Name: Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 배우세요 Drosophila 시각 시스템에서 저풍부 세포를 FACS로 정화하는 방법을. 파파인 소화와 형광 활성화 세포 분류를 활용하여 전사체 및 게놈 분석을 위한 효율적인 세포 분리가 가능합니다.

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이 연구는 NINDS의 보너스 번호 K01NS094545, 신경 퇴행 성 질환의 연구에 대 한 Lefler 센터에서 andgrants에서 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다. 우리 인정 Liming 탄 제이슨 McEwan 귀중 한 대화 합니다.

1. 실험 전에 계획
<ol><li>
시작 하기 전에 실험, 유전학 특별히 원하는 셀을 예상 대로 작동 하는 경우 확인 하는 소규모 파일럿 실험을 수행 합니다.
	<ol>
<li>첫 번째 패스, 사용 immunohistochemistry와 가벼운 현미경을 원치 않는 셀으로 표시 됩니다. 이상적으로, 유전자 표시는 망막과 시 엽 (그림 3) 내에서 특정 있을 것입니다. 만 광 엽 세포 분리에 사용 되 고 중앙 두뇌에 라벨 그래서 문제가 되지 않습니다. 동시에 관심의 셀 수는 뇌 당 표시 결정 합니다.</li>
		<li>유전 상표는 수행 하는 경우 셀의 순수한 인구를 확인 하는 파일럿 FACS 실험 (그림 4) 원하는 특이성 reproducibly 고립 될 수 있다 그리고 또한 관심의 셀 수를 평가 하기 위해 격리 될 수 있습니다 각 두뇌에서. 필요한 경우, 풍부를 결정 하기 위해 정량 PCR 통해 격리 된 세포의 순도 또는 덜 농축 특정 유전자의 평가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
십자가 실험에 대 한 자료의 원하는 금액을 얻는 데 필요한 수를 결정 합니다. 참고: 실험 경험에 따라, 붙일 레이블 셀 ~ 17-25%가이 프로토콜을 지속적으로 격리 되며 높은 품질 RNA 시퀀싱 데이터에서 1000 FACS 정화 셀 (적은 세포는 충분 한 있을 수 있습니다) 몇 가지 얻을 수 있습니다.<ol>
<li>RNA-seq 분석에 대 한 1000 셀을 붙일 뇌 (20 셀 광 엽 당) 당 표시의 적어도 40 셀 인지 확인 합니다. ~ 10 관심사의 세포는 뇌, 당 정화 한다 그래서 100 머리를 해 부.</li>
		<li>각 실험에서 해 부에 발달의 적절 한 단계에서 100 ~ 파리를, (이 부모님의 genotypes 따라 달라 집니다) 분산에 대 한 선택 ~ 100 십자가 사용 합니다. 파리는 관심의 대립/transgenes homozygous 적은 십자가 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>세포 건강을 극대화 하 고 유전자 발현 및 게놈 조직 두뇌는 해 부, 하지만이 조정 될 수 있다 후에 발생할 수 있는 일반적인 변경 최소화 1 h 절 개 창을 제한 합니다. Dissectors는 dissectors의 기술에 따라 1 시간에 100 머리를 해 부 하는 데 필요한 수를 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 비행 일
참고: 파리는 제기 25 ° C ~ 50% 습도 별도로 명시 하지 않는 한. 암컷의 유전자 형을 아래 표시 됩니다 유전자 F, 그리고 수 컷의 유전자 형 m.
<ol><li>
주식을 확대
	<ol>
<li>젊은 파리 (아무 이상 유전자 F와 오래 된 주)의 100 ~ 병 및 유전자 형 M ~ 30 튜브를 얻을.</li>
		<li>주 1 일 신선한 식품에 유전자 F 100 튜브를 플립. 금요일에 starting, 주 2의 화요일을 통해 매일 튜브를 플립. 이러한 6 넘겼습니다 처녀를 수집에 사용 됩니다. 또한 수요일에 주 2, 신선한 식품에 유전자 형 M의 파리를 플립 하 고 부모 주 2의 금요일에 취소 키를 누릅니다. 이러한 튜브는 남성 십자가 대 한 수집에 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
처녀를 수집
	<ol>
<li>주 3 월요일부터 유전자 F 튜브에서 처녀를 수집 합니다. 2-3 회 하루를 수집 하 고 18 ° C ~ 50% 습도 처녀를 저장. 주 4의 화요일을 통해 매일 반복. 이후 그들 중 많은 다이, 가능한 많은 처녀 수집 하이 좋습니다 십자가 설정 하기 전에. 일반적으로, ~ 2500 처녀 100을 수집 한다 십자가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
십자가 설정
	<ol>
<li>주 4 일에 유전자 f 15 처녀와 십자가 (일반적으로 실험 당 100-200 십자가)의 원하는 숫자와 각 교차에 대 한 유전자 형 M의 7 남성을 설정 합니다. 그대로 날개를 가진 젊고 건강 한 남성을 사용 하 여 매우 중요 하다.</li>
		<li>플립 십자가 주 5 토요일 일요일부터 매일. 죽은 파리가 발견 되 면 신선한 처녀 또는 남성 십자가 보충. 그것은 밖으로 건조에서 음식 방지, 그래서 필요에 따라 튜브를 물 필수적 이다. 마른 음식을 크게 수익률을 줄일 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FACS 정렬에 대 한 부정적인 제어
	<ol>
<li>표시 되 고 원하는 셀 없이 부정적인 컨트롤 포함 FACS 정렬. 이상적으로, 부정적인 제어 있어야 합니다 (예: UAS GFP) 기자 하지만 하지 드라이버 (예: GAL4), 기자 (UAS-구문 "새" 수)의 기초 식 게이팅 FACS 정렬에 대 한 적절 한 설정에 결정 될 수 있다 그래야. 실험 파리와 동시에 부정적인 컨트롤에 대 한 파리를 대칭 이동 하 고 같은 방식으로 그들을 무대.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
준비 번데기
	<ol>
<li>번데기 개발 (예: puparium 대형 [h APF] 후 40 h), 스테이지의 특정 단계에서 세포를 수집 1 h 기간에 맞게 1 h 시간 창에 pupae 해 (위에서 설명한)에 대 한 할당. FACS 셀 분리 해 후 발생 하 고 40 분 후 직접 수행 되어야 한다. 따라서, 준비와 해의 정확한 시간 FACS 가용성에 의해 결정 됩니다.</li>
		<li>특정 시간에 주 6 일 무대에서 40 h APF pupae를, (예를 들어, 오후 5 시) pupae 40 h 후 해 부를 (예를 들어, 수요일에 오전 9). 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 부드럽게 백색 사전 pupae를 선택 하 고 미리 데워 진된 튜브에 벽에 그들을 배치. 만 원하는 유전자와 번데기를 선택 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
생물 복제
	<ol>
<li>각 실험에 대 한 적어도 3 생물 복제를 할. 간단한 방법으로 같은 십자가 사용 하 여 같은 주 (주 6)에 세 번 실험을 반복 합니다. 예를 들어, 화요일 및 수요일, 두 번째 및 세 번째 복제에 대 한 pupae 각각 무대. 각각 목요일 및 금요일 이러한 pupae를 해 부.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 샘플 준비
참고:이 프로토콜에 사용 된 모든 시 약은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
<ol><li>해 및 조직 분리에 대 한 솔루션을 준비
	<ol>
<li>분해 효소 혼합 재고 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조) ddH2O 26 Wünsch 단위 (우)의 농도에 동결 건조 된 효소를 재구성 하 여 / mL. 260 우 (큰 병)를 포함 하는 유리병, 유리병, ddH2O의 10 mL를 추가할 및 단일 사용 aliquots (4.2 µ L은 분리 당 필요)를 확인. -20 ° c.에 게 재고 솔루션 각 실험 두 샘플 (부정적인 제어 및 실험 조직)의 분리를 요구 한다.</li>
		<li>Rinaldini의 솔루션 (RS)와 완전 한 슈나이더의 미디어 (CSM) x 10 (월요일의 주 6) 해 부 하기 전에 하루를 준비 합니다. 각 것에 대 한 CSM의 5 mL 및 RS x 1의 약 5 mL 2 샘플의 분리에 대 한 CSM의 5 mL을 준비 (부정 제어 실험). 4 ° C에서 한 달 최대 10 x RS 및 CSM 주일 4 ° C에서 저장 합니다.<ol>
<li>준비 하려면 10 x rs 100 mL, NaCl, KCl, NaH2포4, NaHCO3 및 ddH2O 250 mL 비 커 100 mL에 포도의 1 g 1 g의 50 밀리 그램의 200 mg의 8 g을 분해. 필터는 0.22 m m 필터와 소독.</li>
			<li>DdH2O는 microtube 1 mL를 L Glutathione의 20 밀리 그램을 추가 합니다.</li>
			<li>업체인 CSM의 50 mL를 준비 하려면 추가 열을의 5 mL 비활성화 소 혈 청 인슐린 솔루션 10 mg/mL의 0.1 mL, 200 m L-글루타민 솔루션 m의 5 mL, L-티, 20 mg/mL의 12.5 μ 그리고 페니실린-스 솔루션 (5000 단위의 페니실린과 스의 5 mg의 1 mL / mL) 38.9 ml 슈나이더의 미디어의. 필터는 0.22 m m 필터와 소독.</li>
			<li>RS 작업 솔루션 x 1을 ddH2O 10 x RS 희석. 각 샘플에 대 한 비 접착제 microtubes에 1 x rs 500 μ를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>물 욕조에 설정 하 고 37 ° c.에 온도 설정 온도 온도계를 사용 하 여 정확 하 게 다는 것을 확인 하십시오. 물 목욕 papain 활성화 전에 정확한 온도에 있어야 합니다. 아침 해 부 하기 전에 저녁 온도 설정 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Papain과 분해 효소 준비 혼합 참고: 모든 분리 하기 전에 신선한 papain 솔루션을 확인 합니다.<ol>
<li>화요일에 주 6 약 45 분에 해를 시작 하기 전에, 4 ° C에서 papain 분말의 1 유리병을 검색 하 고 실 온에서 품 어. 또한 papain 분말에 추가 나중에 실 온에서 Eppendorf 관에 CSM 정해.</li>
		<li>해의 시작에 앞서 분 실내 온도 CSM 유리병 (뚜껑)를 통해 직접 papain의 추가 하는 농도 100 단위/mL을 주사기를 사용 하 여 (각 유리병에 분말의 양을 약간 다르다;는 유리병 포함 123 단위 추가 1.23 m 업체인 CSM의 L)입니다. 혼합, 먼저, 뚜껑의 안쪽에 붙어 있는 분말을 잡으려고 유리병을 반전 하 고 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.</li>
		<li>물 목욕에서 37 ° C 물 들어 있는 비 커에 유리병을 추가 합니다. Papain 솔루션의 유리병 부동 하지 있는지 확인 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 papain 활성화</li>
		<li>Papain는 물 목욕에서 비 커를 추가한 후-20 ° C에서 분해 효소 혼합 (26 우/mL)의 약 수를 검색 하 고 실 온에서 품 어. 정품 인증의 30 분, 후 실 온에서 papain를 품 어.</li>
	</ol></li>
	<li>╂
	<ol>
<li>주 6 일 깨끗 한 집게와 차가운 CSM에 준비 된 번데기 두뇌를 해 부 고 광 엽과 중앙 두뇌의 교차점에 곤란 하 여 시 돌출부를 잘라.</li>
		<li>(한 microtube 실험 조직에 대 한)와 부정적인 제어 조직 한 1 x rs 500 μ를 포함 하는 microtube 하단에 돌출부를 추가 합니다. 얼음에 튜브를 항상 유지.</li>
		<li>1 시간에 최대한 많은 돌출부를 해 부. 부정적인 통제 조직 10 돌출부는. 수영장은 microtubes 사이의 전송 중 조직 손실 제거 하는 단일 microtube로 광 엽 해 부.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 분리
	<ol>
<li>돌출부를 커버 하기에 충분 한을 떠나 P200 피 펫을 사용 하 여 해 부 시 돌출부와 1 x RS는 microtube부터 조심 스럽게 제거 합니다. 신중 하 게 두뇌를 가능한 조금 방해 되므로 튜브의 측면에 1 x rs 500 μ를 추가 합니다. 얼음에 튜브를 항상 유지.</li>
		<li>돌출부는 바닥에 정착 하자. 그냥 한 번, 200 μ를 채택 하 고 혼합 플라스틱 (돌출부 주위에 이동 한다). 다시 정착 하는 돌출부를 하자.</li>
		<li>두 개의 샘플 (실험 및 부정적인 제어)의 aliquot 600 μ는 microtube로 실내 온도 papain 활성화. 실내 온도 분해 효소 혼합의 4.2 μ 0.18 우/mL의 최종 농도를 600 μ papain 솔루션에 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합. 이것은 분리 솔루션 이다.</li>
		<li>조심 스럽게 각 샘플에서 1 x RS를 제거 하 고 돌출부를 분리 솔루션의 300 μ를 추가. 25 ° C, microtube thermomixer에 15 분 동안 1000 rpm에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>5, 10 분 시간 포인트에서 thermomixer 및 돌출부는 microtube의 바닥에 싱크 하자 중지. 혼합 솔루션 및 밖으로 피펫으로 200 μ를 차지 합니다.</li>
		<li>15 분 후 돌출부는 바닥에 정착 하 고 돌출부 (하려고 하지 방해 하는 돌출부)에서 조심 스럽게 분리 솔루션을 제거 하자.</li>
		<li>1 x RS 두 번 씻어. 이렇게 하려면 신중 하 게 추가 500 μ 1 RS (하려고 하지 돌출부를 방해) x. 혼합 하려면, 200 μ를 피펫으로 부드럽게 다음 피펫으로 microtube에 밖으로. 돌출부는 바닥에 침 몰 하 고 반복 하자.</li>
		<li>각 샘플 (이전 단계와 동일) CSM의 500 μ로 두 번 씻는 다.</li>
		<li>조심 스럽게 업체인 CSM을 제거 하 고 관에 CSM의 또 다른 200 μ를 추가 합니다. 솔루션은 균질 성까지 거품, 없이 아래로 pipetting으로 조직 방해 P200 피 펫을 사용 하 여 (즉, 더 이상 볼 수 조직의 잔해).</li>
		<li>얼음에 5 mL FACS 튜브에 세포 현 탁 액 30 μ m 메쉬 모자를 통해 필터링 (는 P200 사용 하 고 전체 서 스 펜 션 통과 있는지 확인). 분리 microtube 린스에 CSM의 또 다른 500 μ를 추가 하 고 솔루션 FACS 관으로 필터링.</li>
		<li>신중 하 게 FACS 튜브의 모자를 벗고, 아래는 p 200와 메쉬 필터 솔루션을 수집 하 고 FACS 튜브에 서 스 펜 션의 나머지를 추가. 샘플은 FACS에 대 한 준비가 되었습니다.</li>
		<li>FACS 정화 셀 준비를 사전에 수집에 대 한 microtubes를가지고 해야 합니다. RNA-seq, RNA 정화 키트에서 실내 버퍼 (세포의 용 해 버퍼)의 300 μ를 포함 하는 microtubes에 직접 각 샘플에서 셀 정렬 (1: 100 2-사용 하기 전에 Mercaptoethanol 추가).</li>
	</ol></li>
	<li>FACS 정렬 참고: 분리, 후 즉시 FACS (최대 1 시간)에 의해 셀 정렬. 있는지 확인 하십시오 책 FACS 세션에 따라 실험을 위해 계획할 때. 셀 정렬 100 μ m 노즐 크기 일반적으로 사용 됩니다.<ol>
<li>부정적인 제어 및 정렬에 대 한 게이트 설정 실험 샘플 셀 분포를 비교 합니다. 이상적으로, 파일럿 FACS 실험에서 게이팅 설정 하며 부정적인 컨트롤 샘플 확인 또는 미리 설립 게이팅의 미세 조정 제공할 것입니다. 관심의 셀 배경 셀 부정적인 제어 및 실험 샘플 (그림 4)에 존재 하는에서 잘 분리 되어야 한다 (파일럿 실험에서 이것을 테스트).</li>
		<li>준비 된 컬렉션 튜브에서 정렬된 셀을 수집 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA 정화
	<ol>
<li>후 실내 버퍼, 아래로 세포를 lyse을 피펫으로 300 μ에 직접 셀을 정렬 합니다.</li>
		<li>동물 및 정화를 사용 하 여 인간의 세포에서 총 RNA의 정화의 표준 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트 열에 DNA 소화7( 재료의 표참조). RNase 무료 물 20 μ에 RNA elute</li>
		<li>액체 질소와-80 ° c.에 게 RNA 샘플을 동결</li>
		<li>각 실험에 대 한 제어 및 실험 조건에 대 한 최소 3 복제를 수행 합니다. 동시에 모든 샘플에 대 한 cDNA 라이브러리를 준비 하 고 기술 변화에 대 한 제어를 같은 흐름 셀에 모든 샘플을 실행할. 일단 모든 RNA 샘플 준비가 속도 vac를 사용 하 여 2-5 μ (각 샘플)을 볼륨을 줄이기 위해.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 준비 cDNA 라이브러리 및 스마트 seq2에 의해 시퀀싱
참고: 기술 변화를 최소화 하기 위해 모든 cDNA 라이브러리를 동시에 만들고 동일한 흐름 셀에서 시퀀스.
<ol><li>스마트 seq217 다음 수정 제외에 대 한 표준 프로토콜에 따라 cDNA 라이브러리를 집중된 RNA의 1.5 μ의 입력을 사용 하 여: 다른 고 충실도 PCR 마스터 PCR를 위해 ( 재료의 표참조)를 혼합 사용 증폭; 열에 PCR 정화를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 자석 구슬 대신 ( 재료의 표참조)을 키트.</li>
	<li>스마트 seq2 프로토콜 tagmentation 후 반전 녹음 방송으로 최종 농축 PCR 단계 후 PCR 사전 증폭 단계를 포함합니다. PCR 확대 주기의 수 입력된 물자의 풍부에 따라 다릅니다. 입력으로 1000 셀, 일반적으로 사용 하 여 PCR 증폭을 사전 단계에서 15 주기 및 12 사이클 최종 농축 PCR 단계에 대 한.</li>
	<li>라이브러리를 풀 고 단일 흐름 셀 (예를 들어, NextSeq 플랫폼)에 순서.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜은 간단 하 고 실행 하기 기술적으로 곤란 하지 하지만 여러 주요 단계는 것을 간과 하는 경우는 세포의 수율에 상당한 감소를 일으킬. (2.3.2 단계입니다.) 그것은 중요 한 십자가 건강 한, 그리고 음식을 밖으로 건조 하지 않습니다. 십자가의 정규 급수는 바로 유전자 형의 올바른 개발 단계에서 해 부에 사용할 수 있는 파리의 수를 최대화 하려면 필수적입니다. 얼마나 자주 급수 할 필요가 십자가 사용 음식과 파리의 주택 조건에 따라 달라 집니다. 십자가 밖으로 건조 하지 않습니다 있도록 검토 튜브 하루에 두 번 하 고 그에 따라 물을 추가. (단계 3.3입니다.) 그것은 또한 단일 microtube 자신의 microtube를 사용 하 여 각 것 있고 그 이후에 샘플 풀링 반대 분리 하는 데 사용으로 해 부 머리를 합동 하는 것이 중요. 이 전송 될 수 있는 microtubes 사이 잃어버린 어떤 두뇌를 제거 합니다. (단계 3.4.9입니다.) 때 수동으로 조직 방해를 위아래로 pipetting, 조직의 아무 나머지 ...

Drosophila 시각 시스템 개발 및 행동의 유전 기초 공부에 대 한 뛰어난 모델입니다. 그것은 특정 세포 유형2,3를 조작 하기 위한 고급 유전자 툴킷 진부한 세포질 건축1 구성 되어 있습니다. 이 시스템의 주요 힘이 자율적으로 유전자 기능 유전 모자이크 방법4,5를 사용 하 여 단일 셀 해상도 셀 형식에는 기능입니다. 우리 셀 형식별 transcriptomic 수행을 다음 세대 시퀀싱에 최근의 진보와 함께 이러한 유전적 도구를 결합 하 고 유전 모자이크 실험에서 복제 하는 단일 셀에 게놈 분석.
이 위해 선택적으로 두뇌에 있는 낮은 풍부한 세포 인구를 분리 하는 강력 하 고 효율적인 방법을 개발 필수적 이다. 이전에 우리는 FACS, 번데기 개발 동안 시각적 시스템에서 특정 세포 유형을 분리 하 고 RNA-seq6을 사용 하 여 그들의 transcriptomes 결정에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 이 실험에서 특정 유형 (예: R7 대뇌)의 세포의 대부분 붙일 표시 했다. 유전 모자이크 실험, 어떤 점에서 동일한 유형의 셀의 하위 집합만 표시 됩니다,이 메서드를 사용 하 여 우리 품질 시퀀싱 데이터를 얻기 위해 충분 한 세포를 분리 하지 못했습니다. 이 해결 하기 위해 우리 셀 분리 프로토콜을 개선 하 여 세포 수확량 증가 하고자 했다.
우리의 접근 방식은 천연된 셀의 건강 극대화, 해 부 및 분리 버퍼를 변경 하 여 세포 건강을 개선 하는 프로토콜의 총 길이 감소 하 고 해 부 조직에 기계적 장애의 양을 줄일 것 이었다. 우리는 repressible 셀 표식5 (MARCM), 단일 붙일 클론 야생 타입 또는 돌연변이의 유전자에 대 한 특정 세포 유형의 분류의 생성 수 있는 모자이크 분석을 사용 하 여 향상 된 프로토콜7 테스트는 그렇지 않으면 heterozygous 비행입니다. 어디, 동일한 조건 하에서 우리의 이전 프로토콜 시퀀스 (seq) RNA에 대 한 충분 한 자료를 생성 하지 못했습니다, 향상 된 프로토콜은 성공적 이었다. 우리 reproducibly 높은 세포 수확량 (레이블이 지정 된 셀의 25%)를 달성 하 고 약간 1000 셀7에서 고품질 RNA-seq 데이터를 가져오는.
여러 프로토콜 이전 초파리6,8,9,10,11,,1213 에 특정 세포 유형을 설명 되었습니다. , 14 , 15 , 16. 이러한 프로토콜은 대부분 뇌 내에서 풍부한 셀을 격리 하기 위한 것. 우리의 프로토콜 FACS를 사용 하 여 후속 transcriptomic 및 게놈 분석에 대 한 시각적 시스템에서 낮은 풍부한 세포 인구 (100 개 미만의 세포 뇌 당)를 분리 하는 데 최적화 되어 있습니다. 우리 reproducibly FACS 및 RNA이 고품질 transcriptome 데이터 취득에 의해 비행 시각 시스템에서 낮은 풍부한 세포를 분리 하는 방법을 제공을 목표로이 프로토콜

<table><tbody><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>단백질 분해 효소 혼합물</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S5761</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타티온</td><td>시그마-알드리치</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 혈청</td><td>시그마-알드리치</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 솔루션</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Culture Medium</td><td>Gibco</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>RNA 정제 키트</td></tr><tr><td>RNase-free DNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Life Technologies</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>베타인 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-fidelity 2x Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 라이브러리 준비 키트</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 시험관</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Bottle-Top 진공 필터 시스템</td><td>Corning</td><td>CLS431153</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 염기서열분석 시스템</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td></td></tr></tbody></table>년

drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

다음 세대 시퀀싱의 감도에 최근 개선 세포의 작은 숫자 transcriptomic 및 게놈 분석의 적용을 촉진 했습니다. 다양 한 셀 형식 관련 유전자 도구를 자랑 하는 초파리 시각 시스템 개발 연구를이 기술을 활용 하 여 정확한 세포 해상도와 개발의 분자 기초를 해결 하기 위한 강력한 접근 방식을 제공 합니다. 이러한 접근 가능 하, 그것은 안정적이 고 효율적으로 정화 세포는 두뇌 내의 낮은 풍부에서 존재 하는 능력을 중요 하다. 여기, 우리는 유전 모자이크 실험에서 단일 세포 클론의 효율적인 정화를 허용 하는 방법 제시. 이 프로토콜 우리가 지속적으로 달성 셀룰러 고수익 정화 형광을 사용 하 여 정렬 (FACS) (모든 레이블이 지정 된 셀의 25%), 세포를 활성화 하 고 성공적으로 단일 세포 클론 통해 생성에 transcriptomics 분석을 수행 후 repressible 셀 표시 (MARCM)와 함께 모자이크 분석. 이 프로토콜은 transcriptomic 및 게놈 분석에 적용 특정 세포 유형 시각 시스템에서 다른 유전자 조작의 맥락에서 개발의 다른 단계에 걸쳐 이상적 이다.

일반적인 계획 프로토콜의 일반적인 체계는 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜 세 가지 주요 부분으로 나누어져: 작업, 샘플 준비, 시퀀싱 및 데이터 분석. "실험 전에 계획" 세션 프로토콜의 편의상 일반적인 계획에 포함 되지 않습니다.
타임 라인 (비행 작업 및 샘플 준비) 프로토콜의 주요 부품의 캘린더는 그림 2에 표시 됩니다.
Confocal 현미경 검사 법에 의해 셀 전용 라벨 확인 대표적인 실험 L3 lamina monopolar 뉴런 (L...

여기, 우리 세포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 초파리 비주얼 시스템 내에서 낮은 풍부에 효율적으로 하기 위한 셀 분리 프로토콜을 제시.

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

이 방법은 다양한 세포 모형이 어떻게 생성되고 특정 기능을 가진 더 높은 순서 구조로 조직되는지와 같은 생물학에 있는 중요한 질문을 해결하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전사 및 유전체 분석을 위한 Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부에 존재하는 세포의 효율적인 정제를 용이하게 한다는 것입니다. 프로토콜의 주 6의 화요일에, 45 해부 전에 분, 4 섭씨에서 파아항 분말의 하나의 유리병을 검색하고 실온에서 배양.다음으로, 실온에서 에펜도르프 튜브에 완전한 슈나이더의 매체 또는 CSM을 제쳐 두고 나중에 파통과 파우더에 추가하십시오. 해부 5~10분 전에 주사기를 사용하여 실온 CSM을 캡을 통해 직접 파알 바이알에 밀리리터당 100단위의 농도를 추가합니다. 혼합하려면 먼저 유리병을 뒤집어 캡 내부에 붙어있는 분말을 캡처한 다음 내용물을 위아래로 피펫합니다.시약을 혼합 한 후, 수조에 비커에 최대 37섭씨까지 물을 가져. 그런 다음 바이알을 30분 동안 비커에 넣고 파통증을 활성화하고 바이알이 떠 있지 않았는지 확인합니다. 파통증이 인큐베이팅되는 동안 냉동실에서 프로테오리틱 효소 블렌드의 알리쿼트를 회수하고 실온에서 배양합니다.활성화 30 분 후, 실온에서 파아인을 배양. 6주 화요일에는 차가운 CSM의 단계적 동공 뇌를 깨끗한 집게로 해부합니다. 10 분 안에 가능한 한 많은 두뇌를 해부하고 감기 CSM의 신선한 한 방울에 두뇌를 풀.광학 엽과 중앙 뇌의 접합을 꼬집어 광학 엽을 잘라냅니다. 다음으로, 1x RS의 500 마이크로리터를 포함하는 마이크로튜브의 바닥에 로브를 추가합니다. 실험 조직을 위한 1개의 마이크로튜브 및 음성 대조조직을 위한 1개의 마이크로튜브. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.한 시간 안에 가능한 한 많은 엽을 해부합니다. 마이크로튜브 간 이송 중 조직 손실을 제거하기 위해 해부된 시차 로브를 단일 마이크로튜브에 당기십시오. P200 파이펫을 사용하여 해부된 광학 로브로 마이크로튜브에서 1x RS를 조심스럽게 제거하고 로브를 덮을 충분한 솔루션을 남깁니다.튜브 측면에 1x RS의 500 마이크로리터를 조심스럽게 추가합니다. 로브가 튜브 의 바닥에 정착한 다음 200 마이크로 리터를 피펫하게하십시오. 믹스를 추방하고, 움직이는 엽을 관찰하고, 로브가 다시 정착할 수 있도록 합니다.두 샘플의 경우, 활성제의 알리쿼트 600 마이크로리터, 실온 파파인을 마이크로튜브로

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연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을...

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 초파리 생활에 모자이크 광 수용체 세포를 시각화하는 것을 포함한다. 그것은 일 또는 몇 주 동안 망막에있는 각각의 광 수용체 세포의 운명을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 망막 변성 및 신경 퇴행성 질환 또는 광 수용체 세포 개발 연구에 이상적입니다.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 이 프로토콜에서, 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다.

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

배우세요 Drosophila 시각 시스템에서 저풍부 세포를 FACS로 정화하는 방법을. 파파인 소화와 형광 활성화 세포 분류를 활용하여 전사체 및 게놈 분석을 위한 효율적인 세포 분리가 가능합니다.

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

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