Name: 실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 배우세요 실시간 이미징 및 2단계 반복 흐름 시스템을 사용하여 곰팡이 바이오필름 발달을 정량화하는 방법을. 유체 흐름이 Candida albicans 바이오필름 성장에 미치는 영향을 실시간으로 평가하고 정량적 알고리즘으로 이미지 데이터를 분석합니다.

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저자 흐름 장치의 디자인에서 중요 한 입력을 제공 하기 위한 박사 웨이드 Sigurdson를 인정 하 고 싶습니다.

1. 흐름 장치 조립
<ol><li>아래에서 설명 하는 고려 그림 1에서 도식에 따라 재료의 테이블에 에서 나열 된 부품을 구성 합니다. 참고: 편의 위해, 장치 두 가지 측면, 녹색 측면 (모든 업스트림 미디어 플라스 크를 슬라이드의), 그리고 오렌지 나누어 흐름 측면 (모든 다운스트림 미디어 플라스 크를 슬라이드의).<ol>
<li>모든 흐름 장치 공기 누출, 미디어 플라스 크 (그림 1, 1)의 유일한 예외를 방지 하기 위해 꽉 있는지 확인 합니다. 이 위해 적용할 배관공 테이프 맥 dampener (PD)와 2 µ m 필터 병 (FB)을 제외 하 고 조립 하기 전에 어떤 남성 스레딩 배관공 테이프 필요 없는 고무 가스 켓 밀폐 그들을 유지.</li>
		<li>모든 가시 피팅 긍정적인 압력 하에서 정상 작동 중에 귀 클램프를 적용 (즉, 펌프의 하류).</li>
		<li>사용 색상 코딩 A 또는 G 밸브 위치를 랩 테이프 (첨부 파일 및 성장, 각각), 펌프 위치, 슬라이드 연결 위치와 0.2 µ m 필터 연결.</li>
		<li>현미경, 모든 흐름 장치를 하류 (오렌지 사이드의 대다수) 플라스 크에 펌프의에 있어야 보조 포함 다는 것을 명심 하 고 흐름 시스템 사이의 거리를 기반으로 하는 사용 되는 튜브의 길이 결정 합니다. 여분의 튜브의 약 1 m 추가 업스트림의 슬라이드 (선호 거품 트랩)이 슬라이드에 도달 하는 모든 미디어는 정확한 온도에 있을 것입니다 보장으로 현미경 인큐베이션 챔버 내를.</li>
		<li>장소 슬라이드 선호 챔버 내부에 부 화는 실험 동안에 가능한 합리적으로 가깝게 거품 트랩 (거품 튜브 벽을 따라 종종 폼); 그러나, 명심 해야 작동 하는 진공에 연결.</li>
		<li>FB와 0.2 µ m 일회용 필터는 약 0.5 m 사이의 배관을 확인 합니다.</li>
		<li>추가 각 미디어 플라스 크에 약 2 cm 자기 저 어 바.</li>
		<li>차단 밸브 (hemostats를 사용할 수 있습니다) 역할을 튜브 클램프의 일종을 얻을.</li>
		<li>사용의 용이성, 멸 바구니에 흐름 장치를 계속. 그것은 녹색 사이드와 오렌지 사이드의 쉬운 별거를 허용 하는 큰 하나에 두 번째 작은 바구니를가지고 유용할 수 있습니다.</li>
		<li>4 m m 드릴 비트를 사용 하 여 첨부 파일 플라스 크에 대 한 열 프로브 (다른 구멍을 통해 갈 수 없습니다 돌)에 맞게 고무 마 개에 여분의 구멍을 드릴 합니다. 포트를 통해 튜브를 얻으려면 배관을 통해 밀어 핀셋; 일단, 장소, 그리고 핀셋 다시 밖으로 당겨에 게 튜브 클램프. 참고: 고무 마 개에 여분의 구멍을 추가 불가능, 4-포트 나사 모자와 함께 넓은 입 나사 병 플라스 크 및 고무 스 토퍼 대신 작동 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 흐름 시스템은 완벽 하 게 조립 되었습니다, 모두 녹색과 주황색 쪽 성장 플라스 크의 밸브를 닫습니다. 첨부 파일 플라스 크 튜브와 졸업된 실린더 물을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 연동 펌프를 보정.</li>
</ol>2. 실험 수행
<ol><li>실험, 전날 미리 현미경 인큐베이션 챔버 37 ° C에 난방 시작 하 고 준비 하는 곰 팡이 긴장의 숙박 문화 (형광 필요 하지 않습니다).</li>
	<li>단일 사용 하 여 구성 요소 및 펌프, 수집 하 고 살 균 biosafety 내각 장소.</li>
	<li>거품 트랩 제거 온도 흐름 장치에서 조사 하 고 biosafety 내각에 배치 합니다.</li>
	<li>Detangle 하 고 필요한 경우는 튜브를 구성.</li>
	<li>고압 무 균; 되도록 30 분 저 어 바를 포함 하 여 흐름 장치 완료 되 면, 캐비닛 biosafety 전송.</li>
	<li>그림 1에서처럼 거품 트랩, 온도 프로브, 및 (슬라이드)를 제외 하 고 모든 단일 사용 구성 요소를 연결 합니다.<ol>
<li>0.2 µ m 필터 (그림 1, 11)에서 "어댑터"로 그것을 만들기 위해 1 mL 주사기 플런저를 제거 합니다. 이 끝으로 FB에서 튜브를 강제 하 고 성장 플라스 크에 지도 하는 튜브를 0.2 µ m 필터를 연결 합니다.</li>
		<li>이 수 시스템에 공기 누출을 방지, 그것을 연결 하기 전에 슬라이드 어댑터 (내부에 어떤 그리스를 받을 수 없습니다 돌)의 바바라 주위 실리콘 진공 그리스를 적용 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1% (w/v) 효 모 추출 물, 2% (w/v) 펩, 및 2% (w/v) 포도 당 (YPD), 100 mL와 함께 첨부 파일 플라스 크와 YPD의 200 mL와 함께 성장 플라스 크를 채우기. 녹색 측면 튜브 각 플라스 크에 미디어에 도달 하면 확인 하십시오.</li>
	<li>모든 밸브가 열려 있는지 확인 합니다. 진공, 거품 트랩을 부착 하 고 녹색 측면 튜브에 펌프를 연결 거품 트랩의 다운스트림.</li>
	<li>완전히 녹색 측면을 작성, 분배 그리고 밀리 리터의 처음 몇은 종종 죽은 세포 또는 무작위 파편을 포함 하기 때문에 미디어의 약 1-2 mL를 삭제를 3.3 mL/min의 유량에 액체 펌프. 튜브의 녹색 측면 미디어, 가득, 진행 하기 전에 거품의 하류 없는 거품 있다 확인 하십시오.</li>
	<li>거품을 소개 하도록 하지 YPD에 채워 채널 슬라이드와 저수지.</li>
	<li>버퍼를 만들려면 약 0.5 m의 오렌지 쪽에 더 많은 유체 흐름 장치 및 펌프를 슬라이드를 연결 합니다. 이것은 트랩 공기 역류 경우 슬라이드에서 실수로 방지 하입니다.</li>
	<li>현미경을 전송에 대 한 흐름 장치 준비: 클램프 폐쇄 입구와 출구 거품 트랩, 그리고 녹색과 오렌지 사이드 첨부 플라스 크 밸브 폐쇄 클램프의. 압력가 마로 소독 하는 동안 불지 수로 PD와 FB 나사 뚜껑 꽉 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>쉽게 전송 하기 위해 배관에서 펌프를 분리 합니다. 다음 현미경 근처 보조 용기에 열판 활동가 포함 하 여 모든 구성 요소를 이동 합니다.</li>
	<li>이미징에 대 한 흐름 장치를 준비 합니다.<ol>
<li>열판 교 반기를 온도 프로브를 연결 하 고 37 ° c 첨부 플라스 크를가 열 시작 300 rpm에서 미디어를 저 어 하 고이 모든 실험에 대 한 유지.</li>
		<li>현미경에 슬라이드를 탑재 하 고 단단히 그것을 확보 하기 위해 필요한 경우 테이프를 사용 합니다.</li>
		<li>진공 거품 트랩을 연결 (할 실행 취소 하지 클램프 아직).</li>
		<li>그림 1에 표시 된 위치에서 흐름 장치에 펌프를 연결 합니다.</li>
		<li>3.3 mL/min의 유량에 펌프를 시작 하 고 약 5-10 s, 실행할 수 있도록 다음 거품 트랩 입구/출구 클램프를 제거 합니다.</li>
		<li>첨부 파일 플라스 크가 열 하는 동안 계속 해 서 펌프를 수 있습니다. 일단 미디어 흐름 시스템을 통해 유포 하고있다, 정상 작동 확인 합니다.<ol>
<li>공기에 누출에 대 한 피팅 확인 업스트림 펌프 (일부 거품 형성은 정상 임), 또는 하류 밖으로 유출 하는 액체의.</li>
			<li>성장 미디어 플라스 크, PD, FB는 모든 떨어지는 미디어 입구 관에서 (해당 되는 경우,이 막힌된 필터 또는 조이면된 귀 클램프를 나타낼 수 있습니다) 확인 합니다.</li>
			<li>현미경을 사용 하 여 채널에 연결 된 또는 롤링 셀 확인 합니다. 세포의 과도 한 수 설정, 동안 오염 나타낼 수 있습니다 또는 교체 요구는 거품의 소계 (PTFE) 멤브레인 함정.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>일단 첨부 파일 플라스 크와 배양 챔버는 37 ° C에서 둘 다, 1 x 106 셀/mL까지 첨부 플라스 크에 곰 팡이 세포의 충분 한 숙박 문화를 추가 합니다. 참고: 볼륨 µ L에 추가을 계산할 수 있습니다이 수식을 사용 하 여: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58457/58457eq1.jpg"></li>
	<li>적응을 셀 수 있도록 15 분 기다립니다.</li>
	<li>셀의 흐름을 시작 하 두 성장 플라스 크 밸브를 닫는 동안 모두 녹색과 주황색 쪽 첨부 파일 플라스 크 밸브를 엽니다.</li>
	<li>셀 슬라이드에 연결할 수 있도록 약 5 분을 기다립니다 고 (이 이번 녹색 측면 튜브의 길이 따라 조정 해야 할 수도 있습니다) 현미경의 초기 초점 허용 합니다. 이 시간 동안 현미경 이전 실험에 사용 된 동일한 이미지 매개 변수를 조정 합니다. 첫 번째 실행 인 경우 다음이 단계를 따르십시오.<ol>
<li>낮은 확대 공기 목적으로 전환 합니다.</li>
		<li>찾기 및 연결 된 셀 또는 작은 신진 셀에 초점.</li>
		<li>쾰러 조명에 대 한 콘덴서 구성 다음 darkfield를 전환 합니다.</li>
		<li>300 ms 노출 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>작은 셀 희미 한 아직 배경 (신진 딸 셀 배경 비율이 약 7-8의 신호는 합리적인 값)에 대 한 명확 하 게 표시 될 때까지 조명 강도 조정 합니다. 참고/마크 미래 실험을 위한 조명 강도.</li>
		<li>이미지 마다 2 분 이상 2 시간을 취득 하는 소프트웨어를 구성 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>첨부 파일 단계에 대 한 이미지 수집을 시작 합니다. 약 5 후 다시 확인 하 고 초점을 보장 하기 위해 10 분 유지 되었습니다. 그렇지 않은 경우에 다음 이미지를 획득 한 후에 즉시 초점을 조정 하려고.</li>
	<li>첨부 파일 단계 완료 된 후에 즉시 파일을 저장 한 다음 두 첨부 파일 플라스 크 밸브를 닫는 동안 모두 녹색과 주황색 쪽 성장 플라스 크 밸브를 엽니다. 알아서 하지 어떤 밸브는 챔버 내부에 부 화 하는 경우 단계를 범프.</li>
	<li>열판 교 반기에서 온도계 프로브를 분리 합니다.</li>
	<li>열판 교 반기에서 첨부 파일 플라스 크를 제거 하 고 그 자리에 성장 플라스 크를 놓습니다.</li>
	<li>이미지 마다 15 분 이상 22 h 고 성장 단계에 대 한 이미지 수집을 시작 하는 소프트웨어를 구성 합니다. 다시 초점 해서는 안 필요, 하지만 몇 시간 후 흐름 장치를 확인 하기 좋습니다.<ol>
<li>공기에 누출에 대 한 피팅 확인 펌프 (다시 일부 거품 형성은 정상), 또는 하류 밖으로 유출 하는 액체의 업스트림</li>
		<li>확인 성장 미디어 플라스 크, PD, FB는 모두 떨어지는 미디어 (해당 되는 경우,이 막힌된 필터, 조이면된 귀 클램프 또는 가시 피팅 셀 사용 되 고 flocculate 하는 경우에 덩어리를 나타낼 수 있습니다).</li>
		<li>FB에 액체 수준을 확인 합니다. 미디어 병 (이상 필터의 상단 위에 1.5 cm)의 상단에 도달 하면 (할 하지 느슨하게이 플라스 크 압력으로) 두 screwcaps를 조입니다. 그들은 더 강화 하지 것입니다, 계속 실험 (비록이 누수에서 될 수 있습니다), 다음 청소 후 PD와 FB에 고무 가스 켓을 교체 하 고.</li>
	</ol></li>
	<li>성장 단계 취득 완료 되 면, 파일을 저장 한 다음 오렌지 측에는 압력 해제로 소음을 만들 수 있습니다 녹색 및 주황색 첨부 플라스 크 밸브를 엽니다. 그들은 미디어 위에 적어도 몇 센티미터까지 모두 미디어 플라스 크에서 오는 녹색 측 배관에 올려. 훨씬 더 쉽게 청소 하 게 배관에서 모든 미디어를 제거 하는 고속 (약 100 mL/min 또는 펌프에 빨리 감기 버튼을 길게) 펌프를 실행 합니다. 비운, 흐름 장치는 펌프에서 분리 하 고 현미경에서 그것을 제거.</li>
</ol>3. 깨끗 한 흐름 장비
<ol><li>(단일 사용 구성 요소, 거품 트랩 및 온도 프로브), 모든 비 멸 구성 요소를 제거 하 고 압력솥 30 분 삭제에 대 한 흐름 장치 단일 사용 구성 요소, 70% 에탄올으로 깨끗 한 프로브를 사용 하 고 거품 트랩을 따로.</li>
	<li>압력가 마로 소독 완료 후 미디어, 폐기 린스 하 고 미디어 플라스 크를 따로 설정. 거품 트랩에 다시 연결, ibidi 채널 슬라이드 (재사용), 청소 하는 데 사용할 고 그림 1에 표시 된 위치에 펌프에 흐름 시스템을 연결.</li>
	<li>클램프는 오렌지 사이드 성장 플라스 크 밸브를 폐쇄.</li>
	<li>비 커에 undiluted 백제의 약 200 mL를 놓습니다. 표 백제, 고무 마 개를 삽입 하 고 순환 흐름 장치 (를 제외 하 고 모든 필터)에 걸쳐 표 백제를 높은 속도에서 펌프를 시작 합니다. 표 백제로 가득, 일단 착용 하 고 휴식 튜브는 고속에 펌프를 떠나 있기 때문에 펌프를 중지 합니다.</li>
	<li>15 분 동안 표백 후 비 커 위에 고무 마 개를 누른 펌프 흐름 장치에서 제거 하는 표 백제를 다시 시작 합니다.</li>
	<li>3.4와 3.5 흐름 시스템을 씻어 표 백제 대신 초과 물으로 두 번 단계를 반복 합니다. 이 시간 동안 다른 청소 요원 부식 또는 필터를 방해할 것 이기 때문에 물으로만 필터를 청소.<ol>
<li>일반적으로 연결할 것 (2 µ m FB에서에서 오는) 0.2 µ m 미디어 필터 고무 마 개와 비 커 물으로 단계 3.6에서에서 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>당길 수 있다 일반적으로 떨어져 쉽게 귀 클램프에도 불구 하 고 20 µ m 인라인 필터의 입구에 연결 된 튜브를 분리 합니다.</li>
		<li>진공 필터 플라스 크 및 예비 3 구멍 마 개를 통해 튜브의 긴 단면도 사용 하 여 흐름 장치에 연결할 수 있는 진공 시스템을 만들.</li>
		<li>20 µ m 필터 입구의 입구에이 진공 시스템을 연결 하 고 진공; 시작 이 죽은 세포를 제거 하는 반대 방향에서 필터를 통해 물을 끌어.</li>
		<li>필터를 다음 제거 물 필터 라인을 물에서 튜브를 통해 물 풀 적어도 200 mL.</li>
		<li>20 µ m 필터에서 진공 시스템을 분리 하 고 필터는 일반 튜브를 다시 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 측정 동영상
참고: 모든 파일 작업 태그 이미지 파일 (TIF) 형식으로 변환 해야 합니다. 또한, 실험 사이 비교, 그것은 중요 한 모든 이미지 같은 현미경 및 이미징 매개 변수와 함께 찍은 위에서 설명한 대로.
<ol><li>다운로드 및 아직 설치 하지 않은 경우 ImageJ를 설치.</li>
	<li>추가 매크로 파일을 다운로드 하 고 ImageJ\macros 폴더에.</li>
	<li>제공 된 매크로 조정:<ol>
<li>ImageJ에 이전 실험에서 이미지 스택을 열고 세포 존재와 시간 점을 선택 합니다.</li>
		<li>를 통해 메뉴에서 선택 "이미지 | 유형 | 8 비트 ".</li>
		<li>를 통해 메뉴에서 선택 "이미지 | 조정 | 임계값". "어두운 배경" 확인란을 선택 합니다. 빨강 오른쪽 드롭다운 메뉴를 설정 합니다.</li>
		<li>모든 셀은 빨간색 (일부 비-셀 speckling 괜 찮 아 요 및 매크로 의해 처리 될 것 이다) 최소한의 초과 잡음으로 덮여 때까지 낮은 값을 조정 합니다. 이 더 낮은 가치를 적어 둡니다.</li>
		<li>임계값 창 및 오픈 이미지를 닫습니다.</li>
		<li>를 통해 메뉴에서 선택 "플러그인 | 매크로 | 편집". 파일을 열 것인지 묻는 메시지가 나타나면: "한 폴더 수준 위로 이동", 다음 매크로 폴더를 선택 하 고 흐름 biofilm 정량화 매크로 파일을 엽니다.</li>
		<li>15 "setThreshold (15, 255);" 의 모든 인스턴스 값 단계 4.3.4에서에서 결정 하는 값을 변경 합니다. 파일을 저장 하 고이 창을 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>통해 메뉴에서 선택 "플러그인 | 매크로 | "설치 하 고 선택 흐름 biofilm 정량화 파일.</li>
	<li>이제는 에서 "플러그인 | 매크로" 메뉴, 다양 한 비디오 quantifications에 대 한 6 개의 새로운 옵션이 나타납니다. 완전 한 분석 을 실행 하 고 첨부 파일 및 성장 비디오 파일 수집 된 데이터에서 모든 사용할 수 있는 분석을 수행 하 고 자동으로 출력 파일을 생성 하 라는 메시지가 나타나면 선택 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

흐름 시스템을 사용 하 여 위에서 설명한 대로 균 biofilm 성장과 개발의 양적 시간 경과 비디오의 생성에 대 한 수 있습니다. 비교 실험에 대 한 수 있도록 그것 이미징 매개 변수는 같은 유지 되도록 중요 한 중요성 이다. 현미경 (많은 가이드 온라인 사용할 수 있습니다이 프로세스에 대 한) 각 실험에 대 한 쾰러 조명에 대 한 설정 되어 보장 포함 됩니다. 매개 변수, 이미징 제외 흐름 장치를 작업할 때 마음에 계속 몇 가지 중요 한 단계 있다. 첫째, 이렇게 하지 않으면 공기 거품 트랩을 통해 끌려가고 이어질 것으로 거품 트랩은 유체 흐름, 중 진공에서 유지 되도록 중요 하다. 마찬가지로, 거품 트랩 진공 (즉, 흐름 장치를 운반 하는 경우)에 포함 되지 않은 경우 입구와 출구 있어야 채워 종료; 그렇지 않으면 공기에서 PTFE 멤브레인을 통해 누수 됩니다. 이 클램프 거품 트랩은 다시 한번 진공에서 배치 될 때까지 제거 될 필요가 없습니다. 마지막으로, 그것은 잠재적인 방해물 또는 누출에 대 한 흐름 ...

Candida albicans (C. albicans)은 인간의 많은 조직 유형, 구강 점 막 표면을 포함 하 여, oropharyngeal 칸디 다 증을 일으키는 원인이 되 고 영향을 받는 개인1대 한 생명의 낮은 품질의 결과 감염 시킬 수 있는 기회 곰 팡이 병원 체 이다. C. albicans의 병 인에 대 한 중요 한 특성은 Biofilm 형성 및 형성과 C. albicans biofilms2,3,4,의 기능에 다 수의 연구 수행 되었습니다. 5, 생체 외에서 정적 (흐름)를 사용 하 여 실시 되어 많은 모델. 그러나, C. albicans 는 준수 하 고 구강에 타 액 흐름의 면 전에 서 성장 해야 합니다. 수많은 흐름 시스템 라이브 셀 이미징6,7,8,,910수 있도록 개발 되었습니다. 이러한 다른 흐름 시스템 다른 목적을 위해 설계 되었습니다 그리고 그러므로 각 시스템에 서로 다른 강점과 약점. 우리는 C. albicans 에 대 한 적절 한 시스템 흐름의 많은 비용이 많이 드는 했다, 필요한 복잡 한 부품, 조작 또는 하지 될 수 흐름 중 몇 군데와 이미징 이전 중지 했다 발견. 따라서, 우리는 흐름 제11 C. albicans biofilm 형성 연구에 새로운 흐름 장치를 개발 했다. 우리의 흐름 장치 설계, 동안 우리는 이러한 주요 고려 사항을 따라. 첫째, 우리 biofilm 성장과 발전의 여러 측면을 계량 수 싶 었 어 요 (수 있도록 우리 연구 돌연변이 체 긴장 및 수정 되지 않은 임상 분리를 쉽게) 형광 세포의 사용을 요구 하지 않고 실시간. 둘째, 우리가 원하는 모든 부분을 거의 수정 없이 상업적으로 사용할 수 (즉., 아니 주문 제작), 다른 더 쉽게 우리의 시스템을 다시 만들 수 있도록 하 고 쉽게 수리에 대 한 허용. 셋째, 우리 또한 하 고 싶 었 확장 수 있도록 합리적으로 높은 흐름 율에 이미징. 마지막으로, 우리 싶어, 흐름, 아래 기판에 연결 하는 셀의 기간 뒤에 새로운 셀을 도입 하지 않고 오랜된 시간 동안 biofilm 성장을 모니터 할 수 있을.
이러한 고려 사항 지도 그림 1에 나와 있는 2 플라스 크 반복 흐름 시스템을 개발 했다. 두 개의 플라스 크 2 단계, 셀 시드 첨부 플라스 크에서 그리는 첨부 파일 단계와 성장 단계를 사용 하 여 셀 무료 미디어 새로운 셀의 추가 없이 biofilm 성장을 계속 실험을 분할 수 있습니다. 이 시스템은 앞 (2 ~ 5, 그림 1), 인큐베이터 안에 배치 되 고 튜브 슬라이드와 현미경에 대 한 보육 챔버와 함께 작동 하도록 설계 하 고 밖에 서 큰 보조 컨테이너에서 다른 모든 구성 요소 배치는 현미경입니다. 또한, 연결 된 온도 프로브 열판 활동가 37 ° c.에 첨부 플라스 크에 균 세포를 유지 하기 위해 사용 됩니다. 재순환은이 시스템은 지속적인 영상 흐름 (36 h 이상의 조건에 따라 일 수 있다), 중 고 직 립 또는 거꾸로 벤치탑 현미경을 포함 하 여 대부분의 표준 현미경에 사용 될 수 있습니다. 여기, 우리 어셈블리, 작업, 토론 고 흐름 기구의 청소 뿐만 몇 가지 기본적인 ImageJ 양적 알고리즘 실험 후 비디오 분석을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>펌프</td><td>Cole Parmer</td><td>07522-20</td><td>6</td></tr><tr><td>펌프 헤드</td><td>Cole Parmer</td><td>77200-60</td><td>6</td></tr><tr><td>튜빙</td><td>Cole Parmer</td><td>96410-14</td><td>N / A</td></tr><tr><td>버블 트랩 어댑터</td><td>Cole Parmer</td><td>30704-84</td><td>3</td></tr><tr><td>1/4 용 버블 트랩 진공 어댑터 ID 진공 라인</td><td>Cole Parmer</td><td>31500-55</td><td>3</td></tr><tr><td>인라인 필터 어댑터(4개 필요)</td><td>Cole Parmer</td><td>31209-40</td><td>8,9</td></tr><tr><td>주황색 측면 Y</td><td>Cole Parmer</td><td>31209-55</td><td>7</td></tr><tr><td>Green-side Y</td><td>ibidi</td><td>10827</td><td>2</td></tr><tr><td>* 슬라이드</td><td>ibidi</td><td>80196</td><td>4</td></tr><tr><td>* 슬라이드 luers</td><td>ibidi</td><td>10802</td><td>4</td></tr><tr><td>진공 보조 버블 트랩</td><td>Elveflow/Darwin 미세유체학</td>, <td>KBTLarge - 미세유체 버블 트랩 키트</td>, <td>3</td></tr><tr><td>미디어 플라스크,</td><td>Corning</td><td>4980-500</td><td>1</td></tr>, <tr><td>0.2 &micro; m 에어 필터</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>1</td></tr><tr><td>PD 및 필터 플라스크용 나사산 유리병(2개 필요)</td><td>Corning</td><td>1395-100</td><td>5,10</td></tr><tr><td>PD 및 필터 플라스크용 포트 나사 캡(2개 필요)</td><td>Wheaton</td><td>1129750</td><td>5,10</td></tr><tr><td>스크류캡 튜빙 커넥터</td><td>Wheaton</td><td>1129814</td><td>5,10</td></tr><tr><td>튜빙 커넥터 비스듬한 와셔</td><td>Danco</td><td>88579</td><td>5,10</td></tr><tr><td>튜빙 커넥터 플랫 와셔</td><td>Danco</td><td>88569</td><td>5,10</td></tr><tr><td>인라인 필터 및 다운스트림 Y용 클램프(7개 필요)</td><td>Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td><td>15100002-100</td><td>7,8,9</td></tr><tr><td>클램프 도구</td><td>Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td><td>14100386</td><td>N/A</td></tr><tr><td>20 &mu; m 인라인 매체 필터</td><td>분석 과학 기기</td><td>850-1331</td><td>8</td></tr><tr><td>10 &mu; m 인라인 매체 필터</td><td>분석 과학 기기</td><td>850-1333</td><td>9</td></tr><tr><td>2 &mu; m 입구 매체 필터</td><td>Supelco/Sigma-Aldrich</td><td>58267</td><td>10</td></tr><tr><td>* 0.22 &micro; m 매체 필터</td><td>Millipore SVGV010RS</td><td></td><td>11</td></tr><tr><td>* 0.22 &micro; M 미디어 필터 " 어댑터"</td><td>BD Biosciences</td><td>329654</td><td>11</td></tr><tr><td>고무 마개</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>외부 프로브 포트가 있는 1 핫플레이트 교반기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88880006</td><td>N/A</td></tr><tr><td>온도 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88880147</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 biofilm 개발의 정량화

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Oropharyngeal 칸디 다에서 칸디 다 속의 멤버 준수 하 고 침 흐름의 영향 아래 구두 점 막 표면에 성장 해야 합니다. 흐름에서 성장에 대 한 모델을 개발 하는 동안 이러한 시스템의 대부분, 또는 이미징 동안 셀 흐름에서 허용 하지 않습니다. 우리는 우리가 성장과 개발 흐름에서 실시간으로 칸디 다 albicans 셀의 이미지를 새로운 기구를 개발 했습니다. 여기, 우리 선발 어셈블리 및이 흐름 장치의 사용 뿐만 아니라 생성 되는 데이터의 정량화에 대 한 프로토콜. 우리 세포를 연결 하 고 슬라이드 뿐만 아니라 슬라이드에 바이오 매스의 측정 시간이 지남에 확인할에서 분리 속도 정할 수 있습니다. 이 시스템은 경제적이 고 다재 다능 한, 저렴 한 벤치탑 현미경를 포함 하 여 가벼운 현미경의 많은 종류 및 수 있는 확장 이미징 다른 흐름 시스템에 비해 시간. 전반적으로, 이것은 낮은 처리량 시스템 biofilm 성장의 흐름에서 곰 팡이 종에 매우 상세한 실시간 정보를 제공할 수 있는.

보통의 대표 이미지 하룻밤 시간 경과 실험 야생-타입 C. albicans 를 사용 하 여 셀 37 ° C에서 볼 수 있습니다 그림 2A 에 추가 동영상 1. 이미지 대비 가시성 향상을 향상 되었습니다. 원래 데이터의 정량화를 수행 하 고 대표적인 그래프 그림 2B에서 볼 수 있습니다. 이러한 그래프를 생성 하려면 데이터 했다 처음으로 정규화 된 이미징 영역 (즉, 이미징 영역 전체로 나눈 값), 그리고 위에서 설명한 대로 분리 추가 바이오 매스를 정규화 되었는지. 또한, 첨부 파일 및 분리 흐름 biofilm 정량화 매크로 의해 생성 된 개별 프레임 값 보다는 시간에 누적 값을 표시. 그래프에는이 단계에 도달 했습니다, 일단 통계적 비교는 회...

어셈블리, 동작, 설명 그리고 흐름에서 실시간으로에서 이미지 균 biofilm 형성 하도록 설계 흐름 기구의 청소. 우리는 또한 제공 하 고 인수 이미지에 사용할 수 양적 알고리즘 토론.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

이 방법은 유체 흐름이 곰팡이 생물막 의 성장 및 발달을 어떻게 변화시키는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 실시간으로 생물 막 의 성장과 개발에 대한 흐름의 효과를 정량적으로 평가 할 수 있다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 흐름 장치의 어셈블리로 이 실험을 시작합니다.실험 당일, 버블 트랩, 온도 프로브 및 모든 일회용 구성 요소를 부착합니다. 필터를 조립하려면 플런저를 1밀리리터 주사기에서 제거하여 어댑터로 만듭니다. 필터 병에서 튜브를 이 끝으로 강제로 넣고 2미크론 필터를 튜빙에 부착하여 성장 플라스크로 이어집니다.이를 통해 시스템에 공기 누출을 방지하는 데 도움이 되기 때문에 슬라이드 어댑터의 바브 주위에 실리콘 진공 그리스를 적용합니다. 첨부 파일 플라스크를 YPD의 100 밀리리터로 채우고, YPD의 200 밀리리터로 성장 플라스크를 채웁니다. 녹색 측면 튜브가 각 플라스크의 미디어에 도달하도록 합니다.모든 밸브가 열려 있는지 확인합니다. 버블 트랩을 진공에 부착하고 펌프를 버블 트랩의 하류에 있는 녹색 측면에 연결합니다. 유체를 분당 3.3 밀리리터의 유량으로 펌핑하여 녹색 측면을 완전히 채웁니다.그런 다음, 분배하고 매체의 약 1 ~ 2 밀리리터를 폐기, 밀리리터의 처음 몇 종종 죽은 세포 또는 임의의 파편을 포함하기 때문에. 튜브의 녹색 면이 미디어로 채워지고 진행하기 전에 거품 트랩의 하류에 거품이 없는지 확인합니다. 거품을 소개하지 않도록주의, YPD와 채널 슬라이드와 저수지를 채웁니다.슬라이드를 유량 장치에 연결합니다. 그런 다음 더 많은 유체를 펌핑하여 주황색 면에 약 5 미터의 버퍼를 만듭니다. 이는 역류 시 슬라이드에 실수로 공기를 포획하는 것을 방지하기 위한 것입니다.이제, 먼저 버블 트랩의 입구와 출구를 심어 현미경으로 수송하기 위한 유동 장치를 닫은다. 그런 다음 녹색과 주황색 측 부착 플라스크 밸브를 닫습니다. 자동 도금 중에 느슨해질 수 있기 때문에 맥동 댐퍼 및 필터 병에 대한 나사 캡이 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.튜브에서 펌프를 분리하여 운반을 더 쉽게 만듭니다. 그런 다음 핫 플레이트 교반기를 포함한 모든 구성 요소를 현미경 근처의 보조 용기로 이동합니다. 온도 프로브를 핫 플레이트 교반기에 부착하고 부착 플라스크를 섭씨 37도로 가열하기 시작합니다.300 RPM에서 미디어를 저어 전체 실험에 대해 이를 유지합니다. 현미경에 슬라이드를 장착하고 필요한 경우 테이프를 사용하여 단단히 고정하십시오. 그런 다음 버블 트랩을 진공에 부착합니다.이제 펌프를 유량 장치에 연결합니다. 분당 3.3 밀리리터의 유속도로 펌프를 시작하고 약 5~10초 동안 작동할 수 있습니다. 그런 다음, 렛 아웃 뚜껑 일족에 거품 트랩을 제거합니다.부착 플라스크가 가열되는 동안 펌프가 계속 실행되도록 합니다. 부착 플라스크와 인큐베이션 챔버가 모두 섭씨 37도에 도달하면, 글리리터 당 백만 세포에 도달하기 위해 부착 플라스크에 곰팡이 세포의 충분한 하룻밤 문화를 추가합니다. 세포가 적응할 수 있도록 15분 간 기다립니다.녹색과 주황색 측 부착 플라스크 밸브를 모두 열고 성장 플라스크 밸브를 모두 닫아 세포의 흐름을 시작합니다. 셀이 슬라이드에 도달할 수 있도록 약 5분 정도 기다립니다. 이 시간 동안 현미경에 초점을 맞추고 이전 실험에서 사용되는 동일한 이미징 매개 변수로 조정합니다.첨부 파일 단계에 대한 이미지 수집을 시작합니다. 약 5분 과 10분 후에 다시 확인하여 포커스가 유지되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 다음 이미지를 획득한 직후에 포커스를 조정해 보려고 시도합니다.첨부 파일 단계가 완료된 직후 파일을 저장합니다. 그런 다음 녹색과 주황색 측면 성장 플라스크 밸브를 모두 열고 부착 플라스크 밸브를 모두 닫습니다. 배양실 내부에 밸브가 있으면 스테이지를 부딪히지 않도록 주의하십시오.온도계 프로브의 플러그를 뽑고 부착 플라스크를 성장 플라스크로 교체합니다. 이제 소프트웨어를 구성하여 22시간 동안 15분마다 이미지를 획득하고 성장 단계에 대한 이미지 수집을 시작합니다. 성장 단계 수집이 완료되고 파일이 저장되면 녹색 및 주황색 측면 부착 플라스크 밸브를 열어 주황색 측의 압력이 해제될 때 소음을 낼 수 있습니다.두 미디어 플라스크에서 나오는 녹색 측면 튜브를 끌어 올려 미디어보다 적어도 몇 센티미터 가 될 때까지. 그런 다음 펌프를 고속으로 실행하여 튜브에서 모든 미디어를 제거하여 청소가 훨씬 쉬워집니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 비디오를 정량화합니다.이번 경과 암필드 현미경 비디오는 부착 단계 동안 기판 하류에 야생 형 칸디다 알비칸 세포의 부착을 보여주고, 바이오 필름 형성으로 이어지는 성장 단계 동안 후속 성장 및 개발이 뒤따랐다. 이들 비디오에서 데이터는 시간이 지남에 따라 세포 부착 및 분리 및 바이오매스의 비율을 분석할 수 있으며, 여기에 도시된 총 바이오매스는 밀도 분석에 의해 결정된 바와 같이 이미징 영역 내의 총 바이오매스이다. 세포 부착의 누적 속도와 시간이 지남에 따라 바이오 매스 분리%도 표시됩니다.이 절차를 시도하는 동안, 이것은 그들 사이에서 정량적 비교를 할 수 있기 때문에, 모든 실험에 걸쳐 동일한 화상 진찰 조건을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

real-time-imaging-quantification-fungal-biofilm-development-using-two

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

출처: Kurz, D. L. 외 다공성 매질에서 생체 클로깅을 연구하기 위한 마이크로플루이딕 플랫폼. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 바이오필름 형성을 연구하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 박테리아 현탁액이 마이크로채널에 주입된 후 바이오필름 현상을 위해 배양합니다. 그 후 유동을 재개하고, 압력 모니터링과 영상을 사용하여 시간에 따른 바이오필름 형성과 기공 폐쇄를 감지합니다.

바이오필름 형성 중 실시간 영상 및 압력 추적을 위한 마이크로유체 장치

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Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

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대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3D 광학 일관성 단층 촬영

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

배우세요 실시간 이미징 및 2단계 반복 흐름 시스템을 사용하여 곰팡이 바이오필름 발달을 정량화하는 방법을. 유체 흐름이 Candida albicans 바이오필름 성장에 미치는 영향을 실시간으로 평가하고 정량적 알고리즘으로 이미지 데이터를 분석합니다.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

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