Name: 급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 척수 절편의 substantia gelatinosa 신경에서 전체 셀 패치 클램프 기록을 수행하는 방법을. 이 기법은 막 특성, 시냅스 전달 및 통증 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (No. 81560198, 31660289)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

모든 실험 프로토콜 설명 동물 윤리 위원회의 남 창 대학 (난창, 홍보 중국, 윤리적인 No.2017-010)에 의해 승인 되었다. 모든 노력이 스트레스와 실험 동물의 고통을 최소화 하기 위해 만들어졌다. 여기 수행 electrophysiological 녹음 실 온 (RT, 22-25 ° C)에서 실행 되었다.
1입니다. 동물
<ol><li>어느 섹스의 Sprague-Dawley 쥐 (3-5 주 이전)을 사용 합니다. 12 h 빛 어두운 주기에서 동물을 집 고 그들에 게 충분 한 음식 및 물 광고 libitum 액세스.</li>
</ol>2입니다. 솔루션 및 자료 준비
<ol><li>솔루션<ol>
<li>준비 하는 인공 뇌 척추 액체 (실제) (mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1.2 NaH2포4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-포도 당, 0.4 ascorbic 산 및 2 나트륨 pyruvate입니다. 표 1을 참조 하십시오.</li>
		<li>자당-실제 (mM)에서 준비: 240 자당, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3.5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 Ascorbic 산 그리고 2 나트륨 pyruvate. 표 2를 참조 하십시오.</li>
		<li>K+준비-기반 (mM)에 세포내 솔루션: 130 K-구 루 콘, 5 KCl, 10 나2-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 그리고 0.3 Li-GTP. 표 3을 참조 하십시오.</li>
		<li>Cs+준비-기반 (mM)에 세포내 솔루션: 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 나2-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (차)-Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 그리고 0.3 Li-GTP. 표 4를 참조 하십시오. 참고: 모든 솔루션이 준비 되어야 한다 증류수를 사용 하 여. 실제 및 자당 실제 약 7.4의 최적의 pH를 유지 하기 위해 사용 하기 전에 carbogenated (95% O2 , 5% CO2 혼합물) 이어야 하며이 두 솔루션의 osmolality 300-310 mOsm을 조정 한다. 아 스 코르 빈 산 칼슘 채널에 영향을 미칠 수, 때문에이 에이전트 하나 칼슘 전류를 기록 하려는 경우 생략 해야 합니다. Osmolality 및 세포내 솔루션의 pH 측정와 각각 290-300 mOsm을 7.2-7.3 조정 있어야 합니다. 세포내 솔루션 0.2 µ m 필터 필터링-20 ° c.에 1 mL aliquots로 솔루션을 저장 하는 것이 좋습니다. Cs+ 및 차 Cs+에 적용 됩니다-기반 블록 칼륨 채널 사용 하 여 앰프는 막 잠재력에 도움이 되는 세포내 솔루션 0에서 꾸준한 mV 금지 postsynaptic 전류 (Ipsc)를 기록할 때.</li>
		<li>0.05% neurobiotin 488 솔루션을 준비 합니다. K+의 neurobiotin 488에서 4 mL의 2 밀리 그램을 분해-세포내 솔루션을 기반으로 하 고 필요한 경우 증류수 또는 자당을 사용 하 여 290-300 mOsm osmolality 조정. 참고: 자당의 1 m m 1 mOsm osmolarity를 증가합니다.</li>
		<li>척수에 대 한 블록으로 3 %agar 준비 합니다. 순화 된 물 유리 비 커에서 250 mL에 한 천의 7.5 g을 녹이 고 하 고 끓는 때까지 열 전자 레인지를 사용 하 여. 솔루션의 소용돌이는 17.5 c m x 10.5 c m x 1.8 cm 플라스틱 상자 응고 후에 혼합물을 부 어. 4 ° C에서는 한 계속 사용 하기 전에.</li>
		<li>Immunohistochemical 처리에 대 한 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다. ~ 800 ml의 PFA 가루 믹스 40 g (약 60 ° C)가 열 PBS 솔루션 (130 m m NaCl, 7 m m 나2HPO4, 3mm NaH2포4) x 1. 천천히 PFA 분말 완전히 해산 될 때까지 1 N NaOH 방울을 추가 하 여 pH를 조정 합니다. 솔루션 취소 되고있다, 일단 1 x PBS 가진 1 l 총 볼륨을 조정 합니다. PH 7.2-7.4 1 N HCl 필요할 때, 그리고 4 %PFA 솔루션 필터링 사용까지-20 ° C에서 그것을 저장을 사용 하 여를 재조정합니다 참고: PFA 이므로 독성, 마스크, 장갑 뿐만 아니라 안전 안경을 착용 하는 데 필요한. 4%를 준비 하는 과정을 수행 PFA 통풍된 후드 내부. PFA 분말 약 9-10의 pH에 완전히 해산 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
악기
	<ol>
<li>전형적인 electrophysiological 시스템 사용 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC)와 고해상도 물 침수 목표, CCD/CMOS 카메라, 패치 클램프 증폭기, micropipette 홀더 장착 된 수직 현미경 및 micromanipulator 피펫은 위치의 미세 조정 허용입니다. XY 스테이지 또한 현미경을 이동 하려면 필요 합니다.</li>
		<li>패러데이 케이지로 둘러싸인 진동 절연 테이블에 모든 장비를 탑재 합니다. 신경 세포를 관찰 하 고 시각화는 micropipettes를 비디오 카메라에 비디오 모니터를 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micropipettes
	<ol>
<li>기록 전극 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 붕 규 산 유리 모 세관에서 확인 합니다. 3-6 m ω 세포내 솔루션으로 채워질 때 전형적인 피 펫 저항 범위.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
한 블록
	<ol>
<li>1.2 cm x 1.5 cm x 2.0 c m 한 블록을 준비 합니다. 필요에 따라 그림 1 에 표시 된 모양으로 블록을 잘라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 급성 척수 슬라이스 준비
참고: 가로 또는 parasagittal 척수 조각 준비 이전 설명된18,,1920.
<ol><li>Transcardial 관류 및 척수 추출, 이전 ~ 500 mL 자당-실제 equilibrated 95% O2 , 5% CO2 를 준비 하 고 얼음을 솔루션을 냉각 (0 ~ 4 ° C).</li>
	<li>모든 해 부 도구 (예를 들어, 가 위, 아이리스가 위, 이빨된 집게, 집게를 잘, 곡선된 겸 자 해 부) 얼음에 식혀. 급성 척수 조각 준비의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다.</li>
	<li>Transcardial 관류<ol>
<li>우 레 탄 (1.5 g/kg)의 단일 주사 (복, i.p.), 후 2-3 분을 기다려야 하 고 발가락이 나 꼬리 핀치 응답을 테스트 하 여 쥐의 마 취 깊이 평가. 일단 마 취의 수술 평면 유지 부정사 위치에 얼음에 쥐를 놓습니다. 주: thoracotomy 동안 깊은 마 취 통증의 지 각에 대 한 충분 한 생산, 현지 IACUC 지침을 따릅니다.</li>
		<li>쇄 골, 칼 과정에서 피부를 통해 (3-4 cm) 절 개를 확인 하 고 칼 절차의 수준 아래 가로 절 개를 하 게.</li>
		<li>파악 하 고 횡 경 막 완전히 노출 곡선된 집게의 쌍 칼 프로세스를 인상. 통해 횡 경 막, 횡 절 개를 만들고 가슴뼈와 갈비뼈 양측 흉 여 사이 흉 곽을 극복. 굽은 집게를 사용 하 여 흉 곽을 고정 하 고 심장 충분히 노출 칼 프로세스를 파악.</li>
		<li>부드럽게, 다른 곡선된 겸 자 마음 잡고 하 고 좌 심 실 대동맥 아치의 자료를 통해 22 G 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>즉시, 오른쪽 아 트리 움 잘가 위로 잘라 고 얼음 처럼 차가운, 산소 자당-실제 중력 시스템을 통해 관류를 시작 합니다. 참고: 차가운 자당-실제와 신속 하 고 충분 한 transcardial 관류 낮은 나트륨 및 칼슘 농도 흥분 성의 독성을 완화 하 고 신경 기능을 보호 하기 위해 도움이 될 수 있지만, 척수의 급속 한 냉각 촉진 수 있습니다. 또한, 붉은 혈액 세포를 지우기 형태학 연구를 수행할 때 biocytin의 배경 얼룩을 줄이기 위한 도움이 될 것 이다. 관류 액체 종료 오른쪽 아 트리 움은 분명 하 고 쥐의 간, 발 색은 창백 충분 하 고 만족을 간주 됩니다. 22 G 바늘의 끝 무딘 심장 및 대동맥 아치 파열 방지 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>척수의 해 부 및 슬라이스<ol>
<li>뒤에서 피부 꼬리 rostral, 관류의 상태에서 어느 한쪽에 척추와 갈비뼈 사이 흉 곽을 통해 다음 컷에 세로 절 개 (5 cm)를 확인 합니다.</li>
		<li>척추의 꼬리 끝에 컷을 확인 하 고가 위를 사용 하 여 주변 조직, 버려야 빠르게 lumbosacral 세그먼트는 척추의 분리.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 자당 기반 실제를 포함 하는 유리 접시에 lumbosacral 세그먼트를 전송 합니다. 위쪽 복 부 쪽으로 좋은 위를 사용 하 여 양측 척추 작은 꽃 자루를 극복 하 고 척수를 신중 하 게 노출. 2 cm 긴 척추 코드 lumbosacral 확대 (L1-S3)를 분리 하 고 다른 유리 접시 가득 찬 자당-실제 척추 섹션을 전송.</li>
		<li>Meninges과 해 현미경 피아-거미 집 모양의 막 제거 합니다. 최대한 빨리 멀리 모든 복 부와 지 뿌리를 잘라.</li>
		<li>이전 트림된 한 블록에 척수를 놓습니다. 가로 분할 영역을 준비 하는 agar를 척수의 복 부 측을 첨부 하 고 잎으로 등 쪽을 보자. 그림 1에서 보듯이 parasagittal 슬라이스를 준비 하려면 수직 방향으로 한 천 하 superglue와 복 부 측을 연결 합니다. 그런 다음 superglue와 vibratome의 플랫폼으로 한 블록을 탑재 합니다. 가로 300-500 µ m 또는 0.025 m m/s와 80 Hz의 진동 주파수의 사전 속도와 parasagittal 슬라이스를 준비 합니다.</li>
		<li>플라스틱 트림 피 펫을 사용 하 여 지속적으로 산소 실제 녹음 전에 적어도 30 분 동안 32 ° C에를 포함 하는 저장 챔버에 나일론 메쉬에 슬라이스를 전송. 참고: meninges 척추 뿌리를 제거 하는 때 척수, 특히 등 쪽 뿔에 부상을 피하기 위해 주의. 척수 등 ventrally 슬라이스 한다. 최상의 결과 얻으려면 빠르게 (15-20 분) 내에서 슬라이스를 준비 한다. 척추 슬라이스의 두께 셀 가시성을 충족 하기 위해 더 이상 600 µ m 이어야 한다. 또한, 위에서 설명한 기술은 수평 척수 조각 얻을 사용 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 전체 셀 패치 클램프 기록
<ol><li>SG 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 녹화를 수행 하려면 K+-Cs+를 적용 하는 동안 대부분의 녹음 경우 세포내 솔루션을 기반으로-금지 postsynaptic 현재 녹음에만 솔루션을 기반으로.</li>
	<li>부드럽게 척수 조각 녹음 실로 이동한 다음 U 자 모양의 백 금 철사와 함께 나일론 스레드 단단히 최적의 슬라이스 안정성에 대 한 연결을 유지 합니다. 꾸준히 중력 시스템을 통해 실시간에 버블링 된 실제와 슬라이스를 perfuse 하 고 충분 한 산소를 달성 하기 위해 2-4 mL/min에서 관류 속도 설정 합니다.</li>
	<li>저해상도 현미경 렌즈를 사용 하 여 SG (반투명 밴드)의 영역을 식별, 건강 한 신경 목표 셀으로 고해상도 목표를 사용 하 여 선택한 비디오 모니터 스크린의 센터에 그것을 조정 합니다.</li>
	<li>K+의 적절 한 볼륨을 채워는 micropipette-기반 또는 Cs+-는 micropipette 전극 홀더에 삽입 고 세포내 솔루션 안에 실버 와이어 연락은 필요에 따라 세포내 솔루션을 기반으로 합니다 홀더입니다.</li>
	<li>초점으로는 micropipette가지고 micromanipulator를 사용 하 여 실제에 몰입할 고 온화한 긍정적인 압력 (~ 1 psi는 압력 게이지로 측정 하는 때) 적용 모든 먼지와 파편 micropipette 강제로.</li>
	<li>타겟된 신경 쪽으로 micropipette 점차적으로 이동 합니다. 피펫으로 신경 및 아주 작은 보조 개 형태는 gigaseal를 형성 하기 위하여 신경 막에 접근 하는 일단 긍정적인 압력을 릴리스 합니다.</li>
	<li>지주-70에 잠재적인 변경 mV, 가까이 생리 적인 휴식 막 잠재적인 (RMP) 셀의. 다음, 과도 하 고 부드러운 흡입 막 파열을 만들 좋은 전체 셀 구성 micropipette 적용 됩니다. 참고: 녹음 실에는 슬라이스를 전송 후 적어도 5 분 조각 표면에 파편을 취소에 대 한 지속적인 관류를 확인 하십시오. 그것은 건강 하 고 건강에 해로운/죽은 신경 세포 사이 구별 하는 능력 좋은 씰링 및 안정적인 기록을 위한 최고 중요성의 지적 가치가 있다. 건강에 해로운/죽은 신경은 보이는 큰 핵 함께 부 또는 긴축 외관, 밝고 부드러운 막으로 3 차원 (3D) 모양 특징 이다 건강 한 신경 및 그것의 핵 표시 되지 않습니다. 전체 셀 구성 달성 하기 위해 필요할 때 단계별 빠르거나 느린 커패시턴스에 대 한 보상을 필수적 이다. RT에 잠재적인 액체 접합은 계산 15.1-15.2 mV 및 k+4.3-4.4 mV-기반 및 Cs+-각각 세포내 솔루션을 기반으로. 우리의 연구에 기록 된 데이터 하지 액체 접합 잠재력에 대 한 수정 했다.</li>
	<li>본질적인 막 속성의 녹음<ol>
<li>수동 내장 막 속성 기록: 기록 RMP을 즉시 (20 내 s)에서 휴식 후. 전류 클램프 모드에서 RMP에 전압에 대 한 응답 depolarizing 현재 (10 pA, 500 밀리초)를 측정 하 여 신경 입력된 저항을 결정 합니다.</li>
		<li>기록 속성을 발사: 1의 시리즈와 전류 클램프에 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트 전류 펄스 (25 pA 증가와 25-150 pA) RMP에 depolarizing s. 임계값, 진폭 및 오프 라인으로 단일 활동 전위의 반-폭 측정 합니다.</li>
		<li>Subthreshold 전류 기록: 체세포 subthreshold 전류를 평가 하는 막 잠재적인에서 개최-50 mV 전압 클램프 모드에서. 그런 다음 hyperpolarizing-60에서 1 s의 전압 펄스의 시리즈를 적용 mV-120 ~ mV, mV 10 감소.</li>
		<li>흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs) 기록: 기록 EPSCs k+-기반으로-70의 지주 잠재력에 전압 클램프 모드에서 세포내 솔루션 mV.</li>
		<li>레코드 Ipsc: Cs+적용-Ipsc를 기록 하기 위한 세포내 솔루션을 기반으로. 전체 셀 구성 설정 되 면 막 잠재적인에서 개최-70 mV ~ 5 분, 및 다음 변경 0으로 잠재적인 지주에 대 한 mV 점차적으로. 안정화를 위한 몇 분 그리고 IPSC 이벤트 기록 시작 합니다. 참고:-50 mV 및 표시 오버 슛 보다는 적게는 RMP만 신경 더 학문을 위해 선택 되어야 합니다. 우리의 연구에서 시리즈 저항은 일반적으로 10-30 m ω, 그리고 직렬 저항을 20% 이상 변경 되 면 녹음을 제외 해야 합니다. EPSCs 50 µ M APV의 목욕 응용 프로그램으로 확인 될 수 있는 20 µ m CNQX, Ipsc 10 µ M bicuculline와 1 µ M strychnine 확인 될 수 있는 하는 동안.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 형태학 연구
<ol><li>형태학 실험에 대 한 사용 K+-0.05% neurobiotin 488을 포함 하는 세포내 솔루션을 기반으로.</li>
	<li>안정적인 electrophysiological 적어도 20 분에 대 한 기록 유지 후 천천히 봉인 및 컨테이너 4%로 가득 척수 조각 전송 세포 막 수 있도록 위쪽 방향으로 micropipette를 제거 PFA. 수정 조각 4 %PFA 하룻밤에 4 ° C에서 그리고 1 시간에 대 한 실시간에.</li>
	<li>PBS에서 슬라이스를 헹 구 고 30 분 50% 에탄올에 그들을 담가. PBS에서 또 다른 3 개의 세척, 후 슬라이드 장착 매체에 그들의 원래 두께에 슬라이스를 탑재.</li>
	<li>Confocal 현미경을 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 이미지 수집 및 신경 3D 재구성. 1.5 µ m의 z-스택 20 X 렌즈를 통해 신경 세포를 검사 합니다.</li>
</ol>

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<li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li>
<li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li>
<li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li>
<li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li>
<li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li>
<li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li>
<li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147(2015).</li>
<li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li>
<li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li>
<li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

이 프로토콜 세부 SG 뉴런18,19,,2021에 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행할 때 우리가 성공적으로 사용한 척수 조각 준비 단계. 이 메서드를 구현 하 여 우리는 최근 그 minocycline 보고 차세대 항생물질, 현저 하 게 SG 뉴런19에 연 접 메커니즘을 통해 억제 시 냅 스 전송 향상 시킬 수 있는. 또한,이 에이전트는h 의 진폭을 감소 하 고 더 SG 뉴런21의 흥분을 억제 수 있습니다. 이러한 지원 게시 데이터 및 대표 결과 우리가 여기에 표시, 현재 설명 방법은 electrophysiological 연구의 넓은 범위에서 사용 하기에 적합.
<p class="jove_co...

Substantia gelatinosa (SG, lamina 척추 등 경적의 II) 전송 하 고 규제 하는 감각 정보에 대 한 논의 여지가 없 중요 한 릴레이 센터 이다. 그것은 기본 구심 섬유, 지역 수 및 생 내림차순 억제 시스템1에서 입력을 받아 흥분 성의 억제 수 구성 됩니다. 최근 수십 년간, 급성 척수 조각 준비의 개발 및 전체 셀 패치 클램프 기록의 출현 설정한 SG 뉴런2, 의 본질적인 electrophysiological 및 형태학 속성에 대 한 다양 한 연구 3 , 4 뿐만 아니라 SG5,6에 로컬 회로의 연구. 또한, 생체 외에서 척수 조각 준비를 사용 하 여 연구원 신경 excitabilities7,8에 변화를 해석할 수 있는, 이온의 기능9,10, 채널 및 시 냅 스 활동11,12 다양 한 병 적인 조건 하에서. 이러한 연구 개발에 재생 SG 신경 역할에 대 한 우리의 이해 및 만성 통증과 neuropathic 가려움증의 유지 보수 깊 어 있다.
기본적으로, 이상적인 전체 셀 패치 급성 척수 조각을 사용 하 여 신경 소마의 명확한 시각화를 달성 하기 위해 핵심 필수 건강 하 고 패치되지 뉴런 얻어질 수 있다 조각의 우수한 품질을 보장 하기 위해입니다. 그러나, 척수 조각 준비 복 부 laminectomy 수행 하 고 건강 한 조각을 얻기에 장애물이 될 수 피아-거미 집 모양의 막 제거 등의 여러 단계가 포함 됩니다. 그것은 척수 조각 준비 하기 쉬운, 척수 조각에 녹음에서 시험관에서 수행는 여러 가지 장점이 있습니다. 셀 문화 준비에 비해, 척수 조각 순수 관련 조건에는 고유한 시 냅 스 연결을 부분적으로 보존할 수 있습니다. 또한, 전체 셀 패치 클램프 척수 조각을 사용 하 여 녹음 더블 패치 클램프13,14, 형태학 연구15,16 단일 셀 RT-PCR 등의 다른 방법을 결합 될 수 있는 17. 따라서,이 특정 지역 내에서 해 부와 유전 다양성을 특성화에 더 많은 정보를 제공 합니다 기술과 지역 회로의 구성의 조사에 대 한 수 있습니다.
여기, 우리는 급성 척수 조각을 준비 하 고 전체 셀 패치 클램프 기록 SG 뉴런에서 인수에 대 한 우리의 방법의 기본과 상세한 설명을 제공 합니다.

<table><tbody>ACSF 및 PBS <tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td>의 제조에 사용되는 NaCl Sigma 60130 <td>ACSF, 자당-ACSF 및 K+ 기반 세포 내 용액</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NaH2PO4&middot의 제조에 사용됩니다. 2H2O</td><td>Sigma</td><td>71500</td><td>ACSF, 자당-ACSF 및 PBS</td></tr><tr><td>CaCl2&middot의 제조에 사용됩니다. 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACSF 및 자당-ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2&middot의 제조에 사용됩니다. 6H 2 O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>ACSF 및 자당 -ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO의 제조에 사용 3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>ACSF 및 자당 -ACSF</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>ACSF 및 자당 -ACSF</td></tr><tr><td>의 제조에 사용나트륨 피루브 산</td>염 <td>시그마</td><td>A7631</td><td>ACSF 및 자당 -ACSF</td></tr> 자당 제조에 사용 <tr><td></td><td>시그마</td><td>S7903</td><td>자당 -ACSF</td></tr><tr><td>K-글루코네이</td>트 제조에 사용 <td>Wako</td><td>169-11835</td><td>K + 기반 세포 내 용액</td></tr><tr><td>Na2-Phosphocreatine</td><td>Sigma</td><td>P1937</td> <td>제조세포 내 용액</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td>의 <td>제조에 사용 세포 내 용액</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td>의 제조에 <td>사용 세포 내 용액</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td>의 제조에 <td>사용 세포 내 용액</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td>의 제조에 <td>사용 세포 내 용액</td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td>Cs+ 기반 세포 내 용액</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>C3011</td><td>Cs+ 기반 세포 내 용액</td></tr><tr><td>TEA-Cl</td><td>Sigma</td><td>T2265</td><td>Cs+ 기반 세포 내 제조에 사용 용액</td></tr><tr><td>: Neurobiotin 488</td><td>Vector</td><td>SP-1145</td><td>0.05 % neurobiotin 488은 형태 학적 연구에 사용될 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>3 % 한천 블록은 파라</td></tr><tr><td>포름 알데히드</td> 시<td>그마</td><td>P6148</td><td>4 % 파라 포름 알데히드는 면역 조직 화학 처리에 사용되었습니다</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Hengxing Chemical </td><td>PBS</td>산 Coverslipping 중간 Polyscience 18606 Urethan National Institute for Food and Drug Control 30191228 1.5 g/kg, i.p.의 제조에 사용되는 시약<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>1.5 mm OD, 1.12 mm ID</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-97</td><td>마이크로 피펫 준비에 사용</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>진동 절연 테이블</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>적외선 CCD 카메라</td><td>Dage-MIT</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>XY 스테이지</td><td>Burleigh</td><td>GIBRALTAR XY</td><td></td></tr><tr><td>직립 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>삼투압계</td><td>고급</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>PH 미터</td><td>Mettler 톨레도</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Confocol 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr></tbody></table>

급성 척수 조각 substantia gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 최근 전체 셀 패치 클램프 연구는 큰 신체의 감각 전송, nociceptive 규정과 만성 통증이 나 가려움 개발 기본 척추 메커니즘에 대 한 정보를 제공 합니다. 신경 속성에 대 한 우리의 이해 및 sg에서 지역 회로의 구성에 추가 형태학 연구 급성 척수 조각의 유틸리티에 따라 함께 electrophysiological 녹음의 구현 향상 되었습니다. 여기, 우리는 척수 조각 및 쇼 대표 전체 세포 기록 및 형태학 결과의 준비에 대 한 상세 하 고 실용적인 가이드를 제시. 이 프로토콜 이상적인 신경 보존을 허용 하 고 어느 정도 조건 vivo에서 모방 수 있습니다. 요약 하자면, 척수 조각의 생체 외에서 준비 얻을 수 안정 된 전류와 전압 클램프 녹음을 가능 하 게 수 따라서 용이 하 내장 막 속성, 로컬 회로에 대 한 자세한 조사와 다양 한 실험 방법을 사용 하 여 신경 구조입니다.

급성 척수 조각 그림 1에 표시 된 다이어그램에 따라 준비 되었다. 조각화 및 복구, 후 척수 조각 녹음 실로 옮겨 졌다. 건강 한 신경 소마 모양 IR DIC 현미경을 사용 하 여에 따라 확인 되었다. 다음, SG 뉴런의 활동 전위 전류 펄스 (1 s 기간) depolarizing의 시리즈에 의해 elicited 했다 신경 RMP에서 열렸다. 보이는 것 처럼 그림 2설명 되어 있고 이전 연구에 의해 분류 한 SG 신경 포함 토 닉-발사, 지연 발사에서에서 관찰된, 간격-발사, 초기 버스트, phasic 파열, 단일-스파이크와 꺼 려 발사, 발사 패턴.
이 준비를 구현, 우리 또한 기록 subthreshold 전류 및 자발적으로 나타나는 전류 전압 클램프에....

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

이 방법은 감각 전염, 출혈 조절 및 만성 통증 또는 통증 발달의 기본 척추 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 수 있으며,이 기술의 주요 장점은 이상적인 신경 보존을 허용 할 수 있으며 생체 내 조건을 어느 정도 모방 할 수 있다는 것입니다. 모세관 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 미세 모세 혈관에서 기록 전극을 당겨 서 시작합니다. 그런 다음 몰드를 용융 한천으로 채우고 1.2 센티미터에서 1.5 센티미터를 2.0 센티미터 의 천막 블록으로 준비하십시오.가로 섹션을 계획하는 경우 블록을 중앙 채널을 갖도록 트림합니다. 또는 기생 절개블록의 가장자리가 있는 채널 살. 경질 증혈 및 척수 추출에 앞서 500밀리리터의 자당 기반 ACSF를 준비하십시오.얼음 추위에 대한 용액을 식히고 95%O2 및 5%CO2로 균형을 이룬다. 얼음에 있는 모든 해부 도구를 식힙니다. 코달에서 장밋빛까지 뒤쪽 피부에 세로 5센티미터 절개를 합니다.그런 다음 양쪽의 척추와 갈비뼈 사이의 갈비뼈를 잘라냅니다. 가위를 사용하여 척추의 caudal 끝에서 절단하십시오. 그런 다음 주변 조직을 잘라 내고 척추의 요추 를 신속하게 분리합니다.요추를 얼음 차가운 자당 기반 ACSF가 함유된 유리 접시에 옮춥시다. 복부 쪽을 위쪽으로, 양면으로 척추 페디클을 잘라 조심스럽게 척수를 노출하기 위하여 미세한 가위를 사용하십시오. 척수의 2센티미터 길이 부분을 요추 확대로 분리하고 척추 부위를 차가운 자당 ACSF로 채워진 다른 유리 접시로 옮깁니다.수막과 피아 거미막을 제거하기 위해 해부 현미경으로 작동합니다. 모든 복부와 등대 뿌리를 가능한 한 빨리 잘라냅니다. 수막과 척추 뿌리를 제거할 때 척수, 특히 등경에 부상을 피하십시오.이전에 손질된 한천 블록에 척수를 놓습니다. 횡방향 슬라이스를 준비하려면 척수의 복부 면을 등쪽이 칼날을 향해 한천에 부착합니다. 기생 조각을 준비하려면 복부 면을 수퍼 접착제로 천지에 수직 방향으로 부착합니다.그런 다음, 초접착제와 진동의 플랫폼에 천 블록을 마운트. 또한 300~500마이크로론 횡단 또는 기생슬라이스를 초당 0.025밀리미터의 고급 속도와 80 헤르츠의 진동 주파수로 준비한다. 척수는 등구를 심창적으로 슬라이스해야합니다.최상의 결과를 얻으려면 슬라이스를 15~20분 이내에 준비해야 합니다. 척추 슬라이스의 두께는 세포 가시성을 만족시키기 위해 600 미크론을 초과해서는 안됩니다. 플라스틱 트리밍 파이펫을 사용하여 32도에서 지속적으로 산소를 공급받는 저장 챔버에서 나일론 메쉬로 슬라이스를 전달합니다.실질적인 젤라틴사 또는 SG 뉴런으로부터 전세포 패치 클램프 레코딩을 수행하려면, 시냅스 후 전류의 레코딩을 위해서만 카이슘 양이온 기반 용액을 적용하는 동안 기록용 세포내 용액을 기반으로 칼륨 이온을 사용하십시오. 척수 슬라이스를 녹음실로 부드럽게 이동합니다. 그런 다음 최적의 슬라이스 안정성을 위해 나일론 실이있는 U 자형 플래티넘 와이어로 단단히 안정화하십시오.꾸준히 실온에서 거품 ACSF와 슬라이스를 profuse하고 충분한 산소를 달성하기 위해 분당 2 ~ 4 밀리리터로 풍부 속도를 설정합니다. 그런 다음 저해상도 현미경 렌즈를 사용하여 반투명 밴드로서 SG 뉴런 영역을 식별합니다. 고해상도 목표를 사용하여 표적 세포로서 밝고 매끄러운 멤브레인이 있는 3차원 형상을 특징으로 하는 건강한 뉴런을 선택하고 비디오 모니터 화면의 중심으로 조정한다.마이크로 파이펫을 적절한 양의 칼륨 이온을 기반으로 하거나 세포내 용액을 기반으로 하는 카이슘 이온을 채웁니다. 그런 다음 마이크로 파이펫을 전극 홀더에 삽입하고 세포 내 용액이 홀더 내부의 실버 와이어에 접촉하고 있는지 확인합니다. 마이크로 파이펫을 초점으로 가져와 마이크로 조작기를 사용하여 ACSF에 담가 둡니다.가벼운 양압을 적용하여 먼지와 이물질을 강제로 제거합니다. 점차적으로 표적 뉴런쪽으로 마이크로 파이펫을 이동합니다. 파이펫이 뉴런과 뉴런 멤브레인에 매우 작은 보조개 형태에 도달하면 양압을 방출하여 기가실을 형성합니다.세포의 생리적 휴식 막 잠재력에 가까운 마이너스 70 밀리볼트에 보유 잠재력을 변경합니다. 그런 다음 마이크로 파이펫에 일시적이고 부드러운 흡입을 적용하여 멤브레인을 파열시키고 좋은 전체 세포 구성을 만듭니다. 현 클램프에서 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트하여 25~150개의 피코앰프를 25~150개의 피코암과 함께 현 클램프의 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트하여 25개의 피코암증증을 증분하여 현막 전위전위에서 발사 특성을 기록한다.체세포 하위 임계값 전류를 기록하려면 전압 클램프 모드에서 멤브레인 전위를 마이너스 50 밀리볼트로 유지한 다음 1초 지속 시간의 초극광 전압 펄스를 마이너스 60 밀리볼트에서 10밀리볼트 감소로 마이너스 120밀리볼트로 적용합니다. 마이너스 70 밀리볼트의 보유 잠재력에서 전압 클램프 모드에서 세포내 용액을 기반으로 칼륨 이온을 기반으로 하는 흥분 후 전류를 기록합니다. IPSC의 기록을 위한 세포내 용액을 기반으로 한 세슘 이온을 사용하여 IPSC를 기록하십시오.약 5 분 동안 마이너스 70 밀리볼트에서 멤브레인 잠재력을 유지 한 후 점차적으로 유지 잠재력을 0 밀리볼트로 변경합니다. 안정화를 위해 몇 분 간 기다린 다음 IPSC 이벤트를 기록하기 시작합니다. 휴식 막 잠재력에서 SG 뉴런에 1초 의 탈극화 전류 펄스를 연이어 주입하여 결정된 발사 패턴은 강장제 발사, 지연 발사, 갭 발사, 초기 버스트, 단계파열, 단일 스파이크 및 마지 못해발사로 분류될 수 있다.이 이미지는 전압 클램프의 하위 임계값 전류에 대한 호출 프로토콜을 보여 주어 있습니다. 이러한 대표적인 추적은 IH, IA 및 IT로 분류된 과극화 전류 주입에 대한 반응을 보여줍니다. 이것은 50 마이크로 몰러 APV및 20 마이크로 몰러 CNQX의 부재 와 존재에 마이너스 70 밀리볼트에서 SG 뉴런에서 기록 된 SEPSC의 대표적인 흔적이다. 이 추적은 확장된 기간에 APV 및 CNQX를 추가하기 전에 기록된 SEPC를 보여줍니다.이 절차에 따라 페어링 된 패치 클램프 기록 또는 광유전학과 같은 방법은 실질적인 젤라틴에 특정 뉴런 미세 회로를 특성화하는 것과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.

preparation-acute-spinal-cord-slices-for-whole-cell-patch-clamp

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 수지상 멤브레인 표면에서 패치 클램프 기록 기술을 보여줍니다. 이는 도파민 뉴런에서 수상돌기와 그 아래에 있는 전위의존성 이온 채널의 전기적 특성을 직접 조사하는 데 도움이 됩니다.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

이 비디오는 뉴런 발화 패턴을 분석하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 척수 절편의 SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 척수의 SG 뉴런의 자극에 대한 신경 반응을 연구할 수 있습니다.

척수 절편의 실질체 젤라티노사 뉴런에서 기록하는 전체 세포 패치 클램프

시냅스 전 방출 안면막에서 Ca2+ 전류를 기록하는 것은 Ca2+ 진입 및 신경전달물질 방출을 정확하게 이해하는 데 중요합니다. 우리는 기능적으로 고립된 망상척수 축삭돌기를 생성하는 lamprey 척수의 급성 해리를 제시하여 개별 시냅스전 말단의 방출면 막에서 직접 기록할 수 있습니다.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

급성 뇌 절편에서 시냅스로 결합된 뉴런의 패치 클램프 기록 및 동시 세포 내 바이오사이틴 충전을 통해 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 뉴런 미세 회로에서 전기생리학적 기록의 필수 기술 단계와 후속 형태학적 분석을 설명하는 것입니다.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

우리는 젊은 쥐에서 척수의 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 복부 뿌리의 자극 수 있습니다.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Subcellular patch-clamp recordings는 수상돌기의 기능적 특성을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 이러한 미세한 구조는 직경이 작기 때문에 쉽게 접근할 수 없습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 in vitro에서 도파민 뉴런의 수상돌기로부터 안정적이고 신뢰할 수 있는 기록 수집을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

이 프로토콜은 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 분해능으로 척수 자극(SCS)에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 방법을 설명하며, 이를 통해 연구자들은 척수를 분리하고 세포 생존력을 동시에 유지하는 기술을 향상시킬 수 있습니다.

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

배우세요 척수 절편의 substantia gelatinosa 신경에서 전체 셀 패치 클램프 기록을 수행하는 방법을. 이 기법은 막 특성, 시냅스 전달 및 통증 메커니즘 연구에 활용됩니다.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

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