Name: 마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 마우스 배아 줄기 세포에서 동종 재결합 이벤트를 식별하는 방법을 Southern 블롯과 PCR을 사용하여. 이 기술은 유전자 교체 마우스 모델 생성에 활용되며 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

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이 작품의 국가 자연과학 기초의 중국 (보조금 번호 31571432), 인간의 지방 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 2015JC3097), 그리고는 연구 재단의 교육 국의 호남 일반 프로그램에서 지원 받은 (보조금 번호 15 K 054) 지방, 중국.

1. 설계 대상으로의 Construct(s), 남쪽 오 점, 조사 및 PCR 위한 뇌관
<ol><li>녹아웃/노크-에서 보고 여기의 응용 프로그램에서 중단 또는 삽입에 대 한 Myh9 유전자의 첫 번째 코딩 exon (exon 2)를 선택 합니다.</li>
	<li>5 kb 업스트림 및 5 kb 다운스트림 DNA 시퀀스 Myh9 exon 2 genome.ucsc.edu 웹사이트에서 주변을 검색 합니다.</li>
	<li>남부 럽에 대 한 게놈 DNA를 소화 하기 위해 적당 한 RE(s)를 pDRAW 소프트웨어를 사용 하 여 제한 효소 (입술)이 10 kb 지역에서 1-2 컷으로의 소화 패턴 분석. 이 요구 사항을 충족 하 고 목적을 위해 선택에 Dra를 참고:</li>
	<li>즉각적인 4 조각을 선택 왼쪽된 상 동 팔 (LHA) 2와 1.7 kb 조각 즉각적인 다운스트림 시퀀스 오른쪽 상 동 팔 (RHA); Myh9 exon의 업스트림 1kb 단편 5' 상류 남부 럽 및 1.2 kb 조각 3' 하류 오른쪽 프로브 (RP)으로 나의 왼쪽된 프로브 (LP)으로 LHA의 위의 분석에 기반을 선택 합니다.</li>
	<li>Primer3 프로그램을 사용 하 여 PCR에 의해 그 4 개의 DNA 파편을 증폭에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관 디자인. 앞으로 뇌관 선택 마커 neomyocin 저항 유전자 (P1)의 3' 터미널 근처 거주와 나 (P2) 바로 외곽에 위치한 역 뇌관 뇌관 쌍을 디자인 합니다. 참고:이 뇌관 쌍 사용 됩니다 식별 대상된 ES 클론 PCR29에 의해.</li>
	<li>마우스 Myh9 유전자 소재 시 bacpac.chori.org 웹사이트를 방문 하 여 취재 129Sv BAC 클론 찾기 (참고: isogenic DNA는 선호). BAC DNA 정화는 제조업체에서 제공 하는 지침에 따라 DNA의 큰 조각에 대 한 적합 한 키트를 사용 하 여 격리 합니다. 참고: 순화 된 BAC DNA 사용 됩니다 템플릿으로 PCR 확대를 위한.</li>
	<li>대상 구문, 프로브, 및이 정보를 요약 하는 뇌관의 도식 적인 표현을 그립니다.</li>
</ol>2. 세대를 대상으로의 Construct(s) 및 남쪽 오 점, 그리고 PCR 위한 뇌관의 준비에 대 한 조사
<ol><li>위에서 설명한 PCR 뇌관을 주문 하 고 20 µ M의 농도에 그들을 분해.</li>
	<li>상 동 팔 1 µ L 앞으로 1 µ L 역 뇌관, BAC DNA의 1 µ L를 포함 하 여 반응 솔루션에서 프로브 PCR에 의해 증폭 (50 기) 템플릿, Pfu에 대 한 버퍼의 5 µ L, Pfu DNA 중 합 효소로 울트라 1 µ L H2O 최대 50 µ L. PCR 기계는 다음과 같은 조건에서 PCR을 수행: 95 ° C 3 분;에 대 한 95 ° C 30에 대 한 s; 60 ° C 30에 대 한 s; 72 ° C와 1 킬로바이트/분; 30 주기; 마지막으로, 72 ° C 10 분입니다.</li>
	<li>제조업체에서 제공 하는 프로토콜에 따라 PCR 대 청소 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 하 고 elute H2o. 다이제스트의 40 µ L로 DNA 파편 반응 솔루션 5 µ L 10 x 버퍼의 해상도 대 한 포함 된 미리 디자인 된 해상도 함께 정제 PCR 제품 2.5 µ L RE1 및 RE2, 그리고 실행 대상 DNA 밴드를 분리, 소비 세 대상 UV 빛에서 DNA 포함 하 젤 1 %DNA 젤 2 h. 위해 37 ° C에서 eluted DNA의 2.5 µ L의 정화는 DNA 젤 추출 키트 따라 사용 하 여 젤에서 대상 DNA 파편 프로토콜에는 제조업체에서 제공 하 고 H2o.의 40 µ L로 DNA 파편을 elute</li>
	<li>최종 대상으로 얻으려면는 증폭 하 고 정화 나, LHA, 및 대체 식 cassette(s) 다른 벡터에서 발표의 순서에 따라 mpNTKV LoxP 벡터에 상 동 팔, 대체 식 cassette(s) 복제 construct(s). T-간편한 벡터에 DNA 파편 증폭 및 순화 된 프로브의 클론.</li>
	<li>시퀀싱27,28여 모든 복제 된 DNA 파편의 뉴클레오티드 시퀀스를 확인 합니다.</li>
</ol>3. Construct(s), ES 세포, Electroporation 그리고 ES 클론의 증폭을 대상으로의 준비
<ol><li>제조업체에서 제공 하는 프로토콜에 따라 플라스 미드 maxiprep 키트를 사용 하 여 각 대상 건설을 준비 합니다. 내가 하지 내가, 내가의 10 µ L, 100 µ g의 DNA, 10 x 버퍼의 40 µ L을 포함 하 여 400 µ L 반응에서와 그것을 소화 하 여 각 구문 플라스 미드를 선형화 및 H2O 37 ° C에 400 µ L까지 하룻밤.</li>
	<li>선형화 대상 construct(s) 정화.<ol>
<li>추출 소화 반응 솔루션 1 x 페 놀: 클로 프롬: Isoamyl 알콜 (25:24:1)와 10 분 2000 x g 의 힘에 원심 분리기 같은 볼륨.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송, 에탄올과 0.1 x 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2) x 2.5 (볼륨 비율)를 사용 하 여 DNA를 침전 하 고 10 분 2000 x g 의 힘에 원심.</li>
		<li>표면에 뜨는, 세척 DNA 1 x 75% 에탄올의 1 mL와 함께 작은 고 2000 x g 5 분의 힘에 원심 분리 합니다.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 5 분 동안 DNA 펠 릿 건조.</li>
		<li>1 µ g / µ L의 최종 농도에서 살 균 트리 스-EDTA (테) 버퍼에서 선형화 DNA 펠 릿을 디졸브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 x 10 각 선형화 대상 구조물의 50 µ g7 ES 세포를 혼합. 320 V에서 electroporation와 250 µ F. 네오 저항 MEF 지류와 함께 요리에 electroporated ES 세포 접시.</li>
	<li>24 시간 후 400 µ g/mL G418와 200 µ M ganciclovir ES 세포 매체 전환 하 고 4-5 일 매일 매체 변화에 대 한 문화를 계속 합니다. 48-잘 접시에 약물 내성 ES 클론을 선택 합니다. 참고: 일반적으로, 4 개의 48-잘 접시 구조 당 사용 됩니다.</li>
	<li>48-잘 접시를 복제. 참고: 격판덮개의 1 세트는 cryopreserved, 그리고 다른 집합 게놈 DNA 준비를 위해 사용 됩니다.</li>
</ol>4. 게놈 DNAs 및 금지와 소화의 준비
<ol><li>사소한 수정 상업 키트 (genomic DNA 정제 키트)를 사용 하 여 ES 세포에서 gDNAs을 준비 합니다.<ol>
<li>ES 세포 배양에서 미디어를 제거 하 고 세포를 lyse를 웰 스에 직접 RNaseA를 포함 한 핵 세포 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다. 참고: 세포 lysate-80 ° C에 저장 하거나 즉시 치료 될 수 있습니다.</li>
		<li>피펫으로 완전 세포를 lyse 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 그들을 전송 하는 여러 번 왔다 갔다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 단백질 강 수 솔루션, 20에 대 한 적극적으로 소용돌이의 볼륨의 1 / 3 추가 s, 5 분 동안 얼음에 샘플을 진정 하 고 5 분 다른 깨끗 한 1.5 mL 튜브 contai에는 상쾌한 전송에 대 한 2000 x g 의 힘에 그 후, 원심 닝은 동등한 양의 소 프로 파 놀; 부드럽게 혼합 솔루션. (스레드-가닥 처럼 화이트는이 순간에 볼 수 있습니다.) 1 분 2000 x g 의 힘에 원심 그런 다음에 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
		<li>실내 온도, 1 분에 2000 x g 의 힘에 원심 분리기에서 gDNA 펠 릿의 70% 에탄올 1 mL와 함께 세척 하 고 발음은 상쾌한 신중 하 게, 다음, 건조 3 분 gDNA 펠 릿.</li>
		<li>DNA rehydration 솔루션의 100 µ L 함께 gDNAs를 녹이 고, 다음, 품 어 또는 4 ° C에서 65 ° C 1 h에서 하룻밤.</li>
		<li>2-8 ° c.에 gDNAs 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>다이제스트와 gDNAs 10 x 3 µ L를 혼합 하 여 30 µ L 소화 반응을 Dra I. 설정 다시 미리 버퍼 Dra에 대 한 난, 난, gDNAs/샘플, 및 H2O 10 µ g 30 µ L, 고 37 ° C에서 밤새 품 어 Dra의 3 µ L.</li>
	<li>DNA 젤, 5 µ L 소화 반응의 분석에 의해 소화의 완전성을 확인 하 고, 후속 단계에 대 한 DNA-로딩 버퍼 x 10의 3 µ L을 추가.</li>
</ol>5. 남부 럽 및 PCR 식별
<ol><li>남쪽 더 럽 히 심사<ol>
<li>전기 및 막에 의해 소화 gDNAs을 구분 합니다.<ol>
<li>Ethidium 평범한 사람 (EB)와 1 %agarose 전기 영동 젤을 준비 하 고 단계 4.3 및 1 kb 사다리에서 샘플 로드 달린 젤 낮은 전압 (30 ~ 40 V) 하룻밤.</li>
			<li>꺼내서 젤 전기 이동 법 후 DNA 젤 이미징 시스템 사진의 찍을. 소화와 분리 된 gDNAs 얼룩 같은 이미지를 표시 하는지 여부를 확인 합니다.</li>
			<li>실 온에서 20 분 동안 부드럽게 흔들어와 0.2 N HCl 솔루션 트레이에 젤을 담근 다.</li>
			<li>DNA 변성 시키기 솔루션 젤을 전송 하 고 실 온에서 20 분 동안 부드럽게 흔들어.</li>
			<li>젤 DNA 중화 솔루션으로 전환 하 고 실 온에서 20 분 동안 부드럽게 흔들어. 참고: 젤 이므로이 단계 후 파손 하는 경향이 그것을 신중 하 게 처리 해야 합니다.</li>
			<li>급속 한 하향 전송 시스템을 사용 하 여 막에 젤에서는 DNAs를 전송. TurboBlotter, 더 럽 히 스택 제조 업체에서 제공 하는 지침에 따라 조립. 참고: 10 배 또는 20 배 염 분-나트륨 시트르산 (SSC) 솔루션 전송 버퍼로 사용 됩니다. 일반적으로, 전송의 3 h는 젤에서 막; gDNAs의 95%를 전송 하기에 충분 한 그러나, 전송의 장시간 무해 하지 않습니다.</li>
			<li>막 밖으로가 고 2로 그것을 씻어 1 분, x SSC 조직, 액체를 흡수 하 고 다음 UV crosslinker를 사용 하 여 막과 DNA를 상호 링크. 참고: 막 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 주일 동안.</li>
		</ol>
</li>
		<li>방사능과 DNA 프로브를 레이블을 지정 합니다.<ol>
<li>제조업체에서 제공 하는 프로토콜에 따라 miniprep 키트를 사용 하 여 프로브 플라스 미드 정화.</li>
			<li>릴리스는 DNA 파편의 EcoR에 의해 플라스 미드 벡터에서 프로브 나 버퍼의 5 µ L를 포함 하 여 EcoR에 대 한 반응 솔루션에 소화 나, EcoR의 2 µ L 나 효소, 플라스 미드 DNA의 20 µ g 및 H2O 50 µ L까지 2 h.</li>
			<li>DNA는 벡터에서 프로브 DNA 파편 분리 젤 1%를 실행 하 고 제조업체에서 제공 하는 프로토콜에 따라 DNA 젤 추출 키트 프로브의 DNA 파편을 정화.</li>
			<li>260/280의 파장에서 분 광 광도 계 프로브 DNA 파편의 DNA 농도 측정 DNA 솔루션의 1 µ L를 사용 하 여 nm.</li>
			<li>준비 테 버퍼의 45 µ L와 1.5 mL 튜브에 프로브 DNAs의 40-ng, 3 분 동안 삶아, 짧게, 회전 하 고, 장소는 tube(s) 2 분 동안 얼음에.</li>
			<li>준비-가 DNA 라벨 구슬 포함 된 튜브에 열 변성 프로브 DNAs를 추가 (-dCTP), 혼합, [α32P] dCTP의 5 µ L을 추가 하 고 다음, 15 분 동안 37 ° C에서 품 어를 아래로 피펫으로.</li>
			<li>제조업체에서 제공 하는 지침에 따라 G-50 microcolumns를 사용 하 여 레이블이 지정 된 프로브를 정화 하 고, 다음, 섬광 카운터 (옵션)에서 방사능을 측정.</li>
		</ol>
</li>
		<li>레이블이 지정 된 프로브는 membrane(s)를 교배.<ol>
<li>멤브레인 prehybridize<ol>
<li>30 분 믹스 20 mL prewarmed 교 잡 솔루션 50 mL 튜브에의 삶은 연어 정자 DNA의 200 µ g와 42 ° C에서 교 잡 솔루션 prewarm</li>
				<li>교 잡 튜브에 막 장소입니다. 교 잡 튜브를 혼합된 prehybridization 솔루션을 추가 합니다. 교 잡 오븐 (롤링 세트와 42 ° C에 온도)에 그것을 배치 하 고 prehybridization 30 분 동안 진행 하자.</li>
			</ol>
</li>
			<li>레이블이 지정 된 probe(s)와 막 교배.<ol>
<li>교 잡 튜브 밖으로가 고; 50 mL 튜브에 prehybridization 솔루션을 부 어 부드럽게이 튜브를 혼합 단계 5.1.2.7에서에서 변성된 프로브 (3 분 동안 100 ° C에가 열)를 추가 합니다. 참고: 모든 유도 거품을 줄일 수 있습니다.</li>
				<li>교 잡 튜브를 혼합된 솔루션을 반환 하 고 42 ° C에서 교 잡 하룻밤을 수행 합니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>워시 nonhybridized 프로브를 제거 하는 membrane(s).<ol>
<li>SSC + 0.1% SDS x 1 트레이에 membrane(s)를 놓고 10 분 동안 55-60 ° C에서 부드럽게 흔들어.</li>
			<li>0.5 x SSC + 0.1 %SDS 용지함에는 membrane(s)를 전송 하 고 10 분 동안 55-60 ° C에서 부드럽게 흔들어.</li>
			<li>3 세척 필요 여부를 결정 하는 휴대용가 거 카운터를 사용 하 여는 membrane(s)에 방사능을 확인 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>X 선 필름 막에 방사능 노출.<ol>
<li>씻어 membrane(s)에서 액체를 제거 합니다.</li>
			<li>플라스틱 포장을 가진 membrane(s) 싸다 고 노출 카세트에 그것/그들이 수정.</li>
			<li>어두운 방에 x 선 필름 2 매를 막 노출.</li>
			<li>1 박 이상-80 ° C에서 노출 카세트를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>개발 결과 시각화 하는 영화. 해당 ES 복제 대상된 재결합 또는 조사에 의해 검출 DNA 밴드의 크기에 따라, 원하는 하나 인지를 평가 합니다.</li>
		<li>다음 절차에 따라 사용 된 프로브 스트립 후 또 다른 조사에 의해 동일한 막 rehybridize: 사용된 막 밖으로, 그것을 씻어 1 x H2O, 깨끗 하 고, 스트라이핑 솔루션에서 품 어 (formamide 55%, 2 %SSPE, 1 %SDS, H 2 O)에 1-2 h에 대 한 부드러운 떨고와 65 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR 식별
	<ol>
<li>10 x PCR 버퍼, 10mm dNTP의 50mm MgSO4, 1 µ L의 2 µ L, 20 µ M 앞으로 뇌관의 1 µ L의 5 µ L, 20 µ M 역 뇌관의 1 µ L를 포함 하 여 50 µ L 반응 솔루션에서 원하는 ES 클론의 PCR 식별을 수행 높은 충실도 플래티넘 Taq, gDNAs의 1 µ L (~ 100 ng), 그리고 H2O 50 µ L까지.</li>
		<li>다음 PCR 반응 조건 사용: 30 94 ° C에서 변성의 30 주기 3 분, 94 ° C에서는 초기 변성 30 60 ° C에서 어 닐 링 s s와 132 68 ° C에서 확장 s, 그리고 10 분 동안 68 ° C의 마지막 단계.</li>
		<li>1.0 %agarose 전기 이동 법으로 PCR 제품을 분석.</li>
		<li>T-쉬운 벡터 및 대상 벡터의 부분 시퀀스의 존재를 확인 하는 순서에 그들의 예상된 크기와 PCR 파편을 복제할.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

현재, 게놈 편집 디자이너 nucleases 여전히 ES 세포 기반 유전자를 대상으로 기술 대상에서 효과 및 긴 DNA 조각30,31삽입에 어려움의 그것의 문제로 바꿀 수 없습니다. 메서드로 골든 마우스 ES 세포에서 발생 하는 시간 이벤트를 식별 하는 데,이 보고서는 필드에 대 한 남부 럽 고 PCR의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 일련의 구문 대상으로 마우스 ES 세포에서 개별 클론을 분석 하 여 이러한 방법의 신뢰성을 검증. 이러한 방법으로 식별 원하는 ES 클론 생성 해당 마우스 모델27를 성공적으로 사용 되었습니다 했다.
타겟된 ES 클론의 심사에 대 한 다른 기술이 설명된19,32, 남쪽 더 럽 히기의 방법 그...

기술 murine ES 세포에서 시간에 의해 대상으로 하는 유전자의 특정 유전자 변이1,2의 셀룰러 결과 해 부를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 중요성 및이 기술의 중요성 2007 노벨상 생리학 또는 약3,4;에 의해 그것의 인식에 반영 됩니다. 한편, 그것은 유전자 공학5의 현대 시대의 출현을 나타냅니다. 진 HR을 통해 대상 포인트 돌연변이에서 ES 세포6,7마우스의 게놈에 있는 큰 염색체 재배열에 이르기까지 거의 모든 변화를 활용할 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 소위 게놈 편집 도구의 출현 하기 전에, 유전자 녹아웃 마우스의 세대 ES 세포8,9,10에 유전자를 대상으로 한 기술의 응용 프로그램 필요. 지난 2 년 동안 5000 개 이상의 유전자 타겟팅 마우스 모델링 인간의 질병 이나 유전자 기능11공부에 대 한이 접근 방식에 의해 생산 되었다. 유전자를 대상으로 벡터, 타겟된 ES 세포 클론, 및 사회 과학2,12,,1314 라이브 마우스를 배포 하기 위한 게놈 넓은 녹아웃 노력 설립 되었습니다. , 15. 의심할 여 지 없이, 셀 기반 HR 중재 유전자를 대상으로 기술에 크게 생리 적 또는 병 적인 맥락에서 유전자의 기능에 대 한 우리의 이해 고급.
HR은 포유류에는 상대적으로 드문 이벤트16,17, 중요 한 세포 및 다음 다음 단계 때문에 수많은 ES 식민지에서 발생 하는 돌연변이와 몇 클론을 식별을 위해 분석 하는 murine ES 세포에 유전자를 대상으로 대상 벡터18로 시간입니다. 시간 이벤트를 식별 하는 데 금 방법 등 남부 럽 PCR19,20. 접근의 이점 등는 남부 럽 올바르게 타겟된 ES 클론을 식별할 수 있는 유전자 타겟 이벤트 구문, 단일 복사본 삽입의 검증 등의 구조를 분석 하는 연구를 허용 하면서는 PCR 기반 전략 HR 이벤트21,22에 대 한 더 빠른 심사를 허용합니다. 하지만 이러한 방법은 단점, 같은 그들은 소모와 잘못 된 반응, 그들의 조합 사용은 널리 허용 하 고 가질 수 시간 이벤트 식별에 대부분의 실험실에 의해 적용, ES 세포에서 특정 유전자 생성에 대 한 수정 동물입니다.
포유류에서 각각의 3 개의 다른 유전자 (명명 된 Myh9, Myh10, 및 Myh14) 및 경 쇄의 두 쌍으로 인코딩됩니다 두 동일한 NMHC IIs 구성 된 nonmuscle myosin II (NM II)의 3 개의 isoforms II-A, ⅱ B, 및 II C23을 이라고 합니다. 이전 연구는 적어도 표시는 배아 치24,,2526이 isoforms의 비보에 절제 하기 때문에 II A 및 II B의 isoforms 마우스 개발에 대 한 필수적입니다. 이 문제를 회피 하 고 마우스 개발, 유전자 보충의 나중 단계에서 II A 및 II B의 isoform 특정 기능에 대 한 새로운 통찰력을 얻을 셀 기반 HR 중재 하는 유전자를 대상으로 기술 ES를 사용 하 여 전략을 채택 마우스 모델27의 일련을 생성 합니다. 원하는 ES 클론 식별, 동안 남부 럽 및 PCR 방법을 이용 하였다, 그리고 이러한 입증 효율적이 고 신뢰할 수 있는27,28.
이 종이 남부 럽 고 PCR, vector(s), probe(s), 및 뇌관, 및 실험의 실행 뿐만 아니라 시간 이벤트 식별 exemplified 결과의 분석 대상의 디자인을 포함 하 여에 대 한 자세한 설명을 제공 하고자 모델 및 대표 데이터 유전 교체 NM II 마우스를 만들기 위한 ES 세포에 발생. 여기에 제시 된 이러한 두 메서드의 프로토콜 식별 유전자 변형된 세포 또는 동물의 genotypes 또한 채택 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BAC CLONE</td><td>BACPAC Resources Center (BPRC)</td><td>bMQ-330E21</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Large-Construct Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus 맥시 키트</td><td>QIAGEN</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra 고충실도 DNA 중합효소</td><td>애질런</td>트 <td>600382</td><td></td></tr><tr><td>T-easy 벡터</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>핵 용해 용액</td><td>Promega</td><td>A7941</td><td></td></tr><tr><td>단백질 침전 용액</td><td>Promega</td><td>A7951</td><td></td></tr><tr><td>DNA 변성 용액</td><td>VWR</td><td>351-013-131</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중화 용액</td><td>VWR</td><td>351-014-131</td><td></td></tr><tr><td>ready-To-go DNA Labeling Beads (-dCTP)</td><td>VWR</td><td>27-9240-01</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, V/V)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15593031</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Fisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA 솔루션</td><td>Thermo Fisher</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Platinu Taq DNA 중합효소 고충실</td>도 <td>Thermo Fisher</td><td>11304029</td><td></td></tr><tr><td>Not I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0592</td><td></td></tr><tr><td>Dra I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0221</td><td></td></tr><tr><td>EcoR I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>Ganciclovir</td><td>Sigma</td><td>G2536</td><td></td></tr><tr><td>왓맨&nbsp; TurboBlotter 전송 시스템, 대형 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-301-188</td><td></td></tr><tr><td>[&alpha; 32P]dCTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG013H100UC</td><td></td></tr><tr><td>ProbeQuan G-50 마이크로 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td></td></tr><tr><td>Hybrisol I 혼성화 솔루션</td><td>Millipore</td><td>S4040</td><td></td></tr><tr><td>Kodak X-Ray Film</td><td>Z& Z 메디컬</td><td>844 5702</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

오프 대상 효과의 문제 및 디자이너 nucleases 게놈 편집, 배아 줄기에 대 한 응용 프로그램에서 긴 DNA 파편을 삽입의 어려움에 상대 (ES) 세포 기반 유전자를 대상으로 이러한 결점 없는 기술과 널리 큰 삭제/삽입에서 단일 염기 치환에 이르기까지 동물/마우스 게놈을 수정 하는 데 사용. 특히, 상대적으로 적은 동종 재결합 (HR) 이벤트를 얻기 위해 필요한 식별 원하는 ES 클론은 정확 하 고 안정적인 방법 요구 중요 한 단계. 남부 럽 또는 기존의 PCR 수시로이 목적을 위해 활용 됩니다. 여기, 우리는 그 두 가지 방법을 사용 하 여 마우스 ES 세포는 생 Myh9 유전자는 중단 하 고 다른 nonmuscle myosin 무 겁 사슬 IIs (NMHC IIs) 인코딩 cDNAs에 의해 대체 하기 위한 것에서 발생 하는 시간 이벤트를 식별 하는 자세한 절차를 설명 합니다. 남부 럽의 모든 절차는 vector(s), electroporation, 약물 선택, 확장 및 ES 세포/클론, 준비, 소화, 저장을 지정 하 고 게놈 DNA (gDNA)는 교 잡의 럽의 건설을 포함 하 고 probe(s), 및 x-선 필름에 autoradiography에의 마지막 단계 세척. PCR는 준비 하 고 희석 gDNA를 직접 수행할 수 있습니다. 이상적인 결과 얻기 위해 프로브 및 (재) 남부 럽에 대 한 절단 사이트 및 PCR 위한 뇌관 제한 효소 수 신중 하 게 계획 합니다. 비록 남부 럽의 실행 시간과 노동 집약적 이며 PCR 결과 판정, 남부 럽 및 PCR에 의해 신속한 검사 하 여 올바른 식별 설명 하는 이러한 방법을 단독 또는 결합 된 응용 프로그램 허용 널리 사용 하 고 대부분의 실험실 genotypes ES 세포 및 유전자의 식별에 의해 상담이 종이에서 동물 수정.

이 논문에서는 남부 럽 PCR의 상세한 프로토콜 설명, 셀 기반 HR 중재 대상 기술 ES를 사용 하 여 NM II 유전자 대체 마우스 모델의 생성에 대 한 마우스 ES 세포에서 발생 하는 이벤트를 시간을 식별 하기 위해 이용 되는 합니다. 비록 남부 럽 고 PCR, 뿐만 아니라 전통적인 유전자를 대상으로 기술, 널리 사용 되었습니다 수 십년 동안, 그들의 성공적인 적용 신중 하 게 계획 해야 합니다. 적어도 이러한 측면은 고려 되어야 하는 데 필요한: 길고 짧은 팔, 위치 및 프로브, 게놈 DNAs 뇌관 도움이 그림 1에 요약 된 대로, PCR를 위한 절단 적당 한 해상도의 길이의 길이 이후 분석입니다. 남부 럽의 중요 한 단계, 준비 하 고 소화 게놈 DNAs는 구분 하는 데 필요한 조사에 의해 감지에 대 한 DNA 젤에. DNAs 게놈 많은 서로 다른 길이와 조각으로 잘라는, 때문에 그들은 DNA 젤, <stro...

여기, 우리 남부 럽 그리고/또한 PCR를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 발생 하는 동종 재결합 이벤트를 식별 하는 데 자세한 프로토콜 제시. 이 메서드는 nonmuscle myosin II 유전자 대체 마우스 모델 기술을 사용 하 여 전통적인 배아 줄기 세포 기반 동종 재결합 중재 대상의 세대에 의해 exemplified입니다.

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

이 방법은 마우스 배아 줄기 세포에 있는 동종 재조합 사건을 확인하는 것과 같은 분자 및 세포 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정확하고 신뢰할 수 있으며 널리 사용된다는 것입니다. 따라서, 이 방법은 마우스 배아 줄기 세포에 있는 동종 재조합 사건을 확인하는 통찰력을 제공할 수 있습니다.그것은 또한 유전자 변형 된 세포 또는 동물과 같은 다른 시스템에 적용 될 수있다. 일반적으로 이 메서드를 새로 사용하는 개인은 시간이 오래 걸리고 여러 단계가 수반되기 때문에 어려움을 겪게 됩니다. 각 gDNA에 대해 DRA 1, DRA 1의 마이크로리터 3개, 샘플당 10마이크로그램의 gDNA에 10마이크로리터의 마이크로리터 30마이크로리터를 혼합합니다.최종 부피가 30 마이크로리터가 될 때까지 물을 추가하고 밤새 섭씨 37도에서 배양하여 gDN을 소화합니다. 에디움 브로마이드와 함께 1%아가로즈 전기포고증 젤을 준비합니다. 이전에 획득한 샘플을 한 KB 사다리와 함께 젤에 로드하고 밤새 30~40볼트로 실행합니다.다음 날, 0.2 뉴턴 염산 용액이 들어있는 트레이에 젤을 담급니다. 셰이커를 사용하여 실온에서 20분 동안 트레이를 부드럽게 흔들어 줍니다. 젤을 DNA 데니밍 용액을 함유한 트레이로 옮기.실온에서 20분 간 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 젤을 DNA 중화 용액을 포함하는 트레이로 옮김합니다. 실온에서 20분간 부드럽게 흔들어 줍니다.신속한 하향 전달 시스템을 사용하여 DNA를 젤에서 멤브레인으로 이송합니다. 다음으로 제조업체에서 제공하는 지침에 설명된 대로 서청 블로터 및 블로팅 스택을 조립합니다. 그 후 멤브레인을 꺼내 식염수 2개로 1분간 씻어내세요.조직으로 액체를 흡수한 다음 UV 크로스링커를 사용하여 DNA를 멤브레인과 연결합니다. 방사능으로 DNA 프로브를 라벨링하기 시작하려면 DNA 라벨링 구슬을 사용할 준비가 된 튜브에 열 변성 프로브 DNA를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 섞어 드시고 있습니다.그리고 방사성 라벨데옥시토딘 삼중산염의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분간 배양하세요. 제조업체에서 제공하는 지침에 따라 G 50 마이크로 컬럼을 사용하여 라벨이 부착된 프로브를 정화합니다.신경화 카운터를 사용하여 방사능을 측정합니다. 라벨이 부착된 프로브로 멤브레인을 혼성화하기 시작하려면 멤브레인을 혼성화 튜브에 넣습니다. 혼합 된 사전 혼성화 솔루션을 추가합니다.튜브를 혼성화 오븐에 넣고 사전 혼성화가 섭씨 42도에서 30분 동안 진행하게 하십시오. 그런 다음 오븐에서 튜브를 제거하고 50 밀리리터 튜브에 사전 혼성화 용액을 붓습니다. 변성 프로브를 추가하고 부드럽게 섞습니다.비혼성 프로브를 제거하려면 멤브레인을 0.1% SDS의 X 식염수 화 분과 함께 트레이에 넣고 10 분 동안 섭씨 55 ~ 60도에서 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 멤브레인을 플라스틱 랩으로 감싸고 노출 카세트에 고정하십시오. 어두운 방에서 멤브레인을 X 선 필름 2장에 노출시킵니다.결과를 시각화하기 위해 필름을 개발합니다. 프로브에 의해 검출된 DNA 대역의 크기에 따라 해당 ES 클론이 재조합 대상을 원하는 복제본인지 여부를 결정한다. 본 연구에서, 남부 블로팅 및 PCR은 ES 세포 기반 HR 매개 타겟팅 기술을 사용하여 NM 2개의 유전자 대체 마우스 모델의 생성을 위해 마우스 ES 세포에서 발생하는 HR 이벤트를 식별하는 데 활용된다.게놈 DNA는 다른 길이를 가진 많은 조각으로 절단되기 때문에, DNA 젤에 상태 같이 얼룩을 표시합니다. 이것은 게놈 DN의 완전한 소화를 건의합니다. 남부 블로팅의 마지막 단계로, 표적 DNA 단편과 혼성화하는 방사능 표지 프로브의 신호가 필름에 표시됩니다.예상 대역의 모양은 ES 클론에서 HR 이벤트의 발생을 반영합니다. 연구에서 사전 설계에 따르면, 돌연변이 된 진상색을 가진 ES 클론은 두 개의 뚜렷한 크기 밴드가 있습니다. 야생 형 ES 클론은 하나의 밴드가 있지만 원하는 ES 클론이 이종화구스라고 제안합니다.PCR 반응에 따라, PCR 제품은 DNA 젤에서 분석될 수 있다. 올바른 크기의 특정 NPCR 대역이 관찰되는 경우, 이는 해당 PCR 대역을 시퀀싱하여 더 확인할 수 있는 HR 이벤트의 발생을 시사한다. 이 기술의 의미는 기초가 동일하기 때문에 점 돌연변이를 확인하는 치료로 확장되었습니다.이 절차를 시도하는 동안 인내심과 주의하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 구만체동물의 형성과 같은 추가 질문에 대답하기 위해, 포모세포에 ES 세포의 미세 주입과 같은 다른 방법이 수행 될 수있다. 그것의 발달을, 이 기술은 특정 유전자의 기능 또는 마우스 또는 그 너머에 있는 돌연변이한 유전자의 결과를 탐구하기 위하여 분자와 세포 생물학의 그들의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.방사능 라벨러 P32 DCTB와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 보호 보드로 차폐와 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 복용해야한다는 것을 잊지 마십시오.

identification-homologous-recombination-events-mouse-embryonic-stem

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 방사선 표지된 프로브를 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈에서 상동 재조합 이벤트를 식별하는 Southern blotting 기술에 대해 설명합니다. 상동 재조합 이벤트를 포함하는 DNA 영역은 프로브 결합 DNA를 포함하는 막이 X선에 노출될 때 뚜렷한 띠로 나타납니다.

마우스 배아 줄기 세포 게놈에서 상동 재조합을 검출하기 위한 서던 블로팅(Southern Blotting)

마우스 배아 섬유아세포는 전사 인자 Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc의 강제 발현에 의해 낮은 효율로 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있습니다. 재프로그래밍 반응의 드문 중간체는 세포 표면 제작자 Thy-1.2, Ssea-1 및 Epcam에 대한 항체 표지를 통해 분리된 FACS입니다.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

이 문서는 반 복제 배아의 건설을 위한 정액을 대신하기 위하여 parthenogenetic haploid 배아 줄기 세포의 사용을 입증하는 것을 작정입니다.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

난모세포 게놈 무결성을 유지하는 것은 결과 배아에서 유전적 충실도를 보장하는 데 필요합니다. 여기에서 우리는 포유류 암컷 생식 세포에서 DNA 이중 가닥 절단을 검출하기 위한 정확한 프로토콜을 제시합니다.

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

본 프로토콜은 2i 및 LIF 배지를 사용한 배양 중 마우스 배아 줄기 세포의 역 다중-transfection 방법을 설명합니다. 이 방법은 기존의 forward transfection 프로토콜보다 더 높은 생존력과 효율성을 제공하는 동시에 plasmid 비율의 one-pot 최적화를 가능하게 합니다.

핵산 비율의 신속한 탐색을 위해 최적화된 마우스 배아 줄기 세포 기반 역 Poly-transfection 기술

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

배우세요 마우스 배아 줄기 세포에서 동종 재결합 이벤트를 식별하는 방법을 Southern 블롯과 PCR을 사용하여. 이 기술은 유전자 교체 마우스 모델 생성에 활용되며 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

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