Name: 연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 배우세요 생체 외 유동 챔버 모델을 사용하여 이식 조직에 대한 세균 부착을 연구하는 방법을. 이 기술은 감염성 심내막염의 병인과 혈관 투과성 및 세포 이동성을 조사하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 rh 주어진 연구 기금 구 루벤 (OT/14/097)의 교부 금에 의해 후 원했다. 수속은 FWO 연구 재단-플랑드르 (벨기에; 박사 후 연구원 번호-12K0916N 부여) RH UZ 루벤의 임상 연구 기금에 의해 지원 됩니다.

1. 생체 외에서 연구에 대 한 이식 조직 준비
참고: 세 가지 유형의 조직 사용 되었다: 소 심장 패치 (BP), Cryopreserved Homograft (CH)와 소 경 정 맥 이식 (BJV). BJV 도관 채널 (조직 유럽 Homograft 은행 (EHB)에 의해 처리 하 고 액체 질소를 사용 하 여 이전에 저장 된) 경우에, 벽과 판 막 병 전단지 사용 되었다. BP 패치 및 BJV 도관 제조 업체에서 구매 되었다. 사용 전에 다음 EHB 지침12채널을 녹여.
<ol><li>모든 조직 0.9 %NaCl 사전 사용 하 여 린스 합니다.</li>
	<li>사용 하는 일회용 피부 생 검 조직 생 검 펀치 (직경에서 10 m m) 원형 조직 조각을 잘라 준비 합니다.</li>
	<li>일회용 멸 균 scalpels를 사용 하 여 같은 높이에 모든 조직 패치를 잘라.</li>
	<li>도 (예 : BJV 도관)로 고정 하는 조직에 대 한 인간의 알 부는 정착 액을 중화 하의 200 g/L와 4 ° C에서 하룻밤 이식 조각 품 어.</li>
	<li>도 0.9%의 잔류물에 밖으로 세척 NaCl 결정 접시에.  1 분 동안 3 번 반복 합니다.</li>
</ol>2. 관류 실험에 대 한 박테리아를 준비
참고: 세 개의 세균 분리 사용 되었다: S. 구 균 완 (ATCC 12598), ATCC 149900 S. epidermidis , S. sanguinis NCTC 7864. S. 구 균 과 S. epidermidis tryptic 간장 국물 (TSB)에 37 ° C에서 성장 했다와 S. sanguinis 5% CO2 두뇌 심 혼 주입 국물 (BHI)에서 37 ° C에서 성장 했다.
<ol><li>단단한 혈액 한 천 격판덮개에 박테리아의 숙박 문화를 준비 합니다.<ol>
<li>메 마른 루프를 사용 하 여 냉동된 박테리아를 다쳤어요 37 ° c.에 숙박 문화에 대 한 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지 위에 접종을</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 접종 루프를 사용 하 여 하룻밤 혈액 한 천 문화에서 하나의 식민지를 선택 하 고 37 ° c.에 하룻밤 문화와 14 mL 튜브에 TSB 또는 BHI의 10 mL에 접종을</li>
	<li>야간 문화 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000) centrifuge 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 10 mL에 산 탄을 resuspend. 얼음에 14 mL 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>5 (6)-카-fluorescein N-hydroxy-succinimidyl 에스테 르 (CF)에서 에탄올의 3.7 mg/mL 해결책의 약 수를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 또한 CF의 150 µ g/mL의 ' 초순 '를 사용 하 여 재고 희석. 참고: 알루미늄 호 일을 사용 하 여 광원에서 튜브를 보호 하 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>Centrifuge 박테리아 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000)와 PBS의 800 µ L에 산 탄을 resuspend 고 150 µ g/mL CF 솔루션 (관류 실험을 위해 사용 하는 30 µ g/mL의 최종 농도)의 200 µ L를 추가 합니다. 알루미늄 호 일 빛에서 튜브를 보호 하 고 궤도 셰이 커를 사용 하 여 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>라벨, 후 PBS에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션의 2%를 차단 하 고 스핀 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000). 원심 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000), PBS와 펠 릿 박테리아의 10 mL를 사용 하 여 세척 단계를 따르십시오.</li>
	<li>해당 하는 OD600 (광학 밀도) 0.65의 얻을 107 콜로 니 형성 단위 (CFU) /mL (CFU 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지에서 계산에 의해 확인), PBS와 박테리아를 희석. 관류 실험 전에 얼음에 어둠 속에서 튜브를 유지. 참고입니다. OD600 측정 박테리아의 대략적인 수를 반영 하는 명심에서 하십시오. 효과적인 접종 량을 계산, 직렬 희석 방법은 섹션 3.8에에서 설명 된 대로 숫자를 기반 하는 마약을 확인 하는 추가 필요한 단계입니다.</li>
</ol>3. 관류 실험 체 외에 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여
<ol><li>연락해 세균 현 탁 액 직면 하는 내부 표면 조직 생 검 (1.1-1.5 단계에서 준비 하는) 동일한 두께 직경 10 mm의 흐름 챔버 시스템에 탑재 합니다. 참고: 다양 한 이식에 걸쳐 동일한 조직 두께 같은 조직 높이 모든 조건에서 층 류를 허용 하는 채널에 도달 보장 합니다. 흐름 챔버의 모든 요소는 제시 하 고 그림 1에 설명 된.<ol>
<li>프로토콜을 시작 하는 8 m m 원형 구멍 뚫 기와 현미경 슬라이드와 고무 가스 켓 라운드 조직 조각을 놓습니다. 참고: 현미경 슬라이드 8 m m 구멍의 생성을 허용 하도록 초박형 하단 필름을 소유한 다. 고무 시트 함께 그것은 조직 표본 및 흐르는 매체 간의 직접 접촉을 가능 하 게 수정 하 고 또한 실험 기간 동안 생 검의 전위를 방지. 조사 조직의 흐름 (작은 직경)에 노출 되는 표면은 겸 자에 의해 조작 될 수 없습니다.</li>
		<li>챔버의 하단 금속 프레임에 포함 되는 가스 켓 시트에는 조직으로 홀더를 삽입 합니다.</li>
		<li>이전 삽입된 조직 홀더 있는 챔버의 아래쪽에 해당 가스 켓 시트 위쪽 금속 프레임에 부착. 이후 8 개의 나사와 전체 챔버를 탑재 하 고 너트를 나사. 챔버 높이 항상 같은 이식에서 다는 것을 확인 하십시오. 참고: 챔버 높이 나사를 강화 시 항상 결정 되어야 합니다. 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>연동 펌프와 튜브와 유체 저수지 흐름 챔버를 연결 합니다.</li>
	<li>3 다 인/cm2 (평방 센티미터 압력 단위 당 다 인)의 전단 응력으로 107 CFU/mL (CFU 계산과 OD600 측정 관련 하 여 확인) 붙일 표시에 박테리아의 PBS 정지 된 조직에 의해 perfuse 연동 펌프의 수단 (흐름 속도 4 mL/min) 1 h 400 mL 세균성 저수지 (사내 디자인, 그림 1) 접시 온도 (자료 테이블)를 사용 하 여 37 ° C에서 에어컨을 사용 하 여.</li>
	<li>지속적으로 동일한 컬렉션 저수지를 사용 하 여 100 mL 세균성 정지 recirculate.</li>
	<li>관류, 후 출시 하는 이식 고 3 분에 대 한 실험실 궤도 셰이 커를 사용 하 여 12-잘 접시에 PBS의 두 번 4 mL와 조직 조각을 세척 챔버를 해체. 이후에 작은 직경의 펀치 피부 생 검을 사용 하 여 이식의 안쪽 부분을 잘라.</li>
	<li>각 조직 생 검 살 균 0.9%의 1 mL를 포함 하는 별도 14 mL 튜브에 배치 NaCl. #1 튜브 레이블.</li>
	<li>10 분 동안 쥡니다 목욕을 사용 하 여 조직에서 세균을 분리 (진폭 = 100% 및 주파수 = 45 kHz). 참고: 이식 패치 TSB 액체 매체 OD600 측정 뒤에 37 ° C에서 하룻밤의 외피에 평가 해야 하는 조직에서 박테리아의 전체 분리 제어 패치 박테리아 무료 솔루션으로 치료에 비해.</li>
	<li>CFUs 계산 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지에서 희석 직렬 메서드를 사용 합니다.<ol>
<li>10 mL 쥡니다 후 얻은 세균 현 탁 액의 직렬 희석 수 있도록 메 마른 염 분의 단일 14 mL 튜브를 준비 합니다. # 2이이 튜브 레이블. 참고: 각 조직 실험 한 튜브 10 mL의 0.9 %NaCl 필요 합니다.</li>
		<li>살 균 0.9%의 10 mL와 함께 3 14 mL 튜브 준비 단계 2.7에서에서 초기 세균 서 스 펜 션의 직렬 희석에 대 한 NaCl. #3, #4, #5 다음과 같이 튜브 라벨. 참고:이 단계는 세균성 관류 실험에 사용에 진짜 CFU 번호를 알고 하는 데 필요한.</li>
		<li>소용돌이 혼합 각 튜브 15 미 소용돌이 대 한 튜브 직렬 희석 수 있도록 초기 세균 현 탁 액 뿐만 아니라 조직 생 검.</li>
		<li>3 한 천 배지, 두 조직 실험 (박테리아의 관류와 PBS의 제어 관류)에 대 한 및 perfusions 사용 초기 세균 현 탁 액에 대 한 세 번째 준비.</li>
		<li>다음과 같은 방식으로 10-1, 10-3 , 10-4조직 실험에 대 한 접시 당 3 개의 분야를 레이블을 지정 합니다. 세균 perfusates에서 CFUs의 수를 계산 하려면 다음과 같이 라벨 접시: 10-1, 10-3, 10-5 및 10-7. 참고: 모든 표시 agar에 번호판 등 10-1, 10-3 CFU/mL는 다음날에 계산의 마지막 번호를 참조 하십시오. 컨트롤 플레이트 팬 들은 어떤 분야의 정보를 요구 하지 않는다. 사용 하기 전에, 혈액 한 천 배지 한다 층 류 후드 아래에 배치 되며, 과도 일 분을 제거 하려면 열.</li>
		<li>계속 하려면 직렬 희석을 준비, 튜브 # 2에 지하철 # 1의 100 µ L 전송 하 고 적극적으로 소용돌이 함께 혼합.</li>
		<li># 1과 #2 해당 분야 10-1 에 튜브의 내용을 100 µ L 10-3 한 천 격판덮개의 확산. 마찬가지로, 10 µ L 튜브 #2 부문 10-4에 확산, 4 번 10 µ L의 각 볼륨에서 4 별도 종양을 얻기 위해이 단계를 반복. 참고: 때문에 작은 볼륨 도금 분야 10-4에 대 한 사용, 그것 성장된 CFUs의 평균 수 있도록 방울의 여러 수 하도록 조언 된다.</li>
		<li>준비 하려면 초기 문화의 직렬 희석, 튜브 #3 단계 2.7에서에서 100 µ L 세균 현 탁 액의 전송 하 고 적극적으로 소용돌이 함께 혼합. 튜브 # 4를 100 µ L 튜브 # 3의 추가 잘 혼합, 후속 튜브 # 5에 대 한 절차를 반복.</li>
		<li>분야 10-3, 10-5, 10-7 , 10-1 의 혈액 한 천 배지 위에 각각의 튜브 #3, #4, #5 및 조정된 세균 현 탁 액 (2.7 단계)의 내용 100 µ L를 확산.</li>
		<li>두고 공기 층 류 후드에 혈액 한 천 배지 건조 10 분 동안 일반적으로 세균 확산. 이후에, 야간 보육에 대 한 37 ° C에서 접시를 놓습니다.</li>
		<li>밤새 부 화 후 세균성 식민지는 관류 사용 시작 세균 현 탁 액에는 조직 생 검으로 CFUs/mL 접착에서 발생 하는 CFUs의 수를 계산 합니다. CFU/c m2로 결과 표현 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 형광 현미경 검사 법 준수 박테리아 관류 시 조직의 이식에
<ol><li>관류, 후 PBS의 조직 조각을 세척 (단계 3.5 참조) 및 작은 직경의 펀치를 사용 하 여 이식의 안쪽 부분을 잘라.</li>
	<li>6 잘 플레이트를 준비 하 고 장착 매체 (자료 테이블)의 작은 물방울을 배치.</li>
	<li>설치 매체의 한 방울에 아래로 그것의 perfused 표면 조직의 각 조각을 놓습니다.</li>
	<li>접시는 형광 스캐너 (테이블의 재료)를 사용 하 여 읽기. 세균성 라벨 사용 fluorophore 따라 여기 및 방출 파장의 매개 변수를 설정 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

없음입니다.

최근 임상 관측 게 IE의 특별 한의 식을 사용 하 여 RVOT6,13의 밸브 교체 받은 것 환자에서 합병증으로. IE에서 이식된 밸브의 부전 광범위 한 염증 및 procoagulant 반응1,14로 이어지는 혈관 내 수술 이식와 세균 상호 작용의 결과 이다. 모델 제시 소설 체 외에서 를 사용 하 여 조직 구조와 세균 요소에 차이 비보에 사용 된 이식15의 감염 민감성을 변조 가능성이 있다면 조사 수 있었습니다. BJV 및 채널 이식 조직 흐름 조건에서 세균성 모집으로 비슷한 성향을 보였다. 따라서 데이터에 일반적 조직 및 그것의 표면 구조 뿐만 아니라 특정 세균성 접착 단백질 본질적 의 소스는 초기 세균 부착에서 주요 결정 요인...

황색 포도상구균 (S. 구 균) 독성 패 혈 증 같은 심한 혈관 내 감염에 이르게 인간의 순환에 이식 하는 생물 학적 또는 생물 학적 비 표면 정착 호스트 면역 방어 시스템을 회피 전략의 다양 한 고용 및 IE1,2,3,,45. IE 남아 있다 중요 한 치료 관련 개별 요인 IEare의 발병에 기여 하지 아직 완전히 이해6,7동안 인공 심장 밸브의 이식 후 환자에서 합병증. 흐름 조건 하에서 박테리아 발생 하는 전단 세력, 그들은 배 벽8을 준수 하기 위해 극복 하기 위해 필요. 모델, 박테리아와 인공 밸브 조직 또는 흐름에서 endothelium 사이 상호 작용을 공부 하 고 수 있도록, 그들은 더 많은 비보에 상황을 반영 관심 있습니다.
몇 가지 특정 메커니즘 내 피 세포 (ECs) 노출된 subendothelial 매트릭스 (ECM) 조직 식민 및 vegetations, IE9에 필수적인 초기 단계 고의 성숙 하 고 세균 부착을 촉진 한다. 다양 한 포도 표면 단백질 또는 MSCRAMMs (미생물 표면 구성 요소 접착제 매트릭스 분자 인식) 설명 되었습니다 접착 호스트 세포와 ECM 단백질의 중재자로 fibronectin, 같은 분자와 상호 작용 하 여 fibrinogen, 콜라겐과 폰 Willebrand 요인 (VWF)8,,1011. 그러나, 일부 독성 요인, 정적 조건에서 공부 하는 대부분의 분자 내 폴딩에 비추어 이러한 상호 작용의 많은 다른 혈관 내 수술 감염 혈액 순환에 관련이 있을 수 있습니다.
따라서, 우리는 사내 디자인 된 생체 외에서 병렬 플레이트 흐름 챔버 모델, RVOT 위치에 이식 조직 이식의 맥락에서 ECM와 ECs의 서로 다른 구성 요소에 세균성 부착의 평가 수 있는 선물. 이 작품에서 설명 하는 방법의 전반적인 목적은 박테리아와 밀접 하 게 관련 혈 류 병원 체의 환경 vivo에서 와 같은 흐름 조건에서 기본 혈관 내 수술 조직 간의 상호 작용의 메커니즘을 연구 하는 S. 구 균. 이 새로운 접근 방식을 이식 조직 표면 세균 준수 IE의 개발에 대 한 잠재적인 위험 요소를 식별 하는 민감성에 초점을 맞추고.

<table><tbody><tr><td>소 심낭(BP) 패치, Supple Peri-Guard Pericardium</td><td>Synovis Surgical Innovations, USA</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>소 경정맥 도관(BJV)</td><td>Contegra 도관; Medtronic Inc, 미국</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH 냉동 보존 동종이식</td><td>유럽 호모그라프 은행(EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, 미국</td><td>P850(8mm); P1050 (10 mm)</td><td></td></tr><tr><td>인간 알부민</td><td>플렉스부민; Baxter, Belgium</td><td>BE171464 LOT:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 소이 육수 (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Germany</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>심장 주입 국물 (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide 에스테르(CF)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프(MODEL ISM444B)</td><td>Ismatec BVP-Z 표준; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>초음파 처리 수조</td><td>VWR 초음파 세척기; VWR, Radnor, Pa</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen by ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (형광 스캐너)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - 초순수 - H2O MilliQ</td><td>Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>1-웰 온 Lumox 탈착 가능한</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 - 수술용 블레이드</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 실리콘 튜빙, 1/8"ID x 1/4"OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06</td><td>온도 범위: &ndash; 80에서 200&deg; C 살균: 에틸렌 옥사이드, 감마 조사 또는 오토클레이브를 사용하여 30분, 15psi의 압력</td></tr><tr><td>PharMed BPT 튜빙</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>121°deg에서 30분 동안 오토클레이브 가능; C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 튜빙</td><td>Saint Gobain 성능 플라스틱 및 무역;</td><td></td><td></td>15312022</tr><tr><td>온도 조절기</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

다양 한 valved 도관 및 텐트 장착 밸브 오른쪽 심 실 유출 지역 (RVOT) 밸브 교체 선 천 성 심장 질환 환자에 사용 됩니다. 그러나 인공 재료를 사용 하 여, 이러한 이식 세균성 감염 및 다양 한 호스트 응답을 따르게 됩니다.
미생물의 혈관 내 수술 준수에서 중요 한 역할을 하는 박테리아 및 호스트 요인의 식별은 중요성 더 나은 infective 심장 내 막 염 (IE) 같은 감염의 발병의 병 태 생리학을 이해 하 고 예방을 개발 하 전략입니다. 따라서, 생리 전단 조건 하에서 세균성 접착을 조사 하기 위해 유능한 모델의 개발은 필요. 여기, 우리는 새롭게 설계 된 생체 외에서 관류 챔버 병렬 플레이트에 따라 조직 이식의 다른 구성 요소에 세균성 부착의 연구와 같은 기질, 내 피 세포와 불활성 영역 노출 수를 사용 하 여 설명 . 이 방법은 결합 된 식민지를 형성 단위 (CFU) 세 흐름에서 세균성 접착으로 이식 재료의 성향 평가 하다. 더욱, 흐름 챔버 시스템 전단 조건 하에서 세균성 접착 구성 요소 혈액의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는 조직, 그들의 표면 형태 및 세균성 종 특이성의 소스는 우리의 사내 디자인 된 생체 외에서 관류 모델을 사용 하 여 조직 이식에 세균성 부착에 주요 결정 요인 설명 했다.

뒤에 있는 메커니즘을 이해 하기 IE 개발,이 모델 박테리아의 평가 및 조직 관련 요인 감염 발병의 비보에 상황에 존재.
자세하게, 소설 체 외에서 접근 수 있게 3-10 다 인 생리 적 범위의 전단 응력을 발휘 하는 조직에 붙일 레이블된 박테리아를 perfusing에 의해 다른 이식 조직에 흐름 조건에서 세균성 접착을 계량 / cm2 는 RVOT에 대 한입니다. 이 작품에서는, 우리는 3 다 인/c m2에 대응 4 mL/min의 유량을 사용 합니다. 고려 채널 높이 0.3 m m의 모든 조직 패치, 탑재 된 이식 약 39 mm의 중간 입구 사이의 거리, ( 그림 1참조) 관류 챔버 보장 완전 개발된 층 류 흐름 (= 3.8...

우리는 사내 디자인 된 생체 외에서 흐름 챔버 모델, 조직 이식에 세균성 부착의 조사 수 있는 설명 합니다.

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

이 방법은 박테리아, 혈액 세포 및 내피 세포 안대기 근육 사이의 상호 작용과 같은 필드를 통해 감염 성 내막염 및 병영 사진의 병인에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 이식편이 표준화된 유량 조건에서 박테리아, 혈소판 및 단백질과 같은 다양한 표적과의 상호 상호 작용에 직접 적으로 노출될 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 특정 조직의 높은 감염성을 구동 중요한 분자 상호 작용 과 요인을 해명 할 수 있기 때문에, 감염 성 내막염의 우리의 치료로 확장.이 방법은 식물 형성의 병인에 대한 통찰력을 제공합니다. 그것은 또한 혈관 투과성, 세포 이동성 및 유전자 세포 발현을 조사하는 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 프로토콜을 시작하려면, 이전에 준비된 조직 생검을 직경 10밀리미터, 현미경 슬라이드와 8mm 원형 천공 사이의 동일한 두께, 그리고 내부 표면이 위로 향하는 고무 개스킷을 배치하여 세균 현탁액에 접촉한다.홀더에 놓이면서 조직 이식 방향에 집중하십시오. 조직의 내부 표면이 이미 혈류 면에 노출되어 실험 매체에 연락하십시오. 다음으로, 챔버의 하단 금속 프레임에 내장 된 개스킷 시트에 조직과 홀더를 삽입합니다.이전에 삽입된 조직 홀더를 사용하여 해당 개스킷 시트를 챔버 의 바닥에 부착합니다. 그런 다음 8 개의 나사와 나사 너트로 챔버 전체를 장착하십시오. 캘리퍼 또는 눈금자를 사용하여 챔버 높이가 접목 전반에 걸쳐 항상 동일한지 확인합니다.다음으로 흐름 챔버를 연동 펌프와 연결합니다. 그런 다음 400 밀리리터 유체 저장소를 튜브와 연결합니다. 100밀리리터 서스펜션을 10밀리리터 현탁액으로 10밀리리터 서스펜션으로 10밀리리터 서스펜션을 10개에 7개의 형광라벨이 부착된 콜로니 성형 유닛에 인산염 완충식염에 있는 유닛은 평방 센티미터당 3개의 다이닝의 깎아지른 듯한 응력과 연골 펌프와 세균 저수지를 사용하여 1시간 동안 분당 4밀리리터의 유량으로 응모합니다.동일한 수집 저장소를 사용하여 100 밀리리터 세균 현탁액을 지속적으로 재순환합니다. 관류 후 챔버를 분해하여 접목을 방출합니다. 3 분 동안 궤도 셰이커를 사용하여 12 웰 플레이트에 PBS의 4 밀리리터로 티슈 조각을 두 번 세척합니다.그런 다음 직경이 작은 피부 생검 펀치를 사용하여 이식편의 내부 부분을 잘라냅니다. 각 조직 생검을 멸균 0.9%의 염화나트륨 1밀리리터를 함유한 별도의 14밀리리터 튜브에 넣습니다. 초음파 욕조를 사용하여 조직에서 박테리아를 10 분 동안 분리하십시오.14 밀리리터 튜브를 멸균 0.9%의 염화 나트륨으로 제조하여 초음파 처리 후 얻어진 세균 현탁액의 직렬 희석을 만듭니다. 튜브 번호 2에 레이블을 지정합니다. 초기 세균 현탁액의 직렬 희석을 위해 멸균 0.9%의 염화나트륨 10밀리리터로 14밀리리터 튜브 3개에 제조하여 초기 세균 현탁액의 직렬 희석을 위한 증혈 실험에 착수한다.튜브 번호 3, 4 번 및 5 번 라벨. 다음으로, 3개의 천판을 고정, 세균 관류용, PBS의 관류 제어를 위한 플레이트, 관류에 사용되는 초기 세균 현탁액에 대한 세 번째 플레이트. 조직 실험을 위해 플레이트당 3개의 섹터를 다음 방식으로 라벨:10-1, 10-3 및 10-4.세균 내의 식민지 형성 단위의 수를 계산하려면 플레이트를 다음과 같이 레이블: 10-1, 10-3, 10-5, 및 10-7. 조직 생검을 함유하는 튜브를 각각 15초 동안 소용돌이치며 연쇄 희석을 합니다. 직렬 희석을 준비하기 위해 튜브 넘버 원 1의 마이크로리터를 튜브 넘버 2로 옮기고 튜브를 소용돌이어 용액을 철저히 혼합한다.튜브 번호 1과 2 번의 내용물 100 마이크로리터를 해당 섹터에 확산, 10-1 및 10-3 용하 판의. 그런 다음 10 개의 마이크로 리터를 섹터 10 4에 2 번 전파했습니다. 이 단계를 4번 반복하여 각 10마이크로리터의 각 부피에서 4개의 별도 성장을 얻습니다.초기 배양의 직렬 희석을 준비하기 위해 먼저 희석을 15초 동안 소용돌이치고 100마이크로리터의 세균현탁액을 튜브 번호 3로 옮기고, 소용돌이에 의해 적극적으로 섞는다. 튜브 번호 3의 마이크로 리터 100 마이크로 리터를 튜브 번호 4에 추가하고 다시 섞습니다. 튜브 번호 4에서 튜브 번호 5에 대한 절차를 반복합니다.튜브 3번, 4번, 5번, 표지된 초기 배양물의 내용물 100개, 피의 한천판10-3, 10-5, 10-7, 10-1을 각각 계열한다. 라미나르 후드 아래에 혈액 식천판을 두어 세균 스프레드를 공기 건조시 10분 간 드립니다. 그 후, 하룻밤 잠복에 대한 37 섭씨에 접시를 배치합니다.하룻밤 잠복 후, CfU의 수를 얻기 위해 세균 성 식민지를 계산합니다. 깎아지른 듯한 스트레스 조건 하에서, 다양한 이식 조직에 걸쳐 유사한 세균 부착은 포도상 구균과 포도상 구균 표피증 감염 둘 다를 위해 관찰되었습니다. 절차에 따라, 연쇄상 구균 sanguinis는 소 경정맥 벽에 대한 준수의 상당한 감소를 표시, 소 심낭 패치에 비해.세균의 3종을 비교할 때, 연쇄상 구균 sanguinis는 포도상 구균 과 포도상 구균 표피증과 관련하여 소 경정맥 벽에 상당히 낮은 접착력을 제시합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 같은 머리의 올바른 조직을 준비한 것을 기억하는 것이 중요합니다. 모든 실험 표본에서 유사한 조건을 보장하고 다양한 실험 시리즈 간의 데이터 변동성을 최소화합니다.개발 후, 이 기술은 연구원이 의료 상태에 가까운 완전한 복잡성을 구축하기 위해 다른 요소로 체외 모델 접근 방식을 풍부하게함으로써 단계별로 복잡한 장애 시스템을 탐구 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

출처: Ditkowski, B. 외 박테리아가 이식 조직에 부착하는 현상을 연구하기 위한 평행판 관류 시스템의 in vitro 모델. J. Vis. 경험 (2019).이 영상은 평행판 유동 챔버를 이용해 형광 표지된 박테리아를 혈관 이식 조직 위에 관류하는 방법을 시연하여, 전단 흐름 조건에서 박테리아 부착과 초기 병태 기전을 통제하여 분석할 수 있게 합니다.

조직 생검에서 박테리아 부착을 연구하기 위한 in vitro 평행판 유동 모델

출처: 칼라타유드 아로요, M. 외. 시험관 내 숙주-미생물 인터페이스에서 합성 박테리아 컨소시엄의 생존 가능성 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 박테리아의 생존 가능성을 연구하기 위한 시험관 내 장 숙주-미생물 모델을 시연합니다. Caco-2와 HT29-MTX 세포의 공동 배양은 모의 소화 조건 하에 사전 처리된 박테리아와 함께 배양됩니다. 상피 장벽의 완전성을 경상피 전기 저항을 이용해 평가하며, 배양지에서 분획, 용해된 점액, 세포 용해액, 세포 잔해물을 수집하여 후속 분석을 수행합니다.

박테리아 부착 및 내부 흡수를 평가하기 위한 시험관 내 장 모델

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

이 프로토콜은 환자 유래 제노이식(PDX)의 시험관 내 배양을 확장가능하게 하는 방법을 보여 줍니다. 한 단계는 실행 불가능한 단일 셀을 간단하게 제거하여 3D 하이드로겔에서 다세포 클러스터 배양의 전반적인 생존력을 향상시킵니다. 보조 단계는 PERfused 된 미세 유체 플랫폼에서 PDX 문화에 대한 모범 사례를 보여줍니다.

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

이 프로토콜은 관류 중인 혈관의 체외 배양을 위해 새로 개발된 3D 프린팅 바이오리액터의 설정 및 작동을 제시합니다. 이 시스템은 다른 사용자가 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었으며, 실용적이고 저렴하며 기초 생물학 및 약리학 연구와 같은 다양한 실험 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Ex Vivo (체외 주행) 3D 프린팅 생물반응기에서 큰 혈관의 관류 배양

배우세요 생체 외 유동 챔버 모델을 사용하여 이식 조직에 대한 세균 부착을 연구하는 방법을. 이 기술은 감염성 심내막염의 병인과 혈관 투과성 및 세포 이동성을 조사하는 데 활용됩니다.

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

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