사용 주위 온도 77 K에서 생물학 견본에서 전자 상자성 공명
2019년 1월 11일
전자 상자성 공명 (EPR) 분광학은 자유 래 디 칼을 측정 하는 명확한 방법입니다. 선택적 스핀 프로브를 사용 하 여 다른 세포질 격실에서 자유 래 디 칼의 검출에 대 한 수 있습니다. 우리는 치료, 저장 및 전송 EPR 측정용 샘플을 용이 하 게 하는 생물 학적 샘플을 수집 하는 실용적이 고 효율적인 방법을 제시.
Dysregulated redox 신호는 다양한 질병의 병인에 연루됩니다. 레독스 생물학의 연구는 다른 세포 및 조직 구획에 있는 반응성 산소 종의 정확한 검출을 요구합니다. EPR 분광법은 자유 라디칼을 명확하게 측정하는 유일한 방법입니다.
이 프로토콜은 EPR 분광법에 대한 생물학적 샘플의 처리 및 저장을 위한 실용적인 방법을 보여줍니다. 이러한 프로토콜은 두 개의 대표 모델에서 EPR 및 스핀 프로브의 사용을 보여 줍니다. 그들은 다른 생물학적 설정에서 활성 종을 평가하기 위해 적응 할 수 있지만.
실험의 설계와 샘플 처리는 재현성에 매우 중요합니다. 셀 밀도를 고려하고 적절한 시간 일치 제어를 보장하는 것이 좋습니다. 크렙스 헨셀라이트 버퍼 또는 KHB의 1밀리리터로 생 264.7 셀을 부드럽게 세척하는 것으로 시작합니다.
그리고 잘 당 DTPA의 100 마이크로밀로 보충 KHB의 500 마이크로 리터로 세포를 치료. 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제로 퇴각하려면 15마이크로리터의 수퍼옥사이드 디스뮤타제 스톡 또는 차량을 각 우물에 넣고 10분 동안 37도의 플레이트를 배치합니다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타스 전처리가 끝나면 12.5 마이크로리터 CMH와 125 마이크로몰라 PMA 작업 용액 125 마이크로리터를 적절한 웰에 추가하고 50분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
즉시 얼음에 접시를 놓고 얼음에 개별 1.5 밀리리터 튜브에 각 우물에서 버퍼를 수집합니다. 다음으로, 신선한 KHB 플러스 DTPA의 100 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 부드럽게 각 우물의 바닥에서 세포를 긁어. 그런 다음 파이펫팅으로 세포 현탁액을 다시 중단하고 세포를 얼음에 있는 개별 1.5 밀리리터 튜브로 옮기습니다.
실온에서 초옥화물 검출을 위해 먼저 한 버퍼 또는 셀 샘플의 50 마이크로리터를 모세관 튜브에 적재하고 튜브를 밀봉하십시오. 즉시 전자 파라기 공명, 또는 EPR, 분광기에 튜브를 배치하고 실온 측정을위한 EPR 획득 매개 변수를 설정합니다. 항상 컨트롤과 동일한 실험 조건에서 처리된 동일한 프로브 농도를 포함하는 버퍼의 빈 샘플을 테스트합니다.
켈빈 77도에서 초옥화물 검출을 위해 한 샘플의 150 마이크로리터를 한쪽 끝에 고무 스토퍼로 1~2인치 직선 폴리테트라플루오로로틸렌 또는 PTFE 튜브에 적재합니다. 두 번째 스토퍼로 튜브의 다른 쪽 끝을 밀봉하고 플래시액체 질소로 샘플을 동결. 그런 다음 스토퍼를 신속하게 제거하고 PTFE 튜브를 액체 질소 저장을 위해 라벨이 부착된 냉동고튜브에 놓습니다.
EPR 측정의 경우, EPR 분광기의 손가락 분해를 액체 질소로 채우고 액체 질소에 샘플을 포함하는 PTFE 튜브를 놓습니다. 손가락 분해를 EPR 분광기에 넣고 측정을 위한 EPR 획득 매개 변수를 77도 켈빈으로 설정합니다. 냉동 폐 조직에서 ROS 검출을 위해, 드라이 아이스에 조직을 배치하고 마른 얼음에 플래시 냉동 조직을 안정화하기 위해 핀셋을 사용합니다.
샘플을 15밀리그램 조각으로 자르고 1.5 밀리리터 튜브의 무게를 측정합니다. KHB플러스 DTPA 와 CMH 4마이크로리터 196마이크로리터를 샘플에 추가하고, 짧은 원심분리로 조직 단편을 펠릿화하기 전에 37도 의 수조에서 폐 샘플을 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 150 마이크로리터의 미세입자를 PTFE 튜브로 옮기기 전에 샘플을 얼음 위에 놓아 EPR 측정을 준비하여 플래시 동결을 준비합니다.
PMA로 자극된 원시 264.7 세포에서의 총 초옥화물 생산에 대한 평가는, PMA 처리 된 세포의 세포 현탁액 과 버퍼 모두에서 산화질소 농도가 유사하다는 것을 밝혀, 투과성 특성 및 스핀 프로브의 빠른 평형으로 인해. nitroxide 라디칼 신호는 PMA로 자극된 원시 264.7 세포에서 증가하며, 대조군 세포에 비해 세포가 불투과성 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제로 전처리된 세포에서는 증가하지 않습니다. PMA를 자극한 후 원시 264.7 세포에서 낮은 온도에서 얻은 니트로화물의 농도는 또한 실온 데이터와 일치하는 초옥화물 디스뮤타제의 존재에서 감쇠된다.
nitroxide 농도는 PBS 처리된 대조군과 비교하여, 블리오 마우스및 처리된 마우스의 혈액 및 기관지 정맥류 용액뿐만 아니라, 블레오 마우스와 부상당한 동물로부터 수확된 폐 조직 조각의 수퍼나츠 내에서 증가한다. 또한, 레트로 궤도 스핀 프로브 주입 후, 블로 마우스 및 처리된 동물은 대조군에 비해 더 높은 스핀 프로브 신호를 입증한다. 이러한 실용적인 프로토콜은 연구원이 저온 측정을 포함하여 EPR에 의한 다른 세포 구획 및 생물학적 샘플에서 자유 라디칼 생산을 테스트할 수 있게 합니다.
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개요
본 논문은 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance, EPR) 분광법을 위한 생물학적 시료의 수집 및 처리 방법에 대한 실무적인 방법을 제시합니다. EPR은 산화 환원 생물학에서 매우 중요한 자유 라디칼을 명확하게 측정할 수 있는 독보적인 기술입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 산화환원 생물학
- 전자 파라마그네틱 공명(EPR) 분광법
- 자유 라디칼 검출
배경
- 조절되지 않은 산화환원 신호전달은 다양한 질병과 연관되어 있습니다.
- 활성 산소종의 정확한 검출은 생물학적 연구에서 필수적입니다.
- EPR 분광법은 자유 라디칼을 명확하게 측정할 수 있는 유일한 방법입니다.
- 본 연구는 생물학적 시료의 처리 및 보관 프로토콜에 초점을 맞춥니다.
연구 목적
- EPR 분광법을 위한 시료 수집의 실용적인 방법을 제시한다.
- 생물학적 환경에서 선택적 스핀 프로브의 사용법을 설명한다.
- 다양한 생물학적 모델에 적용 가능한 프로토콜을 제공한다.
사용된 방법
- EPR 측정을 위한 생물학적 시료 수집.
- 유리 라디칼 검출을 위한 선택적 스핀 프로브의 사용.
- 시료 처리 및 보관 프로토콜.
- 대표적인 생물학적 모델에서의 방법론 적용.
주요 결과
- 본 프로토콜은 시료의 취급 및 보관을 효과적으로 용이하게 합니다.
- EPR 분광법은 자유 라디칼에 대한 신뢰할 수 있는 측정값을 제공합니다.
- 스핀 프로브는 다양한 생물학적 상황에 맞게 조정될 수 있습니다.
- 본 연구는 산화환원 생물학에서 EPR의 다재다능함을 입증합니다.
결론
- EPR 분광법은 자유 라디칼을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
- 정확한 측정을 위해서는 적절한 시료 처리가 매우 중요합니다.
- 제시된 방법들은 산화환원 생물학 연구를 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
반응성 산소종(ROS)의 정확한 검출은 질병 기전 내의 산화환원 신호 전달을 이해하고 표적을 검증하는 데 매우 중요합니다. 전자 상자성 공명(EPR) 분광법은 자유 라디칼을 명확하고 직접적으로 측정하여 초기 발굴 단계에서 기전적 리스크를 감소시킬 수 있게 합니다. 이 방법은 세포 및 조직 모델에서 구획별 ROS 정량을 가능하게 함으로써 예측 신뢰도를 높이며, 전임상 프로그램의 진행 여부(go/no-go) 결정에 유용한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 높은 특이도로 특정 ROS 종의 생리학적 수준을 검출함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 세포 투과성 프로브와 SOD 대조군을 사용하여 세포외 슈퍼옥사이드와 세포질 슈퍼옥사이드를 구분함으로써 경로 관여 여부를 명확히 합니다.
- 예측적 가치: 질환 관련 모델에서 구획별 정량적 슈퍼옥사이드 측정을 통해 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비: 표준화된 스핀 프로브 표지 및 시료 안정화를 통해 하위 워크플로를 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 재현성: 시료를 -80°C에서 보관하고 77 K에서 분석할 수 있게 하여, 배치 및 분석 장소에 관계없이 일관된 EPR 측정값을 보장합니다.
- 확장성: 동결 시료의 이동 및 재사용을 가능하게 하여 고처리량 스크리닝을 통한 신뢰성 있는 화합물 평가를 용이하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 손상 모델의 폐 조직, 혈액 및 기관지폐포 세척액에서 초과산화물을 검출하여 중개 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 전임상 연속성: 동일한 스핀 프로브 검출 전략(예: CPH, mito-TEMPO-H)을 통해 in vitro 연구 결과와 in vivo 모델을 연결합니다.
- 위험 조정 진행: 관련 병태생리학적 맥락에서 ROS 조절을 통한 타겟 결합을 확인하여 진행 결정에 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
EPR 분광법은 표적 검증부터 전임상 검증에 이르는 발견 연속체에 부합하며, 산화환원 신호 전달에 미치는 기전 기반 효과에 대한 직교적 확인을 제공합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 선택적 스핀 프로브와 효소 대조군을 사용하여 특정 세포 구획 내의 superoxide를 정량함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 재현 가능한 시료 준비 및 냉동 보관을 통해 분석 준비 상태를 제공하여, 화합물 라이브러리 전반에 걸쳐 일관된 자유 라디칼 판독이 가능하게 합니다.
- 분석(Analytics): superoxide 농도에 비례하는 정량적 nitroxide 신호를 생성하여, 조건 간 비교 및 용량-반응 평가를 가능하게 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 질환 모델의 수확된 조직 상층액 및 생체 시료에서 ROS를 검출함으로써, 발견 단계에서 전임상 검증 단계로의 연결을 돕습니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 다양한 치료 영역에 걸쳐 적용 가능한 재사용 가능한 redox 프로파일링 플랫폼을 구축하여, 중복적인 방법 개발을 줄여줍니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 명확한 자유 라디컬 검출을 통해 산화환원 경로 검증의 기전적 모호성을 줄여줍니다.
- 운용적 가치: 표준화된 스핀 프로브 키네틱스, 제어된 시료 처리 및 저온 측정 옵션을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 표적 매개 ROS 조절의 직접적인 증거를 제공함으로써 go/no-go 결정을 개선하고 후기 단계의 생물학적 탈락률을 낮춥니다.
- 포트폴리오 영향: 질병 관련 시스템에서 화합물의 기전적 충실도를 확인함으로써 위험 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 정확한 프로브 선택과 데이터 해석을 위해 EPR 분광법 및 스핀 프로브 화학에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 실온 및 77 K 측정 능력을 모두 갖춘 EPR 분광계의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 데이터 비교 가능성을 보장하기 위해 세포 밀도, 배양 시간 및 매칭된 대조군에 대한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.
- 프로브 전달 및 조직 처리와 관련하여 다양한 모델 시스템(예: 배양 세포 대 폐 조직)에 따른 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 극저온에서 안정적인 특수 튜브의 필요성과 스핀 프로브의 분해를 방지하기 위한 주의 깊은 취급을 포함한 실질적인 제한 사항이 따릅니다.
