Name: 시금치 기본 그린 젤 전기 이동 법 및 Time-Correlated 단일 광자 계산을 사용 하 여 밴드 특성화 Thylakoid 단백질 복합물의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 시금치 thylakoid 단백질 복합물을 Native Green Gel 전기 이동법과 Time-Correlated Single Photon Counting으로 분리 및 특성화하는 방법을. 이 기법은 광합성 연구에서 에너지 연결성을 신속하게 분석할 수 있습니다.

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1. 재고 솔루션 준비 네이티브 녹색 젤 쏟아져
<ol><li>40% 글리세롤, 200mm 글리신, 및 100 mM Tris pH 8.3에 버퍼의 구성 된 젤을 해결 하기 위한 집중된 버퍼 솔루션 x 4를 준비 합니다.</li>
	<li>겹쳐 쌓이는 젤 40% 글리세롤, 200mm 글리신, 100 mM Tris 버퍼 pH 6.3에 구성 된에 대 한 집중된 버퍼 솔루션 x 4를 준비 합니다.</li>
	<li>금형의 성장을 방지 하기 위해 4 ° C에서이 버퍼를 저장 합니다. 참고: 버퍼 되므로 안정적인 4 ° c, 달에 대 한 지속적인된 사용에 대 한 각 버퍼의 100-200 mL의 준비는 것이 좋습니다.</li>
	<li>250 mM Tris HCl pH 8.3 포함 하는 버퍼를 실행 하는 x 10의 1 리터를 준비 1.92 M 글리신, 및 1 %SDS. 벤치탑에 버퍼를 실행 x 10을 저장 합니다.</li>
</ol>2. 재고 솔루션 대비 격리 및 Thylakoids의 가용 화
<ol><li>TMK 균질 버퍼 및 10mm KCl, 10mm MgCl2, 50 m m Tris 버퍼 (pH 7), 포함 된 100 mL를 준비 하 고 4 ° c.에 저장 참고: 이것은 조직 및 조작 thylakoid 샘플에 대 한 주요 버퍼 이다. 또는, 집중된 재고 솔루션 준비 하 고 필요한 (Tris 버퍼, MgCl2및 모든 KCl 수 있을 쉽게 저장 벤치탑에 집중 하는 1 M) 만큼 희석 될 수 있습니다.</li>
	<li>TMK 버퍼 20 %w / 동결 대 1 mL aliquots에-20 ° C에서 각 세제를 용 해 하 여 재고 솔루션은 thylakoid의 가용 화 세제, B decyl maltoside (DM) 및 n-octyl B-d-glucoside (OG)을 준비 합니다.</li>
	<li>또한 샘플 로딩 버퍼는 thylakoid 가용 화 버퍼 (SB)를 준비 합니다.<ol>
<li>첫째, TMK 버퍼의 7 mLs 및 글리세롤의 3 mLs를 결합 하 여 만들어 TMK 글리세롤 버퍼.</li>
		<li>TMK 글리세롤 버퍼의 800 μ, DM 재고 솔루션의 100 μ 및 100 μ 및 재고 솔루션의 추가. 2 %DM 및 2%의 1 mL aliquots에-20 ° C에서 냉동 포함 하이 SB 작업 솔루션을 저장 합니다. 참고: 각 약 수 해 동 고 필요에 따라 refrozen 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 나중에 사용에 대 한 녹색 미니 젤 쏟아져
<ol><li>별도 스택 및 15 mL 일회용 시험관에서 젤 솔루션 해결 준비. 참고: 제공 하는 볼륨은 1.5 m m 플레이트 스페이서를 사용 하 여 단일 미니 젤에 대 한 충분 한.<ol>
<li>겹쳐 쌓이는 젤 솔루션으로 만들기 위해 스태킹 젤 버퍼, 40% 아크릴 재고 솔루션 (39:1 C) 0.5 mL 및 스택 버퍼 x 1에서 4% 아크릴 아 미드의 5 mL을 주고 물의 3.25 mL x 4의 1.25 mL을 결합 합니다. 해결 젤 수 있도록 솔루션 해결 버퍼, 40% 아크릴 재고 솔루션 (39:1 C), 0.94 mL 및 버퍼 해결 x 1에서 5% 아크릴 7.5 mL를 주고 물 4.7 mL x 4의 1.875 mL을 결합 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해결 젤을 붓는 다.<ol>
<li>추가 10% 염화 persulfate (AP)의 50 μ 해결 젤 솔루션에 다음 추가 TEMED의 10 μ, 튜브, 모자 하 고 부드럽게 섞어 여러 번 반전. 즉시 해결 젤 겹쳐 쌓이는 젤에 대 한 빗 이빨의 하단 상단 사이 대략 1 cm를 떠나 젤 격판덮개 사이 젤 솔루션을 붓는 다.</li>
		<li>부드럽게 100% 에탄올 젤 단계로 해결 젤 위에 플라스틱. 참고: 15 분 이내 젤을 설정 하지 않는 신선한 APS 솔루션 여야 한다/또는 새로운 TEMED를 사용 해야 합니다.</li>
		<li>젤 생산은 후 (젤과 에탄올 사이의 인터페이스 쉽게 볼 수 있을 것입니다 하 고 젤 밀고 때 이동 하지 것입니다), 에탄올 및 흡수 성 종이 오 점 부.</li>
	</ol>
</li>
	<li>겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 다.<ol>
<li>추가 25 μ 10%의 스태킹 젤 솔루션에 AP 추가 TEMED의 5 μ 다음 모자 및 해결 젤과 같은 방식으로 혼합 하는 반전. 플레이트 사이의 공간을 완전히 채워집니다 때까지 해결 젤 위에 젤 솔루션을 부 어 하 고 10-잘 빗을 삽입 합니다. 참고: 때 사용 될 준비가 되어 있는, 젤에서 빗을 제거 하 고 우물 우물 직선 가리지 젤에 의해 확인 하는 물으로 린스. 젤은 적어도 몇 일 동안 장소에 4 ° C에 빗으로 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 절연 원유 Thylakoid 막에서 시금치의 잎
참고: 모든 단계 실행 되어야 한다 밖으로 미리 냉장된 장비 및 버퍼를 사용 하 여 얼음에. 희미 한 조명 또한 것이 좋습니다. 실험의 재량에 따라 연구에서 생물 학적 과정, 효소 및 인산 가수분해 효소 억제제는 균질 전에 TMK 버퍼에 신선한 추가 되어야 합니다.
<ol><li>완전히 유리 Dounce 균질 화기와 TMK 버퍼에 시금치 잎을 균질. 참고: 버퍼의 약 1 ~ 2 mL 작은 아기 시금치 잎에 대 한 일반적으로 충분 하다. 단일 아기 시금치 잎 일반적으로 1.5 m m 미니 젤에 여러 우물을 로드를 충분 한 자료를 제공할 수 있습니다.</li>
	<li>불용 성 파편 제거를 원유 잎 homogenate를 필터링 합니다.<ol>
<li>간단한 필터링 장치, 섬세 한 작업을 잘라 반으로 닦아와 내 무 반으로 접어. 5 mL 일회용 주사기의 하단에 섬세 한 작업 지우기를 포장 하 고 미리 젖은 TMK 버퍼 지우기.</li>
		<li>주사기 플런저를 사용 하 여 섬세 한 작업 지우기에서 초과 버퍼를 누르고는 지우기 필터 누르면 단단히 주사기의 하단에 플런저를 제거한 후 반드시.</li>
		<li>지우기 필터의 중앙에 잎 homogenate 플라스틱 하 고 플런저를 사용 하 여 필터는 homogenate를 통과. 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 필터링 된 homogenate를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>펠 렛의 thylakoid 막을 포함 하 여 불용 성 물질을 4 ° C에서 10 분 동안 5000 x g에서 homogenate 원심 삭제는 상쾌한 고 TMK 버퍼의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>엽록소의 동일한 총 금액을 포함 하는 각 샘플을 아래 설명 된 대로 각 resuspended thylakoid 샘플의 볼륨을 조정 하 여 각 샘플에서 엽록소의 양을 정상화. 참고:이 각 샘플 세제의 같은 볼륨에서 solubilized을 하면 고 가용 화 펠 릿 볼륨에 있는 다름 때문에 변화를 최소화 합니다.<ol>
<li>Resuspended thylakoid 막의 각 샘플에서 엽록소를 추출, 50 μ aliquot microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 걸릴 하 고 그것에 메탄올의 950 μ를 추가 합니다. 캡 튜브와 여러 번 반전 하 여 섞는다.</li>
		<li>펠 렛의 침전 된 단백질을 10 분 동안 10000 x g에 메탄올/엽록소 추출 원심</li>
		<li>리 포 라 외 알에 따라 상쾌한을 포함 하는 안료의 엽록소 농도 결정 합니다. 23.는 분 광 광도 계를 사용 하 여 1 ㎝ 베트 652, 665 nm에서 흡 광도 신호를 받아. 아래 수식을 사용 하 여 총 엽록소 농도를 확인 합니다. Chls는 + b (μ g/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm)</li>
		<li>가이드로 서 엽록소 농도 측정을 사용 하 여 제거 하 고 엽록소의 동일한 총 금액을 포함 하는 각 튜브를 필요에 따라 각 샘플에서 일부 볼륨 삭제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 분 제거에 대 한 5000 x g에서 원심 분리 하 여 다시 펠 렛의 thylakoid 막 그리고 삭제는 상쾌한. 펠 릿의 발음 하지 않고 모든 상쾌한을 제거 하려면 주의 해야 합니다.</li>
</ol>5. 네이티브 젤에 로딩을 위한 Thylakoid 막의 가용 화
<ol><li>TMK 30% 글리세롤 세제 솔루션 (SB)의 약 수를 해 동 하 고 섞어 여러 번 반전. 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>1 mg/mL의 엽록소 농도 주고 SB의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 thylakoid 펠 릿을 디졸브. 참고:이 농도 실험적으로 결정 되어야 최적의 가용 화 상태를 찾기 위한 출발점. 엽록소 농도 비교 만들 수 있도록 샘플 사이 같은 유지 되어야 한다.</li>
	<li>플라스틱를 위아래로 반복 해 서 샘플의 볼만 않도록 주의 하면서. Thylakoid 샘플 solubilize을 허용 하도록 얼음에 계속. 참고: 적어도 10 분 동안 Solubilize. 가용 화 시간 충분히 샘플 가용 화 시간에 차이 최소화 해야 합니다. 예: 3 분 모든 샘플을 solubilize를 해야 하는 경우 다음 30 분 정도 허용 되어야 한다 가용 화에 대 한.</li>
	<li>펠 렛의 불용 성 물질을 4 ° C에서 10000 x g에서 solubilized thylakoids 원심 참고: Solubilized thylakoid 샘플은 안정적인 얼음에 시간 동안, 하지만-70 ° C에서 보관 피해 야 한다, freeze-thaw 주기 megacomplex 밴드의 손실 될 수 있습니다.</li>
</ol>6. 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Solubilized Thylakoid 단백질의 분리
<ol><li>이전 준비 기본 젤에 직접 단계 5.4에서 solubilized thylakoid 표면에 뜨는 로드. 1.5 m m 젤 잘 당 solubilized thylakoid의 15 μ 로드.</li>
	<li>SDS 페이지 젤 버퍼를 실행 하는 x 1을 사용 하 여 기본적으로 동일한 방식으로 네이티브 녹색 젤을 실행 합니다. 100 V에서 젤을 실행 하 고 완화 젤의 저항 난방을 실행 하는 동안 젖은 얼음에 전체 젤 탱크를 놓습니다. 참고: 젤 젤 (그림 1)의 하단에 도달 마이그레이션 앞에 무료 안료에 대 한 약 2 시간을 요구 해야 합니다.</li>
</ol>7. 네이티브 녹색 젤 Thylakoid 복잡 한 밴드의 절단
참고: 젤에서 관심의 특정 밴드 절 개은 빔 경로에 배치 하 고 인근 단지에서 길 잃은 형광 수집 되지 않도록 방지 하기 위해 밴드를 허용 해야 합니다.
<ol><li>젤 전기 이동 법 셀 린스 증류수와 젤 접시의 버퍼를 실행에서 제거 합니다. 젤에서 상단 플레이트를 제거 하 고 증류수와 젤을 씻어.</li>
	<li>바닥 유리 접시에 젤을 유지 하 고 얼음에 젤과 접시를 놓습니다. 때 사용 중, 어둠 속에서 젤을 유지 하 고 밖으로 건조에서 그것을 막기 위하여 플라스틱 포장으로 커버.</li>
	<li>유리 접시에 남아 있는 젤, 삭제할 때 TCSPC 분석에 대 한 준비의 각 밴드. 깔끔하게 날카로운 메스 또는 면도칼 블레이드와 함께 밴드를 삭제할 및 삭제 밴드 아니 오염 밴드 자료 포함 처리.</li>
</ol>8. 실내 온도 정상 형광 스펙트럼의 수집
<ol><li>TCSPC에 의해 분석 될 것 이다 각 복합, 실내 온도 형광 스펙트럼 형광 분석기를 사용 하 여 600와 800 nm 사이 가져온 것입니다. 참고:이 스펙트럼을 수집 하는 데 사용 하는 여기 파장 TCSPC에 사용 되는 파장을 일치 해야 합니다.</li>
</ol>9입니다. 녹색 젤 밴드 TCSPC
참고: TCSPC 설치의 묘사 그림 2 를 참조 하십시오.
<ol><li>샌드위치 두 유리 현미경 간의 젤 조각을 슬라이드. 사용 하 여 마스킹 테이프, 현미경 슬라이드 중의 각 끝에 놓이고를 슬라이드 수 있습니다 개최 함께 단단히 젤 슬라이스를 압축 하지 않고 스페이서를 만들려고 이상 여러 번 접혀. 참고: 이것은 현미경 슬라이드 사이 하 젤 조각을 통해 레이저 빔에 대 한 경로 만듭니다.</li>
	<li>신호 산란이 줄어 부드러운 인터페이스를 만드는 유리 슬라이드의 가장자리에 젤 조각에 물 작은 금액을 추가 합니다.</li>
	<li>클램프는 빔 공격 허용 하는 젤이 샌드위치는, 유리 슬라이드의 측면을 통해 빔 경로에 수직인 형광 방출 격판덮개의 오픈 가장자리 통해 젤 슬라이스를 젤/슬라이드 빔 경로에 샌드위치. 참고: 여기 파장 사용 실험에 따라 달라 집니다. 435의 파장 nm 엽록소 a와 엽록소 b, 465 하면서 자극 한다 nm 우선적으로 엽록소 b를 자극 합니다. 이 경우, 435 nm 여기 파장으로 사용 되었다.</li>
	<li>각 단지에 대 한 형광 방출 스펙트럼에 걸쳐 정기적으로 10000 총 데이터 포인트를 수집 합니다. 예를 들어 수집 데이터 모든 10 nm, 시작 680 nm와 결말을 750 nm. 참고: 적절 한 신호 수집을 방지 하는 photobleaching는 그 신선한 예제 사용할 수 있도록 공부 각 단지에 대 한 여러 젤 밴드를 준비 합니다.</li>
</ol>10입니다. TCSPC (데이터 분석)
<ol><li>주어진된 복합물을 위해 먼저 수집 하는 모든 파장에 대 한 각 감퇴 곡선의 피크 높이 정상화. 참고:이 단계는 DAS의 건설에 대 한 필요 하지 않습니다 하지만 중첩 하 여 데이터의 첫 번째 검사로 시각적으로 서로 비교 감퇴 곡선에 대 한 허용.</li>
	<li>꼬리-경기 각 감퇴 곡선 아래에 설명 된 복잡 한의 정상 상태 형광 스펙트럼을.<ol>
<li>이후 부패 신호 몇 나노초 후 일반적으로, 밖으로 평평 했다 timepoint 선택 하십시오.</li>
		<li>각 파장에 대 한 정상화 감퇴 곡선 선택한 timepoint에 신호 강도 그 파장에 정상 상태 형광 스펙트럼의 값 (즉, 선택한 timepoint에 함께 한 모든 파장의 값 다시 만들어집니다 정상 상태 형광 스펙트럼을).</li>
	</ol>
</li>
	<li>아래 설명 된 대로 일치 하는 꼬리 감퇴 곡선에서 부패 부 스펙트럼 (DAS) 구축.<ol>
<li>데이터를 사용 하 여 꼬리 일치 감퇴 곡선에서 일정 한 시간 간격으로 파장 대 형광 강도 그래프는 플롯의 시리즈 구성 (예를 들어, 모든 10 ps). 예를 들어 50 ps에서 DAS 파장 대 50 ps에 각 감퇴 곡선의 값을 플롯 하 여 생성 됩니다.</li>
		<li>시간이 지남에 형광 스펙트럼의 감퇴를 보여 주는 폭포 스타일 음모를 만드는 부패 관련 된 스펙트럼의 모든 오버레이.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

성공적인 thylakoid 가용 화 및 실행 기본 젤 중요 한 왜곡 없이 젤에 여러 가지 표시 녹색 밴드의 해상도 또는 밴드의 번짐 발생 합니다. 젤 오버 로드, 높은 세제 농도, 잘못 된 샘플 pH으 소재, 젤 너무 빠르게 또는 너무 높은 온도에서 실행 되며 잘못 부 젤 제대로 해결된 thylakoid 단지에 기여할 수 있는 모든 요소. 젤 자체의 조건 최적화 하는 동안 (예., 아크릴 그라데이션 농도), 그것은 관심의 밴드의 해상도 최대화 하기 위해 도울 수 있다. 그것은 우리의 경험을 가용 화 조건 및 시료 자체의 생물학은 품질과 수량 thylakoid 단지 네이티브 녹색 젤에 해결에 기여 하는 가장 중요 한 요인. 그것은 모든 단지 모든 생물 조건 하에서 있을 것입니다 기억 하는 것이 중요입니다.
네이티브 녹색 젤은 정상적인 SDS 페이지 미니 젤 본질적으로 동일한 방식으로 따라 진다. 젤 아침에 부 수 하 고 나중에 같은 날, 사용할 준비가 또는 젤에 빗...

광합성 생물 끊임없이 변화 하는 환경 조건 그들의 생산성을 극대화 하 고 이웃1과 성공적으로 경쟁 하기 그들의 생리학을 조정 해야 합니다. 이 기계 주변광 조건 전체 햇빛과 그림자 사이 3 개의 크기 순서에 의해 변동 될 수 있습니다으로 광합성, 빛 반응에 대 한 책임의 특히 사실 이다. 또한, 가뭄, 감기, 또는 열 스트레스 같은 빛 반응의 제품에 대 한 자연 전자 싱크 탄소 고정을 위한 탄소가 산화물의 가용성을 줄일 수 있습니다. 식물 해야 합니다, 그리고 따라서 하 게 수확 하 고 필요에 따라 초과 빛 에너지를 발산 하는 능력을 유지 하면서 가능한 한 효율적으로 태양 복사를 활용. 반면 photooxidative 손상을 계속 발생 합니다 정기적으로 모든 조명 조건2,3, 실패 관리를 흡수 여기 에너지 성공적으로 치명적인 세포 손상과 죽음으로 이어질 수 있습니다. 몇 가지 적응 메커니즘 통용 환경 조건에서 변화 하 고 일시적인 변동 (즉, 길고 짧은 timescales 이상)4튜닝할 광합성 장치를 허용 하는 존재. 장기 응답 (LTR) 및 비-광화학 냉각 (NPQ) 포함 됩니다. NPQ 상태 전환 (qT), 냉각 (qE 급속 하 게 유도할 수 있는 에너지), 및 photoinhibition (제나라)5를 포함 하 여 적어도 3 개의 다른 구성 요소 현상, 포괄 하는 것으로 간주 그 자체 이다.
이러한 프로세스를 관찰 원래 되었고 광 현상으로 크게 정의 [예를 들어, NPQ 참조 한 방울의 속도 증가 때문만 아니다 (엽록소 형광의 냉각) 관찰된 엽록소를 형광에 광화학]6. "상태 전환" 유사 하 게 관찰 하는 의미에서 PSI과 PSII7에서 형광의 상대적인 양을 변경 합니다. 이러한 현상의 열거형으로 가능 하 게 만든 분 광 기법을 동안 [특히, 펄스 진폭 변조 (PAM) 형광 분광학] 계속 관찰 하 고 광합성 프로세스 에서 해 부를 위한 중요 한 수단 vivo, 훌륭한 제의로 생화학의 이러한 분 광 관측을 기본 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 필요한입니다. 상태 전환, 예를 들어, STN7 키 니 아 제 및 TAP38/PPH1 인산 가수분해 효소, 각각8,,910LHCII 단백질의 인 산화/dephosphorylation 주기를 포함 한다. 이 주기 조정 PSII에서 PSI, 그로 인하여 흡수 변화 LHCII trimers의 일부를 이동 하 여 두 개의 photosystems 사이 LHCII 안테나의 물리적 배포 photosystems11,12의 횡단면. 빠르게에 NPQ의 qE 구성 요소 violaxanthin/제 아 잔 틴 epoxidation/드-epoxidation 사이클과 PsbS 단백질의 활동을 통해 열 과도 여기 에너지를 변환합니다. 이 과정에서 PsbS의 정확한 역할은 여전히 하지 완전히 이해13. Photoinhibition, NPQ의 키 구성 요소는 일반적으로 PSII의 D1 단백질에 손상을 관찰 작용. 전체 광합성 능력의 복원 손상 된 PSII photocenters를 해결 하기 위해 정교한 복구 프로세스가 필요 합니다. PSII 수리 주기 PSII 단지는 granal 스택, 단지 철거, 손상 된 D1 단백질의 보충, PSII 단지의 리어셈블리 및 granal 스택14에 다시 PSII 단지의 움직임의 마이그레이션이 포함 됩니다. Photoinhibition PSII photodamage의 정확한 특성 강렬한 감시15의 주제에 남아 있다.
현상 상태 처럼 공부에 어려움 전환 또는 PSII 수리 부분에 복잡 한 생화학 시스템의 역학을 시각화 하기 위해 하나의 간단한 방법 사실에서 발생 합니다. 프로세스를 이해 하 고전 생 화 확 적인 방법은 고립에서 특성화 될 수 있도록 먼저 구성 요소를 별도 것입니다. 기본 젤 전기 이동 법 성공적인 노력에서 분리 하 고 더 많은 대리점 메서드 (즉 자당 기온 변화도 원심 분리 크로마토그래피)16thylakoid 막에서 photosystem 단지 특성화는 1980 년대에서 일어났다. 세제 시스템 부드럽게 solubilize thylakoid 막에서 네이티브 복합물을 개발 했다 곧 적응 전기 이동 별거 방법, 가장 주목할만 하 게 알 렌과 Staehelin17 과 베드로 Thornber18, 기한 네이티브 녹색 젤 전기 이동 법. 동안 다양 한 기술 실험 무기고, 기본 페이지에서에서 대표 단 하나 광합성 연구에 널리 고용된 방법 만든 매력적인 특성의 수를 있다. 기본 페이지는 상대적으로 신속 하 고 간단, thylakoid 복합물의 많은 수의 고해상도 분리를 동시에 제공 하면서 약간 특수 장비가 필요. 이것은 네이티브 페이지 thylakoid 역학을 공부 하 고, 두 번째 차원 다양 한 세제 및 버퍼 시스템, 찾기 및 새로운 thylakoid 단지에 대 한 다양 한 시스템에 있는 표준 페이지와 함께 하는 편리한 도구.
즉, 네이티브 녹색 젤 했다 특히 경험이 손에, 신뢰할 수 없는 기술을 위한 명망 그것은 쉽게 퍼지, 더럽혀진 젤 몇 밴드와 함께 구성 된 가난한 결과 생산. 이 문제가 블루 기본 페이지19의 소개와 함께, 일부 해결 되었다. BN 버퍼 시스템에서 coommassie 염료를 사용 하 여 보다 강력한 단백질 분리를 합니다. 따라서, BN 페이지 종종 상대 초보자 설정에 대 한 쉽고 더 안정적인 기술 이며 단지 thylakoid 고해상도 분판을 제공할 수 있습니다. 이러한 이유로, BN-페이지는이 분야의 대부분의 작업에 대 한 선택의 방법 되었다. BN-페이지는 일반적으로 그것의 주요 결점은 녹색 젤 전기 이동 법, 보다 실행 속도가 느린 동시 다운스트림 희미 한 엽록소를 포함 밴드, 식별과 방해 coommassie 염료 얼룩이 광 특성화 문제입니다.
기본 젤에서 생 화 확 적인 정보 제공 그리고 분 광 기술에서 데이터와 함께 2D SDS 페이지 크게 강화 될 수 있다. 고용 시스템에 단지를 식별 하기 위해 기본 젤을 사용 하 여 중앙 문제는 식별 도전 수 있습니다 항상 (즉, 단백질 밴드에서 찾을 수 항상 대표 comigrating 단지 또는 구성 요소, 오히려 보다는 하나의 순수 정통 복잡). 분 광 특성 녹색 젤 밴드 안료에 대 한 생물 정보를 제공 하 고 확인할 어떤 유형의 단지 그들은 포함 하는 데 사용 수 있습니다. 엽록소 형광은 종종 극적으로 다른 스펙트럼 및 형광 수명 다른 광합성 안료 단백질 복합물의 특성 때문에 이런 맥락에서 특히 유용 합니다. 간단한 정상 77 K 형광 스펙트럼 네이티브 젤 단지의 정체성 확인에 유용한 있다 역사적으로, 현대 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 훨씬 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. TCSPC 형광 수명에 따라 단지의 특성 뿐만 아니라 수 있습니다 하지만 또한 가능 하 게 내는 스펙트럼 구성 요소 간의 에너지 전달의 자세한 설명. 특성의이 종류는 다양 한 기본 젤 시스템 확산의 사용으로 점점 더 필요 해지고 있다 그리고 새로운 상 상속 단지 발견 더 나은 인증 단백질 복합물의 식별을 허용 하 고 제공 하는 새로운 이 단지 작동 하는 방법에 대 한 생물 정보입니다.
이 문서에서 제공 하는 거의 또는 전혀 경험과 네이티브 젤 전기 이동 법의 빛 반응의 메커니즘을 조사 하기 위해 네이티브 thylakoid 단지의 높은 해상도 달성 하는 데 그 수는 방법 광합성입니다. 이 기본적인 기술은 다음 결과 개선 또는 다른 종에 적용을 확장 하는 실험의 재량에 증강 수 있습니다. 우리는 다음 TCSPC, 기본 분석 및 기술에 의해 제공 하는 데이터의 프레 젠 테이 션에 대 한 몇 가지 단계를 네이티브 녹색 젤 밴드를 쓰는 과정을 설명 합니다. TCSPC 분석 기본 젤 전기 이동 법의 커플링 인증 및 밴드 내에서 단백질 복합물의 생물 특성을 제공 하 여 이러한 젤 시스템의 유틸리티를 확장 합니다. 여기에 설명 된 녹색 젤 시스템 기반으로 개발한 알 렌과 Staehelin17 일부 수정 하 고 슈왈츠 외에 사용 되는 동일 합니다. 20.이 시스템은 많은 중 하나입니다 하지만이 방법론에 대 한 유용한 특정 기능. Thylakoid 절연, 젤 전기 이동 법, 및 TCSPC 분석 편리 하 게 수행할 수 있습니다 하루에 샘플 저장 및 저하의 잠재적인 문제를 만듦으로써 그것은 충분히 빠른. 우리는 또한이 메서드는 결과 우수, 최적화의 정도 따라 좋은 제공 하면서 미숙한 사용자의 손에서 강력한 찾을.
명심 하는 네이티브 젤에 시각 단지 조사 유 기체의 생물학에 뿐만 아니라 사용 하는 세제 및 버퍼 시스템에 중요 하다. 다른 세제와 버퍼 시스템 우선적으로 분리, 단지의 다른 종류 그리고 주어진된 광합성 유기 체는 모두는 어떤 주어진된 상황에서 있을 것입니다, 다른 유기 체에서 다른 단지 것입니다. 여기서 설명 하는 시스템은 슈왈츠 외에 설명 된 대로 PSI 고급의 연구에 특히 적합 합니다. 20, 하지만 그것은 그 PSII 고급 공부에 대 한 스펙트럼의 더 불안정 끝에 떨어진다. Thylakoid 단백질의 네이티브 젤 전기 이동 법에 사용 되는 다양 한 세제 및 버퍼 시스템의 포괄적인 연구를 위해 Järvi 외를 검토 하는 것이 좋습니다. 21 그리고 Rantala 외. 22.

<table><tbody><tr><td>글리신</td><td>시그마</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마</td> <td># 648310</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>데실 말토 시드</td><td>시그마</td><td>D7658</td><td>n-decyl 베타 d 말토피라노 시드, 도데 실 말토 시드 또는 알파 데실 말토 시드가 아닌</td></tr><tr><td>옥틸 글루코 시드</td><td>시그마</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 아미드</td><td>바이오 라드</td><td>161-0148</td><td>37.5/1 C 40% 용액</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P9333</td><td></td></tr></tbody></table>

시금치 기본 그린 젤 전기 이동 법 및 time-correlated 단일 광자 계산을 사용 하 여 밴드 특성화 thylakoid 단백질 복합물의 분리

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

광합성의 빛 반응 thylakoid 막에 안료 단백질 복합물의 시리즈에 의해 수행 됩니다. 산출할 및이 단지의 길고 짧은 시간 비늘 광합성 환경 조건 변화에 적응 하는 프로세스 때문에 매우 동적 이다 (즉, 비-광화학 냉각, 상태 전환 및 장기 응답)입니다. 역사적으로, 이러한 프로세스는 시선 변화 측면에서 설명 엽록소 형광 그리고 분광학 광합성 매개 변수를 모니터링 하는 중요 한 방법에 남아 있다. 제한 된 수의 기본 단백질 복잡 한 역학 구상 될 수 있는 방법 있다. 여기는 고해상도 분리 및 thylakoid 단지, 네이티브 녹색 젤 전기 이동 법의 시각화를 위한 빠르고 간단한 방법에 설명합니다. 이 메서드는 시간 상관 단일 광자 밴드 녹색 젤에 분리의 엽록소 형광 특성의 상세한 묘사에 대 한 계산 된 결합 이다.

녹색 젤 전기 이동 법에 대 한 대표적인 결과 그림 1에 표시 됩니다. 레인 1 시금치 thylakoids, 명확 하 고 날카로운 녹색 밴드의 최대 수를 볼 수 있습니다의 녹색 젤 전기 이동 법에 대 한 이상적인 결과의 예를 제공 합니다. 이러한 결과 다소 불규칙 하 고, 일부 레인 1에서 본 밴드의 모든 정상적으로 주어진된 샘플에 존재 하기 때문에. 추가 샘플 정리, 엽록체 격리 thylakoid 가용 화, 그리고 그라데이션 젤 전기 이동 법 (4-7% 아크릴 아 미드)는 또한 일반적으로 최적의 결과 달성 하는 데 필요한 전에의 형태로. 레인 2와 함께 5% 비 그라데이션 젤 여기 상세한 프로토콜을 사용 하 여 달성 3 현재 더 많은 전형적인 결과 이다. 4, 5, 및 6 차선 증가의 thylakoid 샘플의 가용 화에도 불 쌍 한 결과의 예를 제공 합니다. 레인 7 시금치 대신 애기 thylakoi...

여기 선물이 solubilized thylakoid 단지 네이티브 그린 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 프로토콜. 녹색 젤 밴드는 이후 여 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 특징 및 데이터 분석을 위한 기본 단계 제공 됩니다.

시금치 기본 그린 젤 전기 이동 법 및 Time-Correlated 단일 광자 계산을 사용 하 여 밴드 특성화 Thylakoid 단백질 복합물의 분리

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

이 방법은 정력적으로 연결된 성분을 가진 생리학적으로 실제 복합체인 과 같은 광합성 연구 분야의 특정 주요 질문에 답하는 데 유용합니까? 여기에 설명된 녹색 젤 및 TCSPC 프로토콜의 주요 장점은 빠르고 견고하다는 것입니다. 샘플을 하루 만에 쉽게 처리하고 분석할 수 있으므로 저장 및 안정성 문제가 우려되지 않습니다.TCSPC는 우리가 여기에서 공부한 광합성 시스템에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 액체, 세포 또는 단일 분자 층 및 이온 액체와 같은 새로운 구조 적모의 형광 분자 운동의 연구와 같은 물리적 및 생물학적을 통해 화학물질에 이르기까지 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 스톡 솔루션과 녹색 미니 젤을 준비합니다. 다음으로 얼음을 얻고 조명을 어둡게 합니다.유리 두스균균제제를 사용하여 시금치 잎을 TMK 버퍼의 약 1~2밀리리터로 완전히 균질화합니다. 간단한 필터링 장치를 만들려면 섬세한 작업을 반으로 자르고 분기로 접습니다. 주사기에서 플런저를 제거한 다음 접힌 작업을 지우기 주사기 의 바닥에 포장합니다.파이펫 잎은 작업 닦기 필터의 중심으로 동형, 다음 필터를 통해 균모를 통과하고 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에서 수집 플런저를 사용합니다. 원심분리기는 틸라코이드 멤브레인을 포함한 불용성 물질을 10분 동안 5, 000g 및 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 상체를 버리고 TMK 버퍼의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다.각 샘플에서 엽록소를 추출하려면 50 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 사용하여 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다. 메탄올 950 마이크로리터를 넣고 튜브를 캡으로 만들고 여러 번 반전하여 섞습니다. 10, 000 g에서 10분간 원심분리기는 침전된 단백질을 펠릿합니다.엽록소 농도 측정을 가이드로 사용하여 각 튜브에 동일한 총 엽록소양이 포함될 때까지 필요에 따라 각 샘플에서 일부 부피를 제거하고 폐기합니다. 원심분리기 5, 000g에서 10분간 틸라코이드 멤브레인을 다시 펠렛합니다. 펠릿을 방해하지 않고 모든 상체를 제거하여 제거하십시오.먼저 TMK 30% 글리세롤 세제 용액의 알리쿼트를 해동합니다. 여러 번 반전하여 얼음에 용액을 혼합하고 유지하십시오. 펠릿을 용해하고 밀리리터당 1밀리그램의 최종 엽록소 농도를 초래하기 위해 세제 용액의 적절한 부피를 추가합니다.샘플에서 거품을 피하기 위해 주의하면서 반복적으로 피펫위아래로 피펫. 그런 다음, 틸라코이드 샘플이 용해될 수 있도록 얼음에 샘플을 유지합니다. 용해화가 완료된 후, 10, 000g 및 4°C에서 시료를 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 펠릿시켜 맑고 어두운 녹색 상신화를 생성합니다.그 후, 이전에 준비된 1.5mm 네이티브 젤의 각 웰에 직접 용해화된 틸라코이드 수퍼네티드 15마이크로리터를 적재합니다. 1X 실행 버퍼를 사용하여 100볼트에서 네이티브 그린 젤을 실행하십시오. 저항 가열을 완화하기 위해 실행 기간 동안 젖은 얼음에 전체 젤 탱크를 배치합니다.젤이 가동을 끝나면 전기 전구에서 제거하고 증류수로 젤 플레이트의 러닝 버퍼를 헹구는 다. 젤에서 상단 플레이트를 제거한 다음 증류수로 젤을 헹구습니다. 여전히 하단 유리 판에 있는 젤을 얼음 위에 놓고 젤을 사용하지 않을 때 플라스틱 랩으로 덮고 어둠 속에서 유지하여 건조하지 않도록 하십시오.다음으로, TCSPC 분석을 진행할 준비가 되면 날카로운 메스 나 면도날을 사용하여 각 관심 있는 대역을 소비합니다. 절제된 밴드에 오염 밴드 재료가 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 분석되는 각 복합체에 대해 형광 분광계를 사용하여 600~800나노미터 사이의 실내 온도 형광 스펙트럼을 만듭니다.슬라이드의 양쪽 끝에 마스킹 테이프를 놓고 여러 번 접을 수 있어 스페이서를 생성하여 슬라이드를 압축하지 않고 단단히 고정한 다음 두 개의 유리 현미경 슬라이드 사이에 젤 슬라이스를 샌드위치할 수 있습니다. 유리 슬라이드 가장자리의 젤 슬라이스에 소량의 물을 추가하여 신호 산란을 줄이는 매끄러운 인터페이스를 만듭니다. 다음으로, 빔이 플레이트의 열린 가장자리를 통해 젤 슬라이스를 공격할 수 있도록 빔 경로에 젤 샌드위치를 고정합니다.각 복합체에 대해 형광 방출 스펙트럼에 걸쳐 일정한 간격으로 총 10, 000 개의 총 데이터 포인트를 수집합니다. 주어진 복합체에 대한 데이터를 분석하려면 먼저 수집된 모든 파장에 대해 각 붕괴 곡선의 피크 높이를 정규화한 다음, 꼬리는 각 붕괴 곡선을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 복합체의 정상 상태 형광 스펙트럼과 일치시킵니다. 녹색 젤 전기 포에이션에 대한 대표적인 결과는 맑고 날카로운 녹색 밴드의 숫자가 표시되는 시금치 틸라코이드의 분석을위한 이상적인 결과의 예를 제공합니다.차선 2와 3은 비그라데이션 5% 아크릴아미드 젤에 간단한 틸라코이드 절연 및 전기전도에서 보다 일반적인 결과를 제시합니다. 차선 4, 5, 6은 틸라코이드 샘플의 수용성 하에서 의 증가된 정도의 증가로 인한 불량한 결과의 예를 제공하며, 7차선은 아라비도시스 틸라코이드가 시금치 대신 사용될 때 달성될 수 있는 결과를 보여줍니다. TCSPC 데이터의 데이터 곡선이 동시에 레지스터로 설정된 후 동일한 피크 높이로 정규화되어 곡선을 데이터의 첫 번째 분석으로 비교할 수 있습니다.그런 다음 서로 다른 복합체의 피크 정규화 된 붕괴 곡선을 지정된 파장에서 서로 겹쳐서 복합체 간의 동작 차이를 시각화 할 수 있습니다. 감쇠 곡선을 일치시키는 꼬리는 부패 관련 스펙트럼을 구성할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, LHCII에 대한 부패 관련 스펙트럼은 동적 기능의 부족과 LHCII 형광 스펙트럼의 모양이 시간이 지남에 따라 신호 붕괴와 동일하게 유지된다는 점에 주목할 만하다.형광 스펙트럼의 붕괴도 지연되어 최대 형광에 도달하기 위해 100 pico초가 필요합니다. 이것은 에너지가 형광부패로 복합체 내의 정력적으로 뚜렷한 안료 사이에서 전달되지 않는다는 것을 건의합니다. 그런 다음 붕괴 관련 스펙트럼은 Band 5 복합체에 대해 구성됩니다.LHCII에 비해 밴드 5의 형광은 훨씬 더 빠르게 부패하여 30 pico초만에 최대 강도에 도달한 다음 500 picoseconds 후 초기 강도의 20 % 미만으로 부패합니다. 이 절차를 시도하는 동안, TCSPC 데이터의 해석은 2 DSDS 페이지와 서부 블로팅 또는 질량 분석에 의해, 예를 들어, 연구 중인 복합체의 구성 요소를 식별하는 추가 생화학 정보에 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

separation-spinach-thylakoid-protein-complexes-native-green-gel

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

이 프로토콜은 in vitro에서 광 수확 복합체의 재구성에 대해 자세히 설명합니다. 이러한 일체형 막 단백질은 엽록소와 카로티노이드를 조정하고 고등 식물과 녹조류에서 빛을 수확하는 역할을 합니다.

식물과 녹조류의 빛 수확 단지의 체외의 재구성에

이 프로토콜은 다양한 다운스트림 단백질 분석 기술과 호환되는 이종 샘플의 비공유 생체 분자 어셈블리 및 단백질에 대한 네이티브 분리 기술인 투명 네이티브 겔 용리된 액체 분획 포착 전기영동(CN-GELFrEE)을 준비하고 수행하는 방법을 설명합니다.

CN-GELFrEE - 지우기 기본 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동

프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

선물이 여기 순수 active thylakoids의 높은 수율 격리에 대 한 프로토콜 및 엽록체 트윈 아르기닌 전 (cpTat), 분 비 (cpSec1), 및 신호 승인 입자 (cpSRP) 경로 대 한 단백질 전송 분석 실험.

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

여기에서는 세제 및 Coomassie 청색에 대 한 노출을 최소화 하는 미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체를 추출, 해결 및 식별 하는 프로토콜을 제시 합니다. 이 프로토콜은 분해능과 효소 활동의 보존 사이에 최적의 균형을 제공 하는 동시에 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 잃을 위험을 최소화 합니다.

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

더 많은 단백질의 절반 이상이 전자 현미경 영상과 3 차원 재구성 모두 도전하고 작은 단백질 (분자량 &lt;200 kDa의)이다. 최적화 네거티브 염색 고 대비 및 비교적 높은 해상도 (~ 1 nm의) 다른 생리적 조건 하에서 작은 비대칭 또는 단백질 복합체의 이미지를 얻기 위해 견고하고 높은 처리량 프로토콜이다.

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

5개의 서로 다른 수동 샘플링 장치의 특성화 및 적용에 대한 프로토콜이 제시됩니다.

물에 농약의 모니터링을위한 특성화 및 패시브 샘플러의 응용 프로그램

배우세요 시금치 thylakoid 단백질 복합물을 Native Green Gel 전기 이동법과 Time-Correlated Single Photon Counting으로 분리 및 특성화하는 방법을. 이 기법은 광합성 연구에서 에너지 연결성을 신속하게 분석할 수 있습니다.

시금치 기본 그린 젤 전기 이동 법 및 Time-Correlated 단일 광자 계산을 사용 하 여 밴드 특성화 Thylakoid 단백질 복합물의 분리

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