Name: 대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 배우세요 대장균에서 바이로이드 유래 원형 RNA 발판을 이용한 재조합 RNA 대규모 생산 방법입니다. 이 기술은 비용 효율적인 확장 가능한 RNA 정제 공정을 제공하여 연구 및 산업 응용에 활용됩니다.

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1. 플라스 미드 건설
<ol><li>
PCR에 의해 (또는) 반전 녹음 방송 RNA 서식 파일에서 시작 하는 경우에, PCR에 의해 증폭 식 플라스 미드에 있도록 5' 확장명이 뇌관을 사용 하 여 관심사의 RNA에 해당 하는 cDNA. 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 원치 않는 변이 방지.
	<ol>
<li>깁슨 어셈블리20식 플라스 미드에는 cDNA를 삽입 하려면 다음 5' 확장 PCR 뇌관을 추가: 앞으로, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; 역, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X의 RNA의 터미널 끝에 뉴클레오티드를 동종을 나타냅니다.</li>
		<li>30 품 어 98 ° c, s 10의 30 주기 다음 s 98 ° C, 30에서 55 ° C와 30에서 s s 72 ° C, 및 72 ° c.에서 10 분의 마지막 확장에</li>
	</ol>
</li>
	<li>다이제스트 100 ng의 플라스 미드 pLELVd-BZB 10 U 유형 IIS 제한 효소 Bpi 의 0.5 ml에서 20 µ L 반응에서 37 ° C에서 1 시간을 위한 나 버퍼 G (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 m m MgCl2, 50 mM NaCl에 관 0.1 mg/mL BSA). 참고: 모든 플라스 미드는 해당 저자에 대 한 요청에 사용할 수 있습니다. Bpi 나는 Bbs 나.</li>
	<li>에 태 버퍼 (40 m m Tris, 20 m m 초 산, 1 m m EDTA, pH 7.2)에서 1 %agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR 및 소화 제품을 구분 합니다. 15 분 동안 젤 0.5 µ g/mL ethidium 평범한 사람 200 mL에 떨고 하 여 얼룩. UV transilluminator를 사용 하 여 DNA를 시각화 하 고 증폭 된 cDNA 및 Bpi 나 소화 플라스 미드 (2046 bp) 메스 블레이드를 사용 하 여 해당 하는 밴드를 잘라. 참고: Bpi 내가 pLELVd BZB의 소화는 또한 해당 LacZ 블루 화이트 기자 하 528 bp 상품을 출시 하였습니다.</li>
	<li>실리 카 젤 열 ( 테이블의 자료에 DNA 복구 키트 젤)을 사용 하 여 젤 조각에서 DNAs elute 그리고 spectrophotometric 분석에 의해 DNA 농도 계량.</li>
	<li>깁슨 어셈블리 반응 증폭된 cDNA 및 소화 플라스 미드를 사용 하 여 설정 합니다. 사용 하 여 삽입 벡터 대 20의 3 어 금 니 과잉. 50 ° C에서 1 h incubate 고 실리 카 젤 열 (깨끗 한 DNA & 테이블의 재료에 집중 장치 키트)를 사용 하 여 반응 제품을 정화.</li>
	<li>
Electroporate 관할에 깁슨 어셈블리 반응의 정화 제품을 사용 하 여 대장균 DH5α 셀. 다음 설정을 적용 1 mm electroporation 큐 벳을 사용 하 여: 1500 V 및 catabolite 억제로 슈퍼 최적화 된 국물에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 5 양 품 (SOC; 20 g/L tryptone 5 g/L 효 모 추출 물, 0.5 g/L NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2 20 mM 포도 당, pH 7.0) 액체 매체와 Luria Bertani에 다음 확산 (LB; 10 g/L tryptone 5 g/L 효 모 추출 물, 10 g/L NaCl) 천 (1.5%) 플레이트 포함 50 µ g/mL 암 피 실린.
	<ol>
<li>변환 된 대장균 에 해당 하는 식민지를 위한 화면 클론 가능성이 통합 삽입, electroporated 셀을 도금 하기 전에 15 분 확산 50 mg/mL의 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal)에서 30 µ L dimethylformamide입니다. 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>몇몇 백색 식민지를 선택 하 고 하룻밤 액체 LB 미디어에서 37 ° C에서 성장. 정화는 miniprep를 사용 하 여 플라스 미드 ( 재료의 표참조) 키트와 태 버퍼에 1 %agarose 젤 전기 영동에 의해 그들의 크기를 분석.</li>
	<li>PLELVd-BZB 제어에 비해 전기 이동 마이그레이션에 따라 가장 가능성이 재조합 플라스 미드를 선택 합니다. 뇌관 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3를 사용 하 여 연속 하 여 선택 된 플라스 미드의 순서를 확인 ', 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3'는 전체 식 카세트 pLELVd BZB에 측면. 참고: 이 플라스 미드의 cDNA에 의해 대체 되는 LacZ 표시와 함께 528 bp polylinker 포함 기억 하십시오. 제한 매핑 바로 재조합 플라스 미드를 선택 하는 데 도움이 있습니다.</li>
</ol>2. RNA 식
<ol><li>Co electroporate (1.6에서 조건 참조) 선택 된 대장균 변형대장균 BL21 (BL21 파생)와 pLELVd-BZB-파생 공동 익스프레스에 관심 및 플라스 미드 p15LtRnlSm의 RNA에 해당 하는 cDNA를 포함 하는 가지 tRNA 리가입니다. 대장균 부족 RNase III21, HT115(DE3)를 사용 하 여 긴 더블-좌초 지역 RNAs를 표현. 참고: 모두 RNA 관심과 tRNA 리가의 mRNA 대장균 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 수 있습니다. 이 lysogen의 존재는 아무 해로운 효과 표현 T7 RNA 중 합 효소를 아니 DE3 lysogen 대장균 스트레인에 필요 합니다.</li>
	<li>SOC 액체 매체에서 37 ° C에서 1 시간 배양 후 플레이트 50 µ g/mL 암 피 실린 및 34 µ g/mL 페니 파운드 고체 매체에 electroporated 박테리아. 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	<li>식민지를 선택 하 고 접종 1 L 액체 훌륭한 국물 (TB) 매체의 250 mL를 삼각 플라스 크를 당황 하 게 (12 g/L tryptone 24 g/L 효 모 추출, 0.4% 글리세롤, 0.17 M KH2포4및 0.72 M K2HPO4), 포함 된 50 µ g/mL 암 피 실린 그리고 34 µ g/mL 페니입니다. 180 분당 회전 (rpm)에서 활기찬 동요와 37 ° C에서 품 어. 12에서 16 h 사이의 박테리아 문화 접종 후 수확.</li>
</ol>3. RNA 추출 및 정화
<ol><li>
분석 목적을 위해 원하는 시간 지점에서 문화의 2 mL aliquots 걸릴 하 고 14000 x g 2 분 삭제는 상쾌한에 원심 vortexing에 의해 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 그리고 1 mM EDTA)의 50 µ L에서 세포를 resuspend.
	<ol>
<li>한 볼륨 (50 µ L) 페 놀 (물으로 포화와 pH 8.0 Tris HCl로 pH 8.0에 equilibrated)의 1:1 (v/v) 혼합의 추가 및 클로 프롬. 활발 한 vortexing에 의해 세포를 휴식 하 고 14000 x g에 5 분 동안 원심 분리 하 여 수성 및 유기 단계를 분리.</li>
		<li>조심 스럽게 복구 총 세균 RNA를 포함 하는 수성 단계 (위). 참고: 준비 후속 분석을 위해-20 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대리점에서는 250 mL 원심 병 및 14000 x g 10 분 삭제 상쾌한에 셀 아래로 회전으로 문화를 부 어. 물 30 mL에 resuspending에 의해 세포를 씻어. 원심 분리기 튜브에 전송 및 동일한 조건 하에서 다시 셀 아래로 회전.</li>
	<li>상쾌한 삭제 하 고 vortexing에 의해 착 색 인쇄기 버퍼 (50 mM Tris HCl, 산도 6.5, 150 m m NaCl, 0.2 m m EDTA) 10 mL에 셀을 resuspend. 참고: 이 시점에서 셀 다른 순간 정화 진행-20 ° C에서 냉동 수 있습니다.</li>
	<li>페 놀: 클로 프롬의 1 볼륨 (10 mL)을 추가 하 여 셀을 휴식 신선한 또는 해 동 세균성 준비를 사용 하 여 (단계 3.2 참조) 및 vortexing 적극적으로.</li>
	<li>12000 x g에서 10 분 동안 centrifuge, 수성 단계를 복구 하 고 다시 동일한 조건 하에서 클로 프롬의 1 볼륨 (10 mL) 추출. 참고: RNA 준비는-20 ° C에이 시점에서 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>
또한 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 총 세균 RNA를 정화. 45 µ m 주사기 필터 및 1 mL diethylethanolamine (DEAE) 열 부하를 통해 RNA 준비를 필터링 합니다.
	<ol>
<li>크로마토그래피 정화 1 mL/min의 유량에 액체 크로마토그래피 시스템을 사용 합니다. 로딩 하는 샘플을 하기 전에 equilibrate 크로마토그래피 버퍼의 10 mL와 함께 열 (단계 3.3 구성 참조).</li>
		<li>샘플을 로드 하 고 10 mL 크로마토그래피 버퍼의 열을 씻어. RNA의 차입 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0.2 mM EDTA) 20 mL와 함께 elute 고 1 mL aliquots를 수집 합니다. 참고: RNA는 신속 하 게 초기 분수에서 elutes. 열 추가 담긴 위해 다시 사용 될 수 있습니다. 이 위해, 물 10 mL로 열 세척 하 고 20% 에탄올에 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원형 형태로 대장균 에서 축적 하는 RNA 재조합의 주요 부분부터 동질성12정화에 대 한이 속성 수 있는 이익이 되었다. 2 차원 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (2D 페이지) 비 변성 시키기 (8 M 요소) 조건12,22를 변성 시키기 결합 원형 RNAs는 선형에서 구분 합니다.</li>
</ol>4. RNA 분석
<ol><li>5 %polyacrylamide 젤 준비 (37.5:1 acrylamyde:N, N'-methylenebisacrylamide, 대량 비율) TBE 버퍼 (89 mM Tris, 89 m m 붕, 2 mM EDTA) 포함 8 M 요소에.</li>
	<li>1 볼륨 (20 µ L) 버퍼 (98 %formamide, 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.0025 %bromophenol 파랑 및 0.0025% 자일 렌 cyanol), 로드의 RNA 준비의 믹스 20 µ L 난방 블록에서 95 ° C에 1.5 분 동안 품 어 고 차가운 얼음에 스냅.</li>
	<li>Polyacrylamide 젤에 샘플을 로드 하 고는 전기 이동 법 젤 크기 (예를 들어, 200 V 2 m m 젤 2.5 h x 130 x 140 실행)에 따라 적절 한 조건에서 실행. 0.5 µ g/mL ethidium 평범한 사람에서 15 분 젤 얼룩, 물으로 세척 하 고 자외선에서 RNA를 시각화.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 프로토콜에서 설명 하는 기술 되었습니다 선언 특허 (미국 특허 제 EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

ELVd 시퀀스 및 구조 요구 사항 가지 tRNA 리가 여 인식에 관련 된 연구를 하는 동안 우리 주의 원형 바이로이드의 예기치 않은 큰 축적에 비 호스트 대장균 에 두 분자의 공동 식 세균성 세포19에 양식입니다. 우리가 이해 하는 대장균 에 RNA 바이로이드의 큰 축적 아마 공동 표현 등 상대적으로 작은 매우 안정적인 RNA 분자의 결과 이었다 (333 nt), 높은 기반-결합, 원형 바이로이드, 그리고이 대 한 단백질 특정 바이로이드 높은 선호도 표시합니다. ELVd RNA 감염 된 공장17에 복제 하는 동안 그것의 circularization를 중재 하는 호스트 tRNA 리가 모집 해야 합니다. 비록 우리가 실험적인 확인을 하지 않아도, 우리는 두 분자 ribonucleoprotein 대장균 더 바이로이드의 RNA 안정화 및 박테리아의 리터 당 150mg의 현저한 농도 도달에 복잡 한 형성...

DNA와 단백질, 대조적으로 많은 양의 RNA의 쉽게, 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 프로토콜 풍부 하지 않습니다. 그러나, 연구 및 산업 수요 또는 그들의 독특한 생물 속성1, 조사에 사용할 이러한 생체의 금액을 증가 정교한 매우 구체적인 aptamers로 그들의 사용을 포함 한 바이오 응용 프로그램 2, 치료제3또는 선택적인 농약4. 생체 외에서 전사 및 화학 합성 일반적으로 사용 됩니다 연구에서 RNA를 생산. 그러나, 이러한 방법은 제품의 대용량이 필요한 경우 중요 한 한계를 수반. 논리적 대안 살아있는 세포, 세포 동료 로부터 관심의 RNAs를 분리 하는 정화 과정 뒤의 내 인 성 전사 기계를 사용 하는 것입니다. 이 전략에 따라 방법은 실험실-친화 등의 세균성 세포에서 재조합 RNAs를 생산 하기 위해 개발 되었다 대장균5 나는 해양 보라색 광합성 알파-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. 세균에 재조합 RNA를 생성 하는 대부분의 메서드와 tRNA 또는 관심의 RNA가는 rRNA 삽입7같은 네이티브 매우 안정적인 RNA 발판의 표현에 의존. 이 여분의 RNA의 존재는8다운스트림 응용 프로그램 대 한 문제 경우 공상 분자에서 관심의 RNA를 공개의 필요성을 부과 한다. 재조합 RNA 생명 공학의 또 다른 개념은 재조합 ribonucleoprotein 단지는 원하는 제품 당 있을 수 있습니다 또는 보호 전략으로 관심9, RNA의 안정성을 증가 하는 데 사용의 생산 10. 마찬가지로, 원형 RNAs의 생산 또한 더 안정적인 제품11을 생성 하는 전략으로 제안 되었습니다.
우리는 최근 많은 양의 3 위의 개념에 참여 하는 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 새로운 방법을 개발: 매우 안정적인 원형 RNA 비 계에 대 한 관심의 RNA와의 공동 식의 삽입은 박테리아의 놀라운 금액에 축적 가능성이 복잡 한 안정 되어 있는 ribonucleoprotein를 생산 하는 상호 작용 단백질으로 재조합 RNA 세포12. 이전 개발, 달리 완전히 외계인 대장균, 즉 바이로이드 RNA 발판을 사용 했습니다. Viroids는 매우 특별 한 종류 (246-401 nt) 상대적으로 작은 의해 독점적으로 구성 되는 더 높은 식물의 전염 성 요원의 높은 베이스 결합 원형 RNA13. 흥미롭게도, viroids는 비 코딩 RNAs 그리고, 그들의 자신의 단백질에서 도움 없이, 그들은 감염 된 호스트14에서 복잡 한 감염 주기를 완료 수 있습니다. 이러한 사이클 핵 또는 엽록체, 바이로이드 가족에 따라 RNA RNA 복제 포함-Pospiviroidae 또는 Avsunviroidae각각-감염 된 식물 및 호스트 방어 반응의 회피를 통해 이동. Viroids는 자연, 누드 원형 RNA 되 고 감염 된 식물 세포의 적대 하는 환경에서 생존 하는 것 때문에 가장 안정적인 RNAs 중 평가 해야 합니다. 이 속성 viroids 건설 기계 바이오 접근에 재조합 RNA 안정화에 특히 적합 한 만들 수 있습니다. 또한, 새로운 메서드는 상호 작용 식물 단백질 바이로이드 발판의 공동 식 기반으로 합니다. Viroids는 호스트에 효소 촉매 과정의 다른 단계를 모집 롤링 원 메커니즘을 통해 복제 합니다. 특히 일부 viroids, 좀 더 구체적으로 그 가족 Avsunviroidae15에 속하는 ribozymes 또한 복제에 관련 된 포함 되어 있습니다. 바이로이드 종에 따라 바이로이드 RNAs의 전사는 RNA 중 합 효소 II 호스트나는 chloroplastic 인코딩 핵 RNA 중 합 효소 (NEP)에 의해 중재 됩니다. 바이로이드 RNA 처리 호스트에 의해 촉매 될 것 유형 III RNase, 비록 ribozymes oligomeric RNA와 viroids에서 중간체는 자기 복제 하는 동안 다니엘. 마지막으로, 결과 바이로이드 단위체는 circularized, 바이로이드 가족에 따라 호스트 DNA 리가 1 또는 tRNA 리가16,17의 chloroplastic isoform에 의해. 이 마지막 효소 가지 잠재 바이로이드 (ELVd)18등 가족 Avsunviroidae, viroids의 단위체 형태의 결 찰에 포함 된다.
가지 (지속의 총칭 melongena L.)에 의해 인정을 결정 하는 ELVd의 순서 및 구조 요구를 분석 하는 작업 과정에서 tRNA 리가 우리 대장균 에 두 분자의 공동 식에 따라 실험 시스템 설정 19. 우리 것으로 나타났습니다 그 단위 보다 더 긴 ELVd 증명서 자체 쪼개 효율적으로 임베디드 귀상어 ribozymes 통해 대장균 세포에 결과 바이로이드 단위체와 5'-수 산 기 2', 3'-phosphodiester 테르미니 했다 효율적으로 공동 표현된 가지 tRNA 리가 여 circularized. 더욱, 결과 원형 바이로이드의 RNA 생 rRNAs12의 초과 대장균에서 예기치 않은 높은 농도 도달. 복제 중간체의 부재가 세균 세포에서 ELVd RNA RNA 증폭의 부족을 표시. 흥미롭게도, 바이로이드 분자의 특정 위치에 분리 RNAs의 삽입 원형 바이로이드 파생 RNAs12의 축적에 온건한 영향을 미쳤다. 이러한 관측 우리가 많은 양의 재조합 박테리아에 RNAs 생산 하는 방법을 구상 했다. 이 방법에서는, cDNAs의 RNAs에 해당 ELVd cDNA에 삽입 하 고 결과 공상 RNA 강한 제정 발기인 통해 대장균 에서 표현 된다. 시스템 작동에 대 한 대장균 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드와 변형 될 해야 합니다. ELVd에서 파생 된 단위 보다 더 이상 사본 포함된 귀상어 ribozymes에 의해 처리 되 고 적절 한 테르미니와 결과 단위체는 인식 하 고 공동 표현된 tRNA 리가 여 circularized. 이러한 방법으로, 관심의 RNA 바이로이드 원형 분자의 구성 된 매우 안정적인 원형 발판에 삽입 됩니다. 이 재조합 공상 RNA는 대부분의 아마 더 tRNA 리가와 상호 작용을 통해 복잡 한 ribonucleoprotein의 형성에 의해 대장균 세포 안으로 안정. 이 메서드를 사용 하 여 (프로토콜 아래 참조), RNA aptamers, 헤어핀 RNAs 및 다른 구조화 된 RNAs 쉽게 일반 실험실 조건에서 대장균 문화의 리터 당 밀리 그램의 10의 금액에서 생산 되었고 복용 동질성을 정화 원형12의 장점입니다.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA 중합효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Bpi I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER1011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Conda</td><td>8010</td><td>D1 low EEO</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086,1000</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131008.1214</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1152,0025</td><td>1%</td></tr><tr><td>Zymoclean 젤 DNA 회수</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스</td><td>New England BioLabs</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & 농축기</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Eporator</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Intron Biotechnology</td><td>Ba2014</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Intron Biotechnology</td><td>48045</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Intron Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Duchefa</td><td>X1402.1000</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131785.1611</td><td></td></tr><tr><td>NucloSpin Plasmid</td><td>Macherey-Nagel</td><td>22740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>69387-3</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115(DE3)</td><td></td><td></td><td>Ref. Timmons et al., 2001</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>두셰파</td><td>C 0113.0025</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1211</td><td>87%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131509.1210</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122333.1211</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131020.1211</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Scharlau</td><td>FE04791000</td><td>90%</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3691,1000</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap DEAE Sepharose FF 열</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5055-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTAprime plus 액체 크로마토그래피 시스템</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11001313</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamyde</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1089,1000</td><td>2K</td></tr><tr><td>N,N' -메틸렌비스아크릴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7279-100G</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>PanReac AppliChem</td><td>146392.1211</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2940,1000</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0937,2500</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>B8026-5G</td><td></td></tr><tr><td>크실렌 시안올</td><td>시그마-알드리치</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>N,N&프라임;-비스(아크릴로일)시스타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4929-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 rnas의 대규모 생산

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

RNA 생물학과 정교한 바이오 응용 프로그램에서 RNA 분자의 사용에 대 한 관심 증가, 재조합 RNAs의 다량을 생성 하는 방법을 제한 됩니다. 우리가 많은 양의 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하는 공상 분자의 공동 식에 따라 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, tRNA 리가. Viroids는 상대적으로 작은, 비 코딩, 높은 베이스 결합 원형 RNAs 더 높은 식물에 전염성이 있다. 호스트 공장 tRNA 리가 중재 바이로이드 복제 동안 RNA circularization Avsunviroidae, 가지 잠재 바이로이드 (ELVd), 같은 가족에 속하는 viroids에 의해 보충 하는 효소 이다. 비록 ELVd 대장균에 복제 하지 않습니다, ELVd 전조 대장균 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 효율적 이며 임베디드 귀상어 ribozymes 세균성 세포에 의해 처리 결과 단위체에 의해 circularized는 공동 표현된 tRNA 리가 놀라운 농도 도달입니다. ELVd 비 계에의 한 RNA의 삽입 당 세균성 문화 일반 실험실 조건에서의 재조합 RNA의 밀리 그램 수만의 생산 수 있습니다. RNA 제품의 주요 일부분 이다 원형, 가상 동질성을 재조합 RNA의 정화를 용이 하 게 하는 기능. 이 프로토콜에는 보완 DNA (cDNA)에 해당 하는 관심의 RNA는 사용 되는, 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드 따라 대장균을 변환 하는 식 플라스 미드에 ELVd cDNA의 특정 위치에 삽입 됩니다. 강력한 제정 발기인의 통제 아래 두 분자의 공동 식 대량의 재조합 RNA의 생산 리드. 재조합 RNA 세균 세포에서 추출 하 고 세균성 RNAs의 순환 활용의 대부분에서 분리 수 있습니다.

ELVd 파생 시스템12을 사용 하 여 대장균 에서 재조합 RNA를 생성 하려면 관심의 RNA는 ELVd RNA 비 계에 투입 이다. 이 공상 RNA 가지 tRNA 리가 대장균에 따라 공동 표현 이다. 일단 처리 하 고 죽 습 circularized에서 관심의 RNA 돌출, 공상 원형 RNA 가능성이 세균 세포 ( 에 있는 현저한 농도 도달 공동 표현된 가지 효소와 복잡 한 ribonucleoprotein를 형성 그림 1). 따라서,이 시스템을 사용 하 여 재조합 RNA를 생성 하는 첫 번째 단계는 ELVd 시퀀스 변종 AJ536613에에서 T245-T246 ELVd cDNA의 특정 위치로 RNA에 해당 하는 cDNA를 삽입 이루어져 있다. 플라스 미드 pLELVd-BZB,이 polylinker 포함 된 위치 두 Bpi 로 내가...

여기, 선물이 공동 표현 공상 RNA 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하 여 많은 양의 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜 tRNA 리가. 주요 제품은 동질성을 정화를 용이 하 게 원형 분자 이다.

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

이 방법은 연구 또는 산업에서 응용 프로그램에 대한 관심의 재조합 RNA의 큰 금액을 생산하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 재조합 RNA가 쉽게 확장될 수 있는 저렴한 공정에서 대장균에서 생산된다는 것입니다. 중요한 것은, RNA는 동질성에 대한 정제를 용이하게 하는 원형 RNA 비계에서 생산된다.DNA 또는 단백질과는 대조적으로, 관심있는 RNA는 쉽게 생체 공장 시스템, 이러한 대장균 배양에서 다량에서 생산되지 않습니다. 우리의 방법은 매우 안정적인 원형 비계에 삽입된 관심의 RNA의 공동 발현을 기반으로 하고 RNA 순환화를 중재하는 리구아제를 적용한다. 원형 RNA 스캐폴드는 특허받은 비로이드로부터 유래한다.Viroids는 상대적으로 작은, 비 코일, 일부 높은 식물에 전염 하는 높은 기본 페어링 원형 RNA. 우리는 일반 실험실 조건에서 세균 배양리터 당 재조합 RNA의 수십 밀리그램을 생산할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR로 cDNA를 증폭합니다.다음으로, 플라스미드 pLELVd-BZB의 100 나노그램을 0.5 밀리리터 튜브에 추가합니다. 타입 IIS 제한 효소 BpiI의 10 U를 추가하고 20 마이크로 리터 반응을 만들기 위하여 완충 G의 충분한. 플라스미드를 소화하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.그 후, 전기전구에 의한 PCR 및 소화 제품을 TAE 완충제에서 1% 아가로즈 젤로 분리한다. 밀리리터당 0.5 마이크로그램의 농도로 200 밀리리터 에티듐 브로마이드에서 젤을 흔들어 서 젤을 얼룩지게 합니다. UV 트랜틸루미네이터를 사용하여 DNA를 시각화합니다.메스를 사용하여 증폭된 cDNA 및 BpiI 소화 플라스미드에 해당하는 밴드를 잘라냅니다. 실리카 젤 컬럼을 사용하여 젤 조각에서 DNA를 엘테합니다. 분광측정 분석을 통해 DNA의 농도를 정량화한다.증폭된 cDNA와 소화된 플라스미드를 사용하여 깁슨 어셈블리 반응을 설정합니다. 1 시간 동안 섭씨 50도에서 배양하십시오. 그런 다음 실리카 젤 컬럼을 사용하여 반응을 정화합니다.유능한 E.coli DH5-알파 세포를 전기화 한 후 여러 개의 흰색 식민지를 선택하고 액체 LB 배지로 옮기습니다. 하룻밤 사이에 식민지를 섭씨 37도에서 키우겠습니다. 다음으로, 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드를 정화하고, TAE 버퍼의 1% 아가로즈 젤로 전기전도로 크기를 분석합니다.첫째, 선택된 대장균 균주를 관심의 RNA및 플라스미드 P15LTRNISM에 대응하는 cDNA를 포함하는 pLELVd-BZB 유도체를 모두 사용하여 원간 tRNA 리구아제를 공동 발현한다. SOC 액체 배지를 전기기큐벳으로 이송하여 세포를 회수하고, 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다. 그런 다음, 밀리리터 암피실린 당 50 마이크로그램, 밀리리터 클로람페니콜 당 34 마이크로그램을 함유한 LB 고체 배지에 박테리아를 플레이트.하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오. 다음 날, 액체 결핵 매체의 250 밀리리터를 추가, 포함 50 밀리리터 암피실린 당 마이크로 그램, 그리고 34 밀리리터 클로람페니콜 당 마이크로 그램, 한 리터 당황 에를렌 마이어 플라스크에. 배양 된 대장균을 검색 한 다음 식민지를 선택하고 플라스크에서 매체를 접종하십시오.박테리아를 수확하기 전에 180 RPM에서 180 RPM에서 활발한 흔들림으로 섭씨 37도에서 배양하십시오. 수확한 E.Coli 배양을 250밀리리터 원심분리기 병에 붓고 14, 000 G에서 10분간 세포를 회전시합니다. 상체를 버리고 30 밀리리터의 물에 세포를 다시 중단하십시오.이 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 이전 조건을 사용하여 세포를 다시 회전시합니다. 상체를 버리고 세포 펠릿에 크로마토그래피 버퍼 10 밀리리터를 추가합니다. 소용돌이버퍼의 셀을 다시 일시 중단합니다.페놀의 부피를 1부더라: 클로로폼과 소용돌이를 적극적으로 추가하여 세포를 깨뜨린다. 그런 다음 12, 000 G에서 원심분리기를 10분 동안 사용할 수 있습니다. 수성 상회복, 클로로폼 1부, 소용돌이를 적극적으로 추가한다.12, 000 G의 원심분리기는 10분 동안. 그 후, 45마이크로미터 주사기 필터를 통해 RNA 제제를 필터링한다. 액체 크로마토그래피 시스템에 연결된 1밀리리터 디틸 에탄올 아민 컬럼을 사용하여 RNA를 정화합니다.유량을 분당 1밀리리터로 조정하고 크로마토그래피 버퍼 10밀리리터로 컬럼을 상형화합니다. 그런 다음 샘플을 로드하고 크로마토그래피 버퍼 10 밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 용출 완충제의 20 밀리리터로 RNA를 엘테우고, 1밀리리터 알리쿼트를 수집합니다.2차원 폴리아크릴아미드 젤 전기포레시스를 사용하여 원형 RNA를 선형 과대 분리합니다. 먼저 TBE 버퍼에서 5% 폴리아크릴아미드 젤을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 8개의 어금니 우레아를 함유한다. RNA 제제의 마이크로리터 20개를 한 부적버퍼로 혼합합니다.난방 블록에서 섭씨 95도에서 1.5분 동안 배양한 다음 얼음위를 식힙니다. 폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 적재하고 겔 치수에 적합한 조건에서 전기포고를 실행한다. 그 후, 젤을 밀리리터 에티듐 브로마이드당 0.5 마이크로그램으로 15분간 염색합니다.스테인드 젤을 물로 씻은 다음 UV 빛 아래에서 RNA를 시각화합니다. 다른 cDN이 삽입되는 여러 재조합 플라스미드의 전기 전광 분석은 pLELVd-BZB에 비해 다른 마이그레이션을 보여줍니다. pLELVd-BZB는 관심있는 RNA에 대응하는 cDNA로 대체되는 lacZ 마커를 포함하므로 마이그레이션은 삽입 된 cDNA의 크기에 따라 다르지만 재조합 플라스미드는 일반적으로 제어 플라스미드보다 빠르게 마이그레이션됩니다.공동 전극성 세균 배양에서 재조합 RNA의 생산은 세포를 파괴하고 PAGE를 분해하여 RNA를 분석함으로써 모니터링된다. 관심있는 다른 RNA가 삽입 된 빈 ELVd 및 키메라 ELVd 형태에 해당하는 강력한 밴드를 볼 수 있습니다. 흥미롭게도, 재조합 RNA의 주요 분수는 원형 형태로 볼 수 있습니다.주요 분획의 원형은 높고 낮은 이온 강도에서 데마포링 조건하에서 두 개의 PAGEs의 조합을 사용하여 관찰된다. RNA 제제는 애니온 교환 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다. 여기에서 볼 수 있듯이, 대장균 RNA는 낮은 이온 강도에서 효율적으로 유지되고, 그 후에 높은 이온 강도에서 용출되고, RNA의 대부분은 분수 2 및 3에서 집합되는.재조합 RNA는 2-D 전기포진에 의해 균질성으로 더 정제될 수 있다. 이 프로토콜을 통해 대장균에서 다량의 재조합 RNA를 쉽게 생산하고 최종 제품의 순환성 덕분에 균일성으로 정제할 수 있습니다. 식물 viroid에서 파생 된 원형 RNA 스캐폴드에 내장 된 관심 결과의 RNA를 기억하십시오.두 moieties를 분리하려는 경우, 작은 RNA가 더 큰 것보다 더 높은 양으로 생산될 가능성이 높기 때문에 리보지메, DNAzymes 또는 RNase H.와 같은 표준 전략을 사용해야 합니다. 더 큰 규모의 표현의 경우, 박테리아를 수확하는 최적의 시간은 E.Coli 균주, 배양 배지 및 성장하는 조건을 포함한 많은 요인에 달려 있다는 것을 고려하십시오. 특정 조건에서 최적의 생산 창을 찾기 위해 예비 시간 과정 분석방법을 권장합니다.재조합 RNA는 일시적으로 세균 세포에 축적되고, 그(것)들은 완전히 늦게 성장하는 단계에서 사라다는 것을 기억하십시오.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

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선형 공유 결합(LCC) DNA 미니 벡터(DNA ministring)는 높은 transfection 효율을 제공하는 비바이러스 유전자 전달 벡터이며 모든 DNA 전달 응용 분야와 관련이 있습니다. 생산 시스템은 간단하고 빠르며 in vivo에서 확장 가능합니다. 다음 프로토콜은 DNA 미니스트링 생산을 위한 시각적 단계별 지침을 제공합니다.

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이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

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대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

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