>Cy5 monoreactive dye</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>Albumin labeling</td></tr><tr><td>Cy5 monoreactive dye</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td>Human IgG labeling</td></tr><tr><td>Pro-spin desalting column</td><td>Princeton Separations</td><td>CS-800</td><td>Remove free dye</td></tr><tr><td>접착제 알루미늄 호일 씰</td><td>AlumaSeal</td><td>F-384-100</td><td>씰 스톡 플레이트</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 극저온 바이알</td><td>Corning</td><td>430658</td><td>Master 바이알 단백질 라이브러리 스토리지</td></tr><tr><td>단백질 A 마이크로비즈</td><td>Miltenyi</td><td>120-000-396</td><td>쿼리 단백질 다중화,</td></tr><tr><td>Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>& 주의; 009-000-003</td> 단백질 A 시그마 <td>표지를 위한 관련 없는 IgG</td></tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp; P7837</td><td>마이크로어레이 슬라이드 차단</td></tr><tr><td>혼성화 스테이션, a-Hyb 또는 이와 유사한</td><td>Miltenyi</td><td>혼성화 스테이션, a-Hyb 또는 이와 유사한</td><td>자동 마이크로어레이 처리(옵션)</td></tr><tr><td>GenePix 4000B 스캐너 또는 유사한</td><td>분자 장치</td><td>GenePix 4000B 스캐너 또는 유사한</td><td>슬라이드 스캐닝</td></tr><tr><td>GenePix Pro 또는 이에 상응하는 데이터 추출 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>GenePix Pro 또는 이에 상응하는 데이터 추출 소프트웨어</td><td>데이터 처리</td></tr><tr><td>신호 P4.1</td><td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td><td>온라인 소프트웨어</td><td>신호 펩타이드 절단 부위의 존재 및 위치를 결정하기 위한 예측 도구</td></tr><tr><td>TMHMM 2.0 서버</td><td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td><td>온라인 소프트웨어</td><td>단백질의 막관통 나선 예측</td></tr><tr><td>Phobius</td><td>Stockholm Bioinformatics Center</td><td>온라인 소프트웨어</td><td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td></tr><tr><td>TOPCONS</td><td>Stockholm University</td><td>온라인 소프트웨어</td><td>membrane topology 및 신호 펩타이드 예측</td></tr></tbody></table>

세포 외 단백질 microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

분 비 요인, 곁에 막 수용 체 그리고 그들의 상호 작용 협동자 셀룰러 통신의 주요 레 귤 레이 터 및 항상성 및 질병, 폭포를 신호의 시작 이며 같은 대표 주요 치료 대상. 이러한 상호 작용 네트워크 그들의 관련성에도 불구 하 고 현재 데이터베이스;에서 크게 이루어지지 남아 따라서, 세포 외 단백질 가장 문서화 바인딩 파트너가 있다. 이 불일치는 주로 기능 단백질, 고 약한, 낮은 선호도, 단백질 상호 작용 세포 표면 수용 체 간에 자주 설정의 식을 포함 하 여 세포 외 단백질의 연구와 관련 된 문제 때문입니다. 이 방법의 목적은 세포 외 단백질 단백질 단백질 상호 작용의 심사에 대 한 microarray 형식 라이브러리의 설명 이다. 약한 상호 작용의 탐지를 사용 하려면 쿼리 단백질 연구의 multimerization에 따라 메서드를 설명 합니다. 증가 multivalency이 multimerization microbead 기반 접근을 결합, 단백질 microarray 높은 처리량 과도 단백질-단백질 상호 작용의 강력한 검색을 수 있습니다. 이 메서드는 신속 하 고 낮은 샘플 사용-접근 어떤 세포 외 단백질에 적용 가능한 새로운 상호 작용의 식별을 위해 제공합니다. 단백질 microarray 인쇄 및 심사 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 세포 외 공간 상호 작용 단백질의 발견에 대 한 강력한 방법을 추구 하는 수 사관을 위해 유용할 것 이다.

세포 외 단백질 microarray 기술에 대 한 워크플로의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 세포 외 단백질 라이브러리를 포함 하는 microarray 슬라이드 사용할 수 있습니다, 일단 관심 및 데이터 분석의 단백질의 심사는 1 일 안에 완료할 수 있습니다. 멤브레인 포함 수용 체 간의 많은 순수 관련 상호 작용 매우 약한 바인딩 강점 (KD micromolar 범위에서) 특징 이다. 이러한 상호 작용의 개선, 단백질 A-microbeads에 쿼리 (Fc 융합으로 표현) 단백질 multimerization에 따라 방법 개발 되었다. 이 프로토콜은 텍스트에서 설명 하 고 PPI의 향상 된 탐지를 위한이 접근의 성능의 대표적인 예는 그림 2에 표시 됩니다.
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여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

이 방법은 높은 처리량과 높은 감도 모두 세포 외 단백질에 대한 새로운 결합 파트너의 검출을 가능하게함으로써 단백질 단백질 상호 작용 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 몇 마이크로그램의 단백질만 으로 마이크로 어레이 프린터를 사용하여 수백 개의 슬라이드를 생성할 수 있다는 것입니다. 슬라이드 인쇄에 표준 마이크로 어레이어를 사용합니다.이 계측기는 런당 57개의 슬라이드를 사용할 수 있으며, 48개의 스포팅 핀을 들고 있는 프린트 헤드를 사용하며 슬라이드당 최대 8, 000개의 스팟을 수용할 수 있습니다. 스톡 플레이트에서 잘 샘플 10 마이크로 리터에서 384 개의 웰 플레이트를 사용하여 작업 플레이트를 생성합니다. 마이크로 어레이를 사용하여 슬라이드 인쇄하기 전에 이 단계를 수동으로 수행합니다.그런 다음 에폭시 실레인 슬라이드에 퀼 타입 스포팅 핀이 있는 단백질을 60%의 습도로 찾아 단백질 반점의 탈수를 방지합니다. Cy3 표지된 소 혈청 알부민은 마스크 피팅을 위한 어레이를 시각화하기 위해 각 단백질 샘플 사이에 중복된 것으로 발견될 수 있다. 인쇄 후, 가습 된 환경에서 단백질 마이크로 어레이 슬라이드를 제거합니다.다음으로 초음파 포저를 사용하여 슬라이드 표면에 정착하는 차단 용액의 미세한 안개를 생성합니다. 그런 다음 PBST에서 5 %의 우유로 밤새 슬라이드를 차단하여 표면을 활성화시합니다. 동결을 방지하기 위해 50 % 글리세롤에서 영하 20도에서 슬라이드를 저장합니다.세포 외 단백질 간의 상호 작용은 종종 낮은 친화력을 특징으로합니다. 이러한 상호작용의 검출을 가능하게 하기 위해, 결합 적 확대를 증가시킴으로써, 우리는 FC태그가 지정된 쿼리된 단백질의 캡처에 기초하여 다원적 접근법을 개발했다 단백질 A 코팅 마이크로 비드에 세포외 도메인을 태그. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Cy5 모노 반응성 염료로 레이블이 지정된 반송파 IgG를 회전합니다.쿼리 단백질 및 Cy5 IgG의 어금니 비율을 계산하기 위해, 질의 단백질의 분자량을 IgG의 분자량으로 나누고 밀리리터당 40 마이크로그램을 곱하여 Cy5 IgG의 농도를 결정한다. 일단 모든 비율이 결정되면 FC 태그 쿼리및 Cy5 IgG를 단백질 A 마이크로 비드와 결합하여 마이크로 비드 단백질 복합체를 형성하였다. 실내 온도에서 30분 동안 튜브 회전기에서 PBS의 서스펜션을 혼합하여 빛으로부터 보호합니다.스크리닝을 시작하려면, 하이브리드화 스테이션에 로드하기 전에 실온에서 준비된 슬라이드를 따뜻하게 한다. 스크리닝을 수행하려면 먼저 PBST로 마이크로 어레이를 1분 동안 세척하여 잔류 글리세롤을 제거합니다. PBS 5%우유에 밀리리터 단백질 A당 1밀리그램의 200 마이크로리터를 적재하고 30분 동안 배양하여 복잡하지 않은 단백질 A 마이크로 비즈가 마이크로 어레이에 존재할 수 있는 FC 태그 단백질에 결합하지 못하도록 합니다.혼성화 스테이션이 PBST로 슬라이드를 감산한 후, 밀리리터 단백질 A당 1밀리그램이 존재하여 쿼리 마이크로 비드 복합체200 마이크로리터를 적재하고 30분 동안 배양한다. 혼성화 스테이션에 의해 슬라이드의 혼성화 및 세척에 따라, 물로 슬라이드를 헹구고 개별 50 밀리리터 원모형 튜브에 배치합니다. 5 분 동안 900 배 G에서 회전하여 튜브를 건조.마지막으로, 각각 532 및 635 나노미터에서 흥미 진진한 으로 Cy3 및 Cy5 형광을 검출하는 데 적합한 마이크로 어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하십시오. 여기에 인쇄된 슬라이드의 대표적인 이미지가 표시됩니다. Cy3 라벨소 소 세럼 알부민 스팟은 녹색입니다.반점은 인쇄 공정의 품질 관리로 복제하여 인쇄되었습니다. 세포외 단백질 마이크로 어레이 기술을 사용하여 결합 파트너의 식별을 위해 선별된 고아 단백질의 대표적인 결과는 여기에 나와 있다. 중복 된 적색 반점은 선별 된 쿼리 단백질에 대한 히트로 식별됩니다.설명되는 이 방법은 매우 다재다능하며 단백질 라이브러리의 영역 인쇄에 사용될 수 있으며, 특정 단백질 패밀리 또는 우리와 같은 단백질의 큰 편집이 될 수 있습니다. 관심있는 단백질은 평가 될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 주의슬라이드를 처리하고 인쇄된 단백질의 활동 손실을 방지하기 위해 건조하지 않도록 하는 것이 중요합니다.관심 있는 단백질의 스크린에 이어, 표면 플라스몬 공명과 같은 직교 기술을 사용하여 관찰된 모든 안타를 더 검증하는 것이 좋습니다. 개발 후, 이 기술은 연구원이 인간에 있는 세포외 단백질 상호 작용을 공부하는 쪽을 포장했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

AVEXIS 세포 인식 프로세스에 관련된 소설 세포 수용체 - 리간드 쌍을 체계적 화면으로 개발된 높은 처리량 단백질 상호 작용 분석이다. 그것은 구체적으로 다른 높은 처리량 접근 방식을 사용하여 식별하기 어려운 일시적인 단백질 상호 작용을 감지할 수 있도록 설계되었습니다.

낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

이 비디오에서는 증폭된 발광 근접 균질 분석(bead-based proximity assay)을 시연합니다. 이 제품은 균일한 크기의 수용체 및 공여체 비드를 사용하며, 단백질 상호 작용을 억제하는 잠재적인 소분자를 스크리닝하기 위해 상호 작용하는 경향이 있는 두 개의 단백질로 고정되어 있습니다.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 소분자를 스크리닝하기 위한 비드 기반 근접 Assay입니다.

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

우리는 다중 미세 기반 항체 배열을 사용하여 타액 단백질 프로파일위한 절차를 설명한다. 단일 클론 항체는 공유 보디이 미드 화학을 사용하여 형광 염료로 인코딩 된 4.5 μm의 폴리머 마이크로 스피어에 연결되어 있었다. 변형 된 미소 구체는 형광 샌드위치 면역 분석을 사용하여 침의 단백질 수준을 측정하기 위해 광섬유 마이크로 웰에서 증착되었다.

고분자 마이크로 스피어 및 광섬유 번들을 사용하여 인간의 타액 단백질 분석을위한 다중 형광 마이크로 어레이

거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

두 슬라이드를 간단 하 게 스냅 하 여 교차 reactivity 무료 다중화 샌드위치 immunoassays를 수행 하기 위한 스냅 칩 기술을 설명 합니다. 스냅 기구 시 약 microarray microarray에서 안정적으로 전송 하는 데 사용 됩니다. 어떤 생 화 확 적인 반응을 교차 오염 없이 다른 시 약의 colocalization를 요구에 대 한 스냅 칩을 사용할 수 있습니다.

교차 reactivity 무료 및 정찰 병 무료 스냅 칩 샌드위치 Immunoassays 다중화

이 원고는 세포외 수용체-리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 규모의 세포 기반 스크리닝 접근법을 기술한다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

배우세요 세포 외 단백질 마이크로어레이 기술을 사용하여 저친화력 수용체-리간드 상호작용을 고처리량으로 선별하는 방법을. 단백질-마이크로비드 복합체를 활용해 일시적 단백질 상호작용 검출 민감도를 높이고, 소량의 단백질로 수백 개의 슬라이드를 생성할 수 있습니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

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