Name: 차폐 및 타겟팅에 대 한 유전과 화학 Capsid 수정 아 데 노비 루스 기반 유전자 전달 벡터의 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 학습하세요 아데노바이러스 캡시드 화학적 변형 기법으로 유전자 치료 및 항암 치료용 벡터를 설계하는 방법을. 293 세포에서 90% 이상의 효율로 캡시드 단백질을 정밀하게 수정하여 맞춤형 유전자 전달 시스템을 구축할 수 있습니다.

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참고:에서 다음과 같은, geneti 화학 PEGylation 벡터 세부 사항에 설명 하는 광고에 대 한 프로토콜. PEG moiety의 특정 연결을 사용 하려면 Ad5 벡터는 미리 유전자 이전 간행물36의 경우와 maleimide 활성화 못에 설명 된 대로 하이퍼 루프 5에서 hexon 단백질에 시스테인 잔류물을 도입 하 여 수정 화합물 화합물 커플링으로 사용 됩니다.
1. CsCL 단계 기울기로 벡터 정화에 대 한 버퍼의 준비
<ol><li>아 데 노비 루스 버퍼 (광고-버퍼)의 400 mL 50 mM HEPES (4.76 g/400 mL)을 추가 하 여 준비 및 150 m m NaCl (3.504 g/400 mL) 이중 증 류 물 (ddH2O). 350 mL이이 버퍼의 다음 3 개의 광고 버퍼 이체 준비 필요 합니다.<ol>
<li>변형 a: 150ml 광고 버퍼의 pH 7.6 NaOH로 조정 합니다.</li>
		<li>변형 b: 50 ml 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g]의 최종 농도 추가 하 고 HCl로 pH 7.2에 조정.</li>
		<li>변형 c: 150 mL에 0.5 m m TCEP (0.022 g)의 최종 농도 추가 하 고 HCl로 pH 7.2에 조정.</li>
		<li>DdH2O 버퍼 준비 및 분석 급료 화학 제품. 변종 A 및 변형 C의 각 100 mL 준비 CsCl 버퍼를 사용 하 여 (참조 단계 각각 1.2와 1.3; 50 mL) CsCl 단계 그라디언트에 필요한 (단계 3.2.6 참조. 그리고 3.2.18).</li>
	</ol>
</li>
	<li>CsCl 단계 그라데이션 버퍼를 준비 (ρCsCl = 1.41 g/cm3) 광고-버퍼에 참고:이 버퍼 두 다른 유사에 필요 하 게 됩니다.<ol>
<li>두 aliquots CsCl의 50 mL 튜브에 정확히 27.42 g의 무게.</li>
		<li>ΡCsCl = 1.41/TCEP 버퍼: CsCl 광고 버퍼의 변종 C 40 mL에 해결.</li>
		<li>ΡCsCl = 1.41 버퍼: CsCl 광고 버퍼의 변종 A 40 mL에 해결.</li>
		<li>확인 하 고 필요한 경우 조정 산도 HCl. 채우기와 해당 광고 버퍼 변종 정확 하 게 50 mL까지. 정확한 CsCl 농도 pH 최고의 분리 결과 얻기 위해 결정적 이다.</li>
		<li>각 그라데이션 버퍼의 1 mL (1.41 g)를 무게 밀도 (CsCl 콘텐츠를) 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CsCl 단계 그라데이션 버퍼를 준비 (ρCsCl = 1.27 g/cm3) 광고-버퍼에 참고:이 버퍼 두 다른 변형이 필요 하다:<ol>
<li>두 aliquots CsCl의 50 mL 튜브에 정확히 18.46 g의 무게.</li>
		<li>ΡCsCl = 1.27/TCEP 버퍼: CsCl 광고 버퍼의 변종 C 40 mL에 해결.</li>
		<li>ΡCsCl = 1.27 버퍼: CsCl 광고 버퍼의 변종 A 40 mL에 해결.</li>
		<li>확인 하 고 필요한 경우 HCl로 pH를 조정. 마지막으로, 해당 광고 버퍼 변종 정확 하 게 50 mL까지 입력 합니다. 정확한 CsCl 농도 pH 최고의 분리 결과 얻기 위해 결정적 이다.</li>
		<li>각 그라데이션 버퍼의 1 mL (1.27 g)를 무게 밀도 (CsCl 콘텐츠를) 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(0.45 μ m 메쉬 기 공 크기를 사용 하 여) 여과 멸 균 병에 의해 모든 버퍼 (광고 버퍼 및 CsCl 단계 그라데이션 버퍼)를 소독.</li>
	<li>살 균 후 TCEP의 산화를 방지 하기 위해, 포화 및 아르곤 아르곤 가스 약 30 버퍼 sparging 여 TCEP 포함 하는 버퍼를 오버레이 s. 만 살 균 장치를 사용 하 여 처리 (예., 살 균 플라스틱 팁) 아르곤 가스와 아르곤 경지 수 있도록 충분히 큰 사용 병을 적용할 때. 참고: 모든 버퍼 신선 하 고 빛 으로부터 보호 준비 해야 하 고 몇 일 동안 4 ° C에서 저장 될 수 있다 (특히 CsCl 단계 그라데이션 버퍼만 몇 일 동안 보관 해야 하는).</li>
</ol>2. 커플링 Moieties: 저장 및 준비
참고: Moeities 시스테인 위해 사용 thiol 반응 그룹을 부담 해야 합니다. Maleimide 활성화 화합물 유전자 도입된 시스테인 안정 thioether 유대를 형성할 것 이다. 또는 직교-pyridyldisulfide (OPSS)-는 벡터 입자 사이의 커플링 moiety bioresponsive 이황화 다리 형성 활성화 화합물 사용 될 수 있습니다. 대부분 다른 커플링 시 약으로 동결 건조 된 malPEG-750 가수분해에 민감한 고-80 ° c.에 동결 건조 된 분말의 형태로 건조 저장 한다
<ol><li>큰 튜브에 튜브 튜브의 녹고 시 물 응축의 형성을 방지 하려면 저장 (예., 50 mL 튜브) 실리 카 젤 구슬의 쿠션으로 가득. 또한 실리 카 젤 비드 쿠션으로 가득 적절 한 큰 컨테이너에이 튜브를 저장 합니다.</li>
	<li>단단히 각 튜브와 컨테이너를 닫기 전에 아르곤 가스와 공기를 교환 합니다. 이 desiccator, 제거 및 아르곤 가스와 공기를 교체 하 여 다음에 오픈 튜브 및 컨테이너를 배치 하 여 얻을 수 있습니다. 아르곤 가스는 공기 보다 무거운, 이후 튜브 및 컨테이너 아르곤 가스로 채워 고 이제 각 뚜껑 긴밀 하 게 폐쇄와 함께, 서로에 배치할 수 있습니다.</li>
	<li>-80 ° c.에 컨테이너를 저장</li>
	<li>녹고 때 a desiccator에 실리 카 구슬에 컨테이너를 배치와 천천히 실내 온도까지 그들을 따뜻한 다음 컨테이너를 엽니다.</li>
	<li>커플링 반응 수행, 갓 적절 한 용 매에 필요한 기판 커플링의 양을 확인 합니다. 알아서 하지 DMF 나 DMSO 커플링 기판에 대 한 용 매로 사용 되는 경우에 특히 솔루션 최종 커플링 반응에 커플링의 10%를 추가.</li>
</ol>3. 증폭, 정화 및 광고 벡터의 화학 수정:
<ol><li>광고 벡터의 증폭 참고: 다음 단계에 따라 수행 되어야 합니다 로컬 생물 안전 규칙에 따라 안전 캐비닛을 사용 하 여.<ol>
<li>하나 (또는 여러) 유전자 도입된 시스테인 residue(s)를 포함 하는 Kratzer 및 Kreppel38에 의해 설명 된 대로 HEK 293 세포로 복제 결핍 ∆E1 광고 벡터 transfect</li>
		<li>38프로토콜 따라 15-20 큰 (15 cm) 세포 배양 배지 (107 셀/플레이트 x 약 1-2)의 최종 대리점 감염까지 순차 reinfections에 의해 벡터를 증폭. 참고: 최적의 마지막 재감염 해야 될 타임 셀 표시 수정 및 정화 성능의 아침에 전체 cytopathic 효과 (CPE) ( 그림 2참조).</li>
		<li>최종 증폭 단계 후 셀 광고 버퍼 + 10mm TCEP (변형 B) resuspended-80 ° C에 얼 수 있다 그러나, 벡터 입자의 최적의 수율, 세포 세포의 용 해 및 벡터 정화 및 수정 즉시 후속 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>광고 벡터의 정화 및 화학 수정 참고: 벡터의 정화는 아 데 노비 루스 정화 프로토콜에서 설명에 따라 수행38하지만 비 산화 조건 하에서. 세포 세포의 용 해 및 수확 뿐만 아니라 벡터 정화 및 화학 수정 1 일 안에 수행할 수 있습니다. 수확 및 이전에 설명한 프로토콜에 따라 감염 된 세포를 lyse38.<ol><li>접시를 근 근이 하 고 200-500 mL 원심 분리 관에는 상쾌한을 전송 하 여 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>400 x g에서 10 분 동안 셀 솔루션을 회전 합니다.</li>
		<li>4 mL 광고 버퍼 + 10mm TCEP (pH 7.2) (변종 B) 및 살 균 50 mL 튜브에 셀 펠 릿 resuspend 셀 수익률이 낮은 경우에 또는 단지 약한 CPE 유도 되었다, 2 mL에 resuspend.</li>
		<li>(액체 질소)에 중지 및 재개 (에서 37 ° C 물 목욕)의 3 주기에 의해 벡터를 구출.</li>
		<li>4 ° c.에 5000 x g에서 10 분 동안 회전</li>
		<li>Centrifuging, 동안 2 개의 동등한 CsCl 단계 그라디언트 준비:<ol>
<li>첫째, 낮은 단계 광고 버퍼 + ultracentrifuge 튜브 0.5 m m (pH 7.2, 변종 C) TCEP 1.41 g/cm3 ρCsCl의 3 mL를 추가 합니다. 위 단계를 로드 하기 전에 튜브에 낮은 단계의 레벨을 표시 합니다.</li>
			<li>조심 스럽게 천천히 매우 낮은 단계에 튜브의 벽을 따라 5 mL 볼륨 pipetting으로 광고 버퍼 + 0.5 m m (pH 7.2, 변종 C) TCEP 1.27 g/cm3 ρCsCl의 5 mL의 상위 단계를 스택. 참고: 이후 커플링 중 TCEP의 높은 농도 수 malPEG-750의 maleimide 잔류물과 반응 고 이어질 감소 커플링 효율, CsCl 단계 그라데이션 이미 감소 TCEP 농도에서 수행 해야 하 여 정화.</li>
		</ol></li>
		<li>CsCl 그라데이션에 상쾌한 로드 [중 동등 하 게 상쾌한 두 그라디언트에 또는, 낮은 벡터 수확량 (의 위에 보십시오) 분할 하나의 열에 상쾌한 로드], 광고 버퍼 + 10mm TCEP (pH 7 상단에 동등 하 게 모두 그라디언트 채우기 .2, 변종 B)입니다.</li>
		<li>0.0 g 무게 차이에 반대 튜브의 두께 조정 합니다.</li>
		<li>2 h 4 ° c.에 176,000 x g에 대 한 ultracentrifuge</li>
		<li>클램프와 함께 서 서, 낮은 단계 레벨 마크 주위 영역을 액세스할 수 떠나 ultracentrifugation 튜브를 수정 합니다. 튜브 위에 목이 램프를 배치 합니다. 하위 및 상위 단계 사이 국경에 마크 주위 뚜렷한 밴드 (벡터 virions) 표시 (그림 3A-3 C) 해야 합니다.</li>
		<li>바늘으로 튜브를 puncturing과 주사기로 벡터 밴드를 주목 하 여 벡터를 수집 합니다. 15 mL 튜브에 수집 된 벡터 virions를 전송. 참고: Ad 벡터 밴드 위에 약한 밴드 불완전 한 벡터 입자를 포함 하 고 포부에 대 한 피해 야 한다. 셀 파편 및 녹색 형광 단백질 (EGFP) EGFP 표현 광고-벡터는 ultracentrifuge의 상단 부분에 수집 합니다 튜브 ( 그림 3A 및 3B참조). 이 고 다음 단계 (단계 3.2.16) 커플링까지 수행 되어야 한다 신속, 벡터는 이황화 결합 낮은 TCEP 농도 때문에 재치 있는 지금.</li>
		<li>커플링 기판 벡터 준비에 모든 시스테인 잔류물을 기판의 효율적인 완벽 한 바인딩에 필요한 금액을 계산 하려면 OD260측정:<ol>
<li>Kratzer 및 Kreppel38, 소용돌이 수집된 벡터 virions의 10 µ L의 혼합물, 89 µ L 광고 버퍼의 그리고 10 %SDS 1 µ L에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라. 빈 프로브, 광고-버퍼의 소용돌이 99 µ L 10 %SDS 1 µ L로.</li>
			<li>virions 변성을 모두 10 분 동안 56 ° C를 품 어.</li>
			<li>OD260를 확인 합니다.</li>
			<li>다음 수식을 사용 하 여 µ L 당 실제 벡터 titer 계산: OD260 x 광고의 경험적으로 결정된 멸종 계수 x 희석의 요소 (109 벡터 입자 x 1.1 = 1 OD260 단위 / µ L). 따라서, 벡터의 1.36의 측정 된 OD260 1시 10분 희석를 계산 하는 것: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = 약 1.5 x 1010 벡터 입자 / µ L. 참고:이 titer가입니다만 거친 추정; 그러나, 그것은 다음에 설명 된 화학 량 론 계산을 위해 충분히 정확입니다.</li>
		</ol></li>
		<li>단백질은 시스테인의 도입에 의해 수정에 따라 다음과 같은 일반적인 방정식에 따라 효율적인 커플링 반응 (그램)에서 커플링 기판의 금액을 결정: 바이러스 titer 볼륨 x x 시스테인의 수 초과 moiety x x 분자 무게 moiety / 6,022 x 1023 = 기판 커플링의 그램. 참고:이 수식에서: 1) 바이러스 titer는 titer / µ L, 커플링 반응에 사용 되는 했 잖아요 벡터의 µ L에서 볼륨에 대 한 볼륨 2) 계정 위에서 설명한 대로 OD260 에 의해 결정, 3) 시스테인의 수로 단백질의 수는 시스테인 잔류물은 벡터 입자, 4 당 소개 되었다) 초과 moiety moiety 초과 필요한 효율적인 커플링 반응 (50 x), 그리고 5 대의 요소 이다) moiety의 분자량 다 (하지 kDa)으로 도입 해야 합니다.</li>
		<li>갓 화합물의 양을 해결 (또는 가능한 금액) 적절 한 용 매에 필요한. 참고: 필요한 커플링 기판은 낮은 무게 어렵다 하지만 비싼, 복합 가능한 최소한의 무게와 커플링 반응에 응용 프로그램에 대 한 적절 한 농도에서 그것을 녹.</li>
		<li>적절 한 크기 튜브 (예를 들어, 2 mL 튜브)에 벡터 솔루션을 전송 및 벡터를 복합 재고 솔루션을 커플링의 계산된 금액을 추가.</li>
		<li>부드럽게 실 온에서 1 h에 대 한 오버 헤드 회전 하 여 솔루션을 혼합.</li>
		<li>광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A)와 6 mL 전체 볼륨을 벡터 솔루션을 작성. 참고:이 단계는 솔루션은 여전히 첫 번째 단계 그라디언트의 CsCl을 포함, 벡터 솔루션 1.27 g/mL 아래 밀도 있다 단계 그라데이션에 적용 하기 전에 수행 되어야 합니다.</li>
		<li>두 번째 CsCl 밴딩 단계에서 정화 unreacted 커플링 moiety에서 벡터:<ol>
<li>각각에 대해 다음 단계를 수행 하 여 두 개의 동일한 CsCl 단계 그라디언트를 준비: 1) 낮은 단계: 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A) 1.41 g/cm3 ρCsCl의 3 mL 2) 마크 위 단계, 및 3) 위 단계를 로드 하기 전에 튜브에 낮은 단계의 레벨 : 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A) 1.27 g/cm3 ρCsCl의 5 mL 참고: 결합 자리를 차지 하 고, 후 TCEP 없이 버퍼로 사용 됩니다, 무료 thiol 그룹이 이제 벡터 capsids에 있어야.</li>
			<li>CsCl 그라데이션에 상쾌한 로드 하 고 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A) 두 그라디언트 상단에 동등 하 게 채우십시오.</li>
			<li>0.0 g 무게 차이에 반대 튜브의 가중치를 조정 합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>2 h 4 ° c.에 176,000 x g에 대 한 ultracentrifuge</li>
		<li>Ultracentrifugation의 끝 직전 PD-10 열 5 번 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A)의 5 mL을 equilibrate.</li>
		<li>3.2.10 단계에서 완료, 수정 액세스할 수 낮은 단계 레벨 마크 주변을 떠나는 서 서 ultracentrifugation 튜브. 튜브 위에 목이 램프를 배치 합니다. 다시, 하위 및 상위 단계 사이의 테두리, 독특한 밴드 (벡터 virions) 표시 (그림 3C) 해야 합니다.</li>
		<li>바늘으로 튜브를 puncturing과 주사기에 벡터 밴드를 주목 하 여 벡터를 수집 하 고 15 mL 튜브에는 벡터를 전송. 2.5 mL 전체 볼륨으로 함께 이하의 두 그라데이션 튜브의 virions를 수집 하는 것을 주의. 작은 볼륨을 수집 하는 경우 광고 버퍼 (변형 A)와 2.5 mL 전체 볼륨을 입력.</li>
		<li>2.5 mL equilibrated PD 열에 로드 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>열에 광고 버퍼 (변형 A) 3 mL를 추가 하 고는 자형 (순화 된 벡터 virions 포함) 수집.</li>
		<li>10%의 최종 농도를 나눌 적당 한 aliquots (예를 들어, 400 µ L 각), 글리세롤 (333 µ L)를 추가 하 고 OD260 측정에 의해 titer 측정 20 µ L의 약 수를 포함.</li>
		<li>-80 ° c.에 벡터 솔루션 저장</li>
		<li>20 µ L 벡터 솔루션, 광고-버퍼 (A), 이체의 79 µ L 10% sds 3.2.12 단계에서 설명한 대로 1 µ L의 OD260 을 측정 하 여 벡터의 titer를 결정 합니다. 광고-버퍼 (A), 이체 10 µ L 10% 글리세롤의 그리고 10 %SDS 1 µ L의 79 µ L을 사용 하 여 빈으로 있습니다.</li>
		<li>계산으로 벡터 titer: OD260 x 109 벡터 입자 / µ L x 1.1 x 희석의 요소. 준비 단계 3.2.27에서에서, 계산: OD260 x 5 109 벡터 입자 / µ L x 1.1 x</li>
	</ol></li>
</ol>4. 커플링 SDS 페이지의 확인:
참고: 지금까지 충분히 높은 분자 무게 화합물 광고 virions 위해 사용 하는 경우에 커플링 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 확인할 수 있습니다. 성공적인 결합 다음 수정 광고 virion 단백질, 단백질 수정 되지 않은 광고 virion에 비해 해당 단백질 밴드의 변화 초래 한다 ( 그림 4참조).
<ol><li>벡터 (단계 3.2.28)의 계산된 titer에 1-2x 1010 벡터 입자 SDS 페이지 (8%)으로 구분 합니다.</li>
	<li>젤 젤39 도 약한 단백질 밴드를 검출 하기의 실버 얼룩에 의해 개발:<ol>
<li>버퍼 (버퍼의 100 mL에 필요한 금액은 괄호 안에 표시 됩니다)은 착 색에 대 한 준비:<ol>
<li>DdH2O, 50%의 38 mL를 혼합 하 여 버퍼 1 준비 MeOH 100 MeOH (50 mL), 12 %AcOH (100%의 12 mL AcOH), 그리고 0.0185 %HCHO (37%의 50 µ L HCHO).</li>
			<li>50%를 추가 하 여 버퍼 2 준비 EtOH (100%의 50 mL EtOH) ddH2오의 50 mL를</li>
			<li>DdH2o.의 100 mL 0.127 g/L Na2S2O3 (12.744 밀리 그램)를 추가 하 여 버퍼 3 준비</li>
			<li>2 g/L AgNO3 (0.2 g) 및 0.0185% 추가 하 여 버퍼 4 준비 HCHO (37%의 50 µ L HCHO) ddH2o.의 100 ml</li>
			<li>60 g/L 나2CO3 (6 세대), 0.0185%를 추가 하 여 버퍼 5 준비 HCHO (37%의 50 µ L HCHO), 그리고 2.5 mg/L Na2S2O3 (0.256 mg) ddH2O를 100 mL의 최종 볼륨을.</li>
			<li>DdH2O, 50%의 38 mL를 혼합 하 여 버퍼 6 준비 MeOH (100%의 50 mL MeOH), 및 12 %AcOH (100%의 12 mL AcOH).</li>
			<li>DdH2O, 30%의 60 mL를 혼합 하 여 버퍼 7 준비 MeOH (100%의 30 mL MeOH), 그리고 10% 글 리세 린 (100% 글 리세 린 10 mL).</li>
			<li>DdH2오의 90 mL와 버퍼 8 10% 글 리세 린 (100% 글 리세 린 10ml) 혼합 하 여 준비</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>수행은 얼룩<ol>
<li>버퍼 1 30 분 동안에 젤을 수정.</li>
		<li>15 분 동안 버퍼 2에서에서 젤을 씻어.</li>
		<li>1 분 동안 3 버퍼에 젤 pretreat</li>
		<li>DdH2O 20 3 회 젤 워시 s.</li>
		<li>버퍼 4 20 분에에서 젤 임신</li>
		<li>워시 젤 2 회 ddH2O 20 s.</li>
		<li>밴드 표시 될 때까지 버퍼 5 젤을 개발 (10 s-10 분).</li>
		<li>DdH2O 2 분 동안 2 번 젤 워시.</li>
		<li>5 분에 대 한 버퍼 6에서에서 개발을 중지 합니다.</li>
		<li>버퍼 7 20 분에에서 젤을 절약 합니다.</li>
		<li>버퍼 8에에서 젤을 저장 합니다. 참고: 커플링 효율 대상된 capsomere의 수정 및 수정 되지 않은 밴드의 densitometric 부 량에 의해 결정 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-05597-7_1">Molecular evolution of adenoviruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).</li>
<li>Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+content+and+evolution+of+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic content and evolution of adenoviruses.</a> Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).</li>
<li>Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cytopathogenic+agent+from+human+adenoids+undergoing+spontaneous+degeneration+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).</li>
<li>van Oostrum, J., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+adenovirus+type+2+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the adenovirus type 2 virion.</a> Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).</li>
<li>Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+imaging+of+adenovirus%3A+bridging+the+resolution+gap+between+X-ray+crystallography+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22TheEMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy.</a> TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).</li>
<li>Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstruction+reveals+the+complex+molecular+organization+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus.</a> Cell. 67, 145-154 (1991).</li>
<li>Meier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+triggers+macropinocytosis+and+endosomal+leakage+together+with+its+clathrin-mediated+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake.</a> Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Qiu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+natural+IgM+concentration+on+gene+therapy+with+adenovirus+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors.</a> Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).</li>
<li>Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+rates+of+adenovirus+type+5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice.</a> Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).</li>
<li>Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+systemically+delivered+adenovirus+vectors+with+Kupffer+cells+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver.</a> Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).</li>
<li>Schiedner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemodynamic+response+to+intravenous+adenovirus+vector+particles+is+caused+by+systemic+Kupffer+cell-mediated+activation+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells.</a> Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).</li>
<li>Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+adenovirus+by+Kupffer+cells+is+mediated+by+scavenger+receptors%2C+natural+antibodies%2C+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement.</a> Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).</li>
<li>Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenovirus+serotype+5+hexon+regions+that+interact+with+scavenger+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors.</a> Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).</li>
<li>Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR-A+and+SREC-I+binding+peptides+increase+HDAd-mediated+liver+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction.</a> Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).</li>
<li>Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+scavenger+receptors+and+host-derived+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands.</a> Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).</li>
<li>Ganesan, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clearance+of+blood-borne+virus+by+liver+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium.</a> PLoS Pathogen. 7, e1002281(2011).</li>
<li>Cichon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titer+determination+of+Ad5+in+blood%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note.</a> Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).</li>
<li>Carlisle, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+erythrocytes+bind+and+inactivate+type+5+adenovirus+by+presenting+Coxsackie+virus-adenovirus+receptor+and+complement+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1.</a> Blood. 113, 1909-1918 (2009).</li>
<li>Waddington, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+mediates+liver+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer.</a> Cell. 132, 397-409 (2008).</li>
<li>Kalyuzhniy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+is+critical+for+virus+infection+of+hepatocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).</li>
<li>Vigant, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616322833">Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).</li>
<li>Jonsson, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factors+IX+and+X+enhance+binding+and+infection+of+adenovirus+types+5+and+31+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells.</a> Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).</li>
<li>Bradshaw, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+receptor+engagement+during+infection+by+adenovirus+complexed+with+blood+coagulation+factor+X%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X.</a> PLoS Pathogen. 6, e1001142(2010).</li>
<li>Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+basic+amino+acids+in+the+factor+X+serine+protease+mediates+surface+attachment+of+adenovirus%2FFX+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes.</a> Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Zaiss, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+Heparan+Sulfate+Is+Required+for+Adeno-Associated+Virus+2+but+Dispensable+for+Adenovirus+5+Liver+Transduction+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo.</a> Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).</li>
<li>Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uses+and+properties+of+PEG-linked+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Therapeutic+Drug+Carrier+Systems%22%5BJournal%5D)">The uses and properties of PEG-linked proteins.</a> Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).</li>
<li>Parveen, S., Sahoo, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+clinical+applications+of+polyethylene+glycol+conjugated+proteins+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs.</a> Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).</li>
<li>O'Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylation+of+adenovirus+with+retention+of+infectivity+and+protection+from+neutralizing+antibody+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo.</a> Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).</li>
<li>Subr, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coating+of+adenovirus+type+5+with+polymers+containing+quaternary+amines+prevents+binding+to+blood+components%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components.</a> Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).</li>
<li>Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001605001012">Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).</li>
<li>Corjon, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S152500161632679X">Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Krutzke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+blood+coagulation+factor+X-binding+to+Ad5+by+position-specific+PEGylation%3A+Preventing+vector+clearance+and+preserving+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity.</a> Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+bioresponsive+shielding+of+adenovirus+hexon+with+HPMA+copolymers+maintains+transduction+capacity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo.</a> PloS One. 9, e82716(2014).</li>
<li>Kratzer, R. F., Kreppel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+Purification%2C+and+Titration+of+First-Generation+Adenovirus+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

유전자 도입된 시스테인 수정할 수 있습니다 화학적 효율은 일반적으로 80-99%, 그리고 특정 변수가이 효율에 영향을 미칠. 첫째, 그것은 파라마운트 유전자 도입된 시스테인 조기 산화를 받게 하지 않습니다. 프로듀서 셀의 환 환경에서 잘 보호 되 고, 하는 동안 그것은 화학 수정 동안 프로듀서 셀에서 벡터 입자를 해제 한 후 비 산화 환경 제공 하기. 이 위해 시 약을 줄이고 0.1-10 mM에서 농도에서 사용할 수 있습니다 그리고 maleimide 활성화 화합물과 쉽게 반응 thiol 그룹을 포함 하지 않는 환 약을 사용 해야 하는. 둘째, maleimide 활성화 화합물을 사용 하 여, 커플링 반응 중 pH 넘지 말아야 한다 7.35, pH 7.4 반응의 특이성을 줄일 수 있는 보다 큰의 이후. 셋째, 어떤 경우에, 아민 프리 버퍼 (예를 들어, HEPES, PBS) 반응에 사용 되어야 한다. 메모의 시스테인-베어링 벡터 입자 이중 CsCl 설명, 다음 HEPES/10% 글리세롤 화학 수정 이전에 저장 된으로...

Adenoviruses (광고), Adenoviridae, 가족의 구성원은 비 싸여 DNA 바이러스의 70 이상 종류를 지금까지 확인 된 (http://hadvwg.gmu.edu) 되었습니다. Hemaglutination 속성, 게놈 구조 및 시퀀싱 결과 따라 70 광고 종류 7 종 (인간의 adenoviruses g A)1,2로 나눌 수 있습니다. 인간의 광고 게놈 크기에서 38 kb 이며 icosahedral nucleocapsid3에 의해 캡슐. 그들의 풍부 때문에 capsid 단백질 hexon, penton 기지와 섬유는 모두 라고 하 주요 capsid 단백질. 가장 풍부 하 고 큰 capsid 단백질 hexon 12 hexon homotrimers,45의 구성 된 각 20 capsid 측면을 형성 한다. 펜 톤, 각 icosahedral 가장자리 (정점)에 있는 펜 톤 베이스의 pentamers의 구성 되어 있으며 당화 섬유 trimers5,6의 내장 된 버텍스 스파이크에 대 한 자료를 나타냅니다. 기본 광고 셀 항목 기본적으로 두 가지 주요 단계로 구성 됩니다. 첫째, 섬유 손잡이 기본 수용 체에 바인딩합니다. A, C, E 및 F 종에서 광고 종류, 콕 사키와 아 데 노비 루스 수용 체 (차)입니다. 이 상호 작용 함으로써 기본 펜 톤에 따라서 유도 세포 응답 셀룰러 integrins와 RGD 모티브 간의 상호 작용을 촉진 셀 표면의 공간 근접으로는 virion을 제공 합니다. 둘째, 골격에 변화 virion endosome7전송의 국제화 이어질. 출시는 virion는 endosome의 부분 분해 시 세포질에 및 궁극적으로 복제에 대 한 핵에 여행.
동안 광고를 로컬로 배달 될 수 있다 (예., 유전 접종), onco-virotherapy에 필요한 혈 류를 통해 조직의 배달 여러 장벽에 직면. 혈 류에서 순환 하는 동안 삽입 된 virions 숙주의 면역 체계, 바이러스 기반 벡터의 빠른 중립화를 선도 하 고 조직의 응용 프로그램에 매우 비효율적인 광고 기반 벡터 렌더링의 방어 시스템을 발생 합니다. 또한, 광고의 자연 hepatotropism 체계 납품을 방해 하 고 그것의 새로운 대상 셀에 광고를 확인 해야 합니다.
생식 인코딩 자연 IgM 항 체는 타고 난 면역 시스템의 신속 하 게 인식 하 고 virion8,9의 표면에 매우 반복적인 구조를 바인딩합니다. 이 면역성이 있는 복합물을 빨리 보완-중재 무력화 virions8의 큰 부분으로 이끌어 보완 시스템의 클래식과 비 클래식 경로 활성화. 광고 virions의 주요 제거의 결과로 두 번째 통로10 대 식 세포 의해 중재 및 급성 독성 및 haemodynamic 부작용11,12. 광고의 경우 특히, Kupffer 세포 간에 바인딩할 및 phagocytically 광고 virions 통해 특정 폐품 수용 체, 그로 인하여 채택 그들에서 제거는 혈액13,14,15 . LSE 셀 또한 벡터 제거17, 하지만 어느 정도 여전히 명확한 필요에 기여 하는 것와 특정 폐품 수용 체는 또한 간 사인 내 피 세포 (LSE)16에 발견 되었습니다. 또한, 일부 광고 종류와 그들의 파생된 벡터 효율적으로 인간의 적혈구18 에 그들은 바인딩 통해 자동차 또는 보완의 수용 체 CR119에 의해 격리 됩니다. 참고,이 봉쇄 메커니즘 인간의 적혈구에 대조에서 마우스 모델 시스템에서 공부 될 수 없습니다, 그리고 마우스 적혈구 자동차를 표현 하지 않습니다.
특정 안티 광고 항 체 적응 면역 시스템에 의해 생성 된 광고 중 광고와 함께 이전 감염 때문에 노출 후 또는 조직의 응용 프로그램에 첫 번째 배달 후 광고 벡터의 효과적인 사용을 더 방 벽 올리고 그들에 피할 해야 합니다. 효율적인 조직 배달 합니다.
마지막으로, 광고 종류의 (를 포함 하 여 Ad5) 심각 하 게 강한 hepatotropism 응용 프로그램 광고의 조직 치료에 방해가 됩니다. 이 차 있는 굴곡이 운동 hepatocyte 변환 결과 혈액 응고 요인 X (FX), 광고 hexon 단백질20,,2122와 FX의 상호 작용에 의해 중재를 광고 virion의 높은 선호도 때문 이다. FX는 hepatocytes20,23,,2425의 표면에 헤 파 린 황산 염 glycans (HSPGs)에 virion 교량. 이 상호 작용에 대 한 중요 한 요소는 다른 세포 유형에 HSPGs에서 별개의 N-및 O-sulfation 간세포24, HSPGs의 특정 정도 될 것으로 보인다. 이 FX 중재 통로, 뿐만 아니라 최근의 연구 추가 경로 아직 hepatocytes26,,2728의 Ad 변환에 그 결과 확인 것이 좋습니다.
최근에, 그것은 보였다 FX 광고, hepatocyte 변환에만 관여 하지 않습니다 하지만 또한 바인딩, 여는 virion 중화에 대 한 바이러스 입자 방패 보완 시스템26여. FX 바인딩 방지 하 여 hepatocyte 변환의 감소 따라서 것 만들 광고 중화를 통해 증가의 원치 않는 부작용 타고 난 면역 계통.
벡터와 호스트 유기 체 사이의 복잡 한 상호 작용의 깊은 지식을 따라서 호스트의 유기 체에 의해 부과 하는 장애물을 회피 하는 조직의 응용 프로그램에 대 한 보다 효율적인 벡터를 개발 하는 데 필요한입니다.
원래 치료 단백질을 위해 사용 된 1 개의 전략은 적어도 부분적으로 위의 기술된 장벽을 극복 하기 위해 광고 벡터에 대 한 적응 되었습니다. Antigenicity와 immunogenicity 치료 단백질 화합물의 결합 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)29,30감소 될 수 있습니다. 따라서, 말뚝 등 폴 리 [N-(2-여기) methacrylamid] 고분자의 화학식 커플링 (pHPMA)는 capsid를 표면 보호 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용에서 벡터. 일반적으로, 중합체는 capsid 표면에 무작위로 배포 되는 리 사이드 잔류물에서 대상 ε-아민 그룹을 결합 하는. 솔루션에서 벡터 입자, 연결 된 고분자의 친수성 특성상 둘러싸여 면역 세포 인식 또는 효소 저하의 위험을 줄이고 안정적인 물 쉘. 또한, PEGylated 광고 벡터 안티-hexon 항 체에서 생체 외에서 그리고 vivo에서미리 면역된 생쥐31중립화를 피하기 위해 보였다. 유전 capsid 수정, 달리 고분자의 화학 결합은 수행 생산 및 정화, 동시 뿐만 아니라 기존의 프로듀서 셀 및 높은 titer 벡터 주식의 뿐만 아니라 생산의 사용을 허용 capsid 표면에 아미노산의 수천의 수정. 그러나, 높은 heterogeneities에 확장 하 고 특정 capsomers의 수정에 대 한 허용 하지, 전체 capsid 표면에 걸쳐 무작위로 발생 차폐 아민 감독 합니다. 또한, 유익한 효과에 필요한 대형 폴리머 moieties 바이러스 bioactivity32손상.
이러한 한계, Kreppel 외극복 한다 33 벡터 다시-와-타겟팅에 대 한 geneti-화학 개념을 도입 했다. 시스테인 유전자 섬유가 루프33, 단백질 IX34및 hexon35,36같은 용 매에 노출 된 위치에 바이러스 capsid로 소개 되었다. 비록 하지 자연스럽 게 발생, 시스테인 베어링 광고 벡터 정상 프로듀서 셀에서 높은 titers에서 생산 수 있습니다. 중요 한 것은, 삽입 단일 capsomer 내의 다른 위치에 특정 capsomers에 시스테인의 thiol 그룹 반응 moieties의 매우 구체적인 수정 할 수 있습니다. Geneti-화학 이렇게 광고 벡터 디자인에 수많은 장애물을 극복 하기 위해 표시 되었습니다. Detargeting 및 섬유 노브이 루프 입증 된 성공적으로 대상을 수정 자동차 불충분 한 세포33광고 벡터 처리가의 thiol 기반 결합 아민 기반 PEGylation의 조합입니다. Hexon는 (중화 항 체, 혈액 응고 인자 FX) 가장 원치 않는 상호 작용에 관여 하 고, 이후 thiol 기반 수정 전략 hexon에도 적용 했다. Hexon의 HVR5에 작은 말뚝 moieties 커플링 큰 말뚝 moieties hepatocyte 변환14,35증가 하는 반면 광고 벡터 입자 transduce SKOV-3 셀 FX, 존재를 방지. 광고 벡터 입자 섬유 손잡이 자동차 바인딩 억제 및 FX (및 위치-특정 PEGylation 위한 HVR1에 삽입 베어링 시스테인)의 HVR7 억제 바인딩 돌연변이 나르는 중화 항 체와 보충 중재를 피하기 위해 보였다 뿐만 아니라, infectivity의 손실 없이 폐품 수용 체-중재 통풍 관. 흥미롭게도, 자연 FX 방패의 부족에도 불구 하 고 PEGylation 다시 향상 hepatocytes의 변환 못 크기36의 기능으로. 그러나, 그것을 세포내 매매 프로세스에 영향을 미칠지 않습니다 공유 차폐 표시 했다. Prill 외. pHPMA에 기반 하 고 차폐도 공동 폴리머의 어느 모드 셀 항목에 영향을 했다 하지만 입자 핵을 인신 매매에 영향을 증명 bioresponsive 방패 대 돌이킬 수 없는 비교. 긍정적으로 위탁된 한 pHPMA 공동 폴리머 입자 광고의 높은 변환 효율성을 유지 하는 핵을 인신 매매에 대 한 허용으로 bioresponsive 방패를 고용 생체 외에서 그리고 vivo에서37벡터 스
요약 하자면, 이러한 데이터 나타냅니다, 모든 벡터 호스트 상호 작용 알려져 하 고 고려 했다 가정 에서도 과도 한 capsid 표면 수정 관련 조직의 벡터 배달 된 장애물을 극복 하는 데 필요한.
여기 우리는 차폐 및 oncolytic 아 데 노비 루스 기반 바이러스 및 아 데 노 바이러스 벡터 입자의 retargeting 아 데 노 바이러스 벡터 capsids의 사이트별 화학 수정 작업을 수행 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이 기술의 개념은 그림 1에 설명 되어. 합성 고분자의 공유 첨부 파일에 의해 원치 않는 상호 작용에서 capsid 지역 특정의 차폐 수 있습니다. 동시, ligands를 연결 하 고 차폐 및 대상으로 하는 수단을 제공 합니다. 간단한 화학을 사용 하 여, 경험 covalently 수정 아 데 노 바이러스 벡터 표면 분자 펩 티 드/단백질, 탄수화물, 지질를 포함 하 여 및 다른 작은 분자의 다양 한 수 있을 것입니다. 또한, 프로토콜은 그들의 생물 학적 무결성 및 활동의 유지 관리에서 생물학적으로 활성 바이러스 파생 벡터의 화학 수정에 대 한 일반적인 개념을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Vector 정제 및 화학 변형</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Argon 가스</td><td>Air liquide</td><td>지역 가스 딜러</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>Air liquide</td><td>지역 가스 딜러</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Express Plus 0.22 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-카르복시에틸) 포스핀(TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-10g</td><td></td></tr><tr><td>2mL(3mL) Norm Ject(주사기)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>일회용 미세 입자 바늘(노란색 0.9 x 40mm)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710009040</td><td></td></tr><tr><td>염화세슘 99.999% 울트라 품질</td><td>Roth</td><td>8627.1</td><td></td></tr><tr><td>실리카 겔 비드</td><td>Applichem</td><td>A4569.2500</td><td></td></tr><tr><td>메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 - 750 (PEG mal-750)</td><td>Iris Biotech</td><td></td><td>는 실리카 겔 비드에 -80 &deg에 저장합니다. C</td></tr><tr><td>13.2 mL 울트라 클리어 초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>후드에서만 열림</td></tr><tr><td>PD-10 크기 배제 크로마토그래피 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>4 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A1069.1000</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem</td><td>A1112,0500</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>AppliChem</td><td>A1123.1000</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td> 세포 배양용 재료</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-0231SP</td><td></td></tr><tr><td>FBS Good</td><td>PAN Biotech</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere 필터 팁 (다양한 크기)</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫 (다양한 크기)</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>반응 튜브 (다양한 크기)</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC 플레이트 15cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>은 염색 프로토콜 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>8045</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>AppliChem</td><td>1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>AppliChem</td><td>A0820,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 37%</td><td>AppliChem</td><td>A0877,0250</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>AppliChem</td><td>A1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>티오황산나트륨</td><td>AppliChem</td><td>1,418,791,210</td><td></td></tr><tr><td>질산은</td><td>AppliChem</td><td>A3944.0025</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>AppliChem</td><td>A3900,0500</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트<</td></tr><tr><td>strong>특수 실험실 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Nalgene</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roter for Megafuge TX750 + 500 mL 튜브용 어댑터 및 뚜껑</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>기존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 예: Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적합한 Ultrazentrifuge Rotor 예: SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH -Meter</td><td>클램프</td>가 있는 기존 <td></td><td></td></tr><tr><td>스탠드</td><td>기존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구스넥 램프</td><td>기존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오버 헤드 로터</td><td>기존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td>기존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광도계 (OD 260)</td><td>기존</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

차폐 및 타겟팅에 대 한 유전과 화학 capsid 수정 아 데 노비 루스 기반 유전자 전달 벡터의 결합

Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

아 데 노 바이러스 벡터는 유전자 백신 접종과 oncolytic virotherapy 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그들은 특히 vivo에서 배달 후 여러 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용 하는 경향이 있다. 정의 된 벡터 표면 수정 수행 하는 경우 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용에 의해 부과 된 제한 에서만 수 합의 극복할 수입니다. 이러한 수정에는 원치 않는 상호 작용에서 입자의 차폐 및 새로운 ligands의 도입에 의해 대상으로 포함 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜의 목표 생성 하 리더를 사용 하는 차폐 하 고, 원하는 경우, 인간의 아 데 노 바이러스 유전자 전달 벡터 또는 oncolytic 바이러스 대상이 변경. 프로토콜에는 아 데 노 바이러스 벡터 capsids 표면 합성 고분자, 탄수화물, 지질, 또는 다른 생물학 또는 화학 moieties의 특정 화학 첨부 하 여 수정 하는 연구자 수 있게 된다. 이해 고의 비보에 아 데 노 바이러스 벡터의 배달에 대 한 장벽을 극복 하 보였다 결합 된 유전과 화학 capsid 수정의 최첨단 기술을 설명 합니다. 생물학적으로 활성 바이러스 또는 바이러스 유래 벡터가 특정 화학 반응을 수행 하기 위한 중요 한 단계는 상세 하 고 주석 설명 제공 됩니다. 프로토콜에서 설명 하는 기술 (자연스럽 게 결 석) 시스테인의 유전자 도입에 따라 파생 하는 아 데 노 바이러스 벡터의 솔벤트 노출 반복으로 잔류물. 이 시스테인 잔류물, 높은 titers 벡터의 생산, 후 악용 될 수 있는 매우 특정 하 고 효율적인를 벡터 다양 한 물질 클래스에서에서 분자의 화학식 화학 결합에 대 한 특정 화학 반응성을 제공 입자입니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 아 데 노 바이러스 벡터 capsids의 다른 (비-thiol 기반) 화학 수정의 광범위 한 다양 한 수행 하 쉽게 적응 될 수 있다. 마지막으로, 그것은 가능성이 그 비 싸여 바이러스 기반 유전자 전달 벡터 보다 다른이 프로토콜의 기초에서 아 데 노 바이러스를 수정할 수 있습니다.

그림 2 는 성공적인 벡터 생산을 나타내는 293 (HEK 293) 셀에 cytopathic 효과 (CPE)의 예를 보여 줍니다. 세포는 바이러스 벡터와 접종 후 40-48 시간 형태 (그림 2C)을 표시 합니다. 수확에 대 한 올바른 timepoint 세포 세포의 용 해에 의해 바이러스 입자를 잃지 않는 및 유전자 도입된 thiol 그룹의 산화 방지를 위해 결정적 이다. 벡터 입자 세포 세포의 용 해에 의해 매체에 발표는, 유전자 도입된 thiols 거의 즉시 산화 되 고, 그리고 그것을 정화 하 고 화학적으로 그들을 수정 하기가 될 것입니다.
그림 3 은 모범적인 CsCl 밴드를 보여준다. 불연속 Cs...

여기에 설명 된 프로토콜 연구자를 특별히 선택 된 사이트에 아 데 노비 루스 capsids 간단한 화학 수정에 있습니다. 차폐 된 아 데 노 바이러스 벡터 입자 대상이 유전자 전달 벡터 생성 될 수 있습니다, 그리고 벡터 호스트 상호 작용은 공부 될 수 있다.

차폐 및 타겟팅에 대 한 유전과 화학 Capsid 수정 아 데 노비 루스 기반 유전자 전달 벡터의 결합

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

이 방법은 유전자 치료, 종양 청약 및 유전 예방 접종 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 이해 하 고 adenovirus 유전자 전송 벡터의 상호 작용의 벡터 호스트의 이해를 촉진, 최신 임상 시험에서 가장 자주 사용 되는 벡터 유형. 이 기술의 주요 장점은 아데노바이러스 캡슐레이트는 선택된 위치에서 고도로 정의된 방식으로 구체적으로 변형될 수 있으며 간단한 화학을 사용하여 가변범위로 변형될 수 있다는 것입니다.벡터 호스트 수정은 분석될 수 없고 또한 환자 지향적인 방법으로 변조되기 때문에 이 기술의 연루는 치료로 확장됩니다. 이 방법은 특정 벡터 호스트 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하지만, 마우스와 같은 살아있는 유기체에서 바이러스 입자의 라벨링 및 추적에도 사용될 수 있습니다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인은 두 분야에서 실용적인 지식을 필요로 바이러스학과 유기 화학의 독특한 조합으로 투쟁할 것이다.이 기술의 특별한 데모는 여기에서 유기 화학의 방법이 세포 생물학 및 바이러스학의 방법을 충족하기 때문에 중요합니다, 필드 특정 처리 트릭을 포함. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 버퍼를 준비합니다. 각 그라데이션 버퍼의 1밀리리터의 무게를 측정하여 밀도를 확인합니다.모든 버퍼를 살균한 후 TCEP의 산화를 방지하기 위해 TCEP를 아르곤 가스로 약 30초 간 스파지합니다. 유리병을 해동할 때 응축수가 쌓이는 것을 방지하기 위해 실리카 젤 구슬 쿠션으로 채워진 고체 분말 커플링 모에티를 함유한 바이알을 더 큰 튜브에 보관합니다. 이 튜브를 건조기에 넣습니다.건조기의 공기를 제거하고 아르곤 가스로 대체하십시오. 그런 다음 각 튜브를 단단히 닫고 실리카 젤 구슬로 더 큰 용기로 옮습니다. 모든 튜브가 옮겨지면 용기를 닫습니다.사용할 준비가 될 때까지 용기를 섭씨 80도에 보관하십시오. 해동할 준비가 되면 컨테이너를 실리카 구슬 레이어에 디시카에 넣습니다. 용기가 천천히 실온으로 따뜻하게 한 다음 용기를 열수 있습니다.세포가 최적의 세포 병증에 도달하면 플레이트를 긁어 내고 상체관을 원심 분리 튜브로 이송하여 수집하십시오. 셀 서스펜션을 400회 G로 10분간 회전시. 다음으로, 10 밀리머 TCEP를 함유한 4밀리리터의 Ad 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 결과용액을 멸균 50 밀리리터 튜브로 이송한다.액체 질소로 용액을 동결한 다음 섭씨 37도에서 수조에 녹입니다. 이 동결 해동 주기를 세 번 반복하여 벡터를 구출합니다. 원심분리기 는 5000G, 섭씨 4도에서 10분 동안.원심 분리는 두 개의 울트라 원심분리기 튜브를 설정하여 두 개의 동일한 세슘 염화염화물 단계 그라데이션을 준비하기 시작했습니다. 이러한 각 튜브에 하부 위상의 3 밀리리터를 추가합니다. 상부 위상을 로드하기 전에 튜브의 하층 수준을 표시합니다.그런 다음 상층의 5 밀리리터를 하부에 조심스럽게 쌓아 튜브 의 벽을 따라 매우 천천히 아래로 피펫을 합니다. 그라데이션이 준비되고 원심분리가 완료되면 두 그라데이션을 통해 샘플에서 상퍼를 동일하게 로드합니다. 각 그라데이션 튜브의 나머지 공간을 10밀리머 TCEP가 포함된 애드 버퍼로 채우면 튜브를 맨 위로 채우십시오.반대 튜브의 무게를 0 중량 차이로 조정합니다. 원심분리기를 176000회 G, 섭씨 4도로 2시간 동안 변경합니다. 그 후 클램프를 사용하여 하나의 극원심분리관을 스탠드에 고정합니다.액세스할 수 있는 낮은 위상 수준 주변영역을 떠나야 합니다. 거위 목램프를 튜브 위에 놓습니다. 마크 주위, 아래쪽과 상위 사이의 테두리에서, 뚜렷한 밴드를 볼 수 있어야합니다.바늘로 튜브를 뚫고 벡터 밴드를 주사기로 흡인하여 벡터를 수집합니다. 수집된 벡터 비론을 15 밀리리터 튜브로 전송하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 커플링 기판의 양을 계산합니다. 그런 다음 벡터 용액을 적절한 크기의 튜브로 전송합니다.그리고 결합 화합물 재고 용액의 계산 된 금액. 실온에서 1시간 동안 머리 위 회전으로 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 광고 버퍼를 추가하여 벡터 용액의 총 부피를 6밀리리터로 조정합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 제2 세슘 염화물 결합 단계를 사용하여 반응되지 않은 커플링 모에티로부터 벡터를 정화합니다. 바늘로 튜브를 뚫고 벡터 밴드를 주사기로 흡인시합니다. 수집된 벡터를 15 밀리리터 튜브로 전송합니다.두 그라데이션 튜브에서 결합된 것이 2.5 밀리리터 미만인 경우 Ad 버퍼를 추가하여 볼륨을 2.5 밀리리터로 조정합니다. 결합된 비론을 동일한 업그레이드된 PD 열에 로드하고 흐름을 버립니다. 그런 다음 열에 광고 버퍼 3밀리리터를 추가하고 흐름을 수집합니다.10%의 최종 농도를 얻기 위해 수집된 흐름에 글리세롤 333마이크로리터를 첨가합니다. 적절한 알리쿼트로 나눕니다. OD 260 측정을 통해 더 엄격한 측정을 위해 20 마이크로리터의 알리쿼트를 포함해야 합니다.벡터 용액을 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 80도에 저장합니다. 293세포에 미치는 영향의 대표적인 결과는 벡터 생산이 성공했음을 나타낸다. 세포는 바이러스 벡터로 접종된 후 40-48시간 후에 형태학을 보여줘야 한다.실버 스테인드 SDS 파지는 커플링 효율을 평가하는 데 사용됩니다. 키스타인이 있는 벡터는 육각선이 수정되고 수정되지 않은 카포말레 펜톤 베이스에 도입된다. 헥슨 밴드는 캡시드 당 단량제의 90 % 이상을 성공적으로 수정하는 변화를 나타낸다.이 절차를 시도하는 동안 unmodofied 벡터 입자에 대한 감소 환경을 보장하는 것이 중요합니다. 수정 후, 일반 분위기에 적합합니다. 정확한 다큐멘터리 계산은 모든 벡터 입자를 정량적 수정해야 합니다.이 기술의 발달은 유전자 치료의 분야에서 연구를 통해 벡터 전달을 위한 안전하고 부족한 전략을 더 탐구하는 데 도움이 됩니다. 이 절차에 따라 라벨링을 위한 리간드의 결합 또는 형광염과 같은 다른 방법은 수용체 사용 및 바이오 분포와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다. 해당 지역의 GMO 및 작업 안전 규정을 준수해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 molecularly 유전자 가족 걸어갔다 통해 합성 Adeno-관련 바이러스 (AAV) 유전자 치료 벡터를 엔지니어이며 진화하는 기본적인 기법을 보여줍니다. 더욱이, 우리는 선택과 문화 혹은 생쥐의 표적 세포에 대한 향상된 특성을 가진 각각의 키메라 capsids의 분석을위한 일반 지침 및 대표 예제를 제공합니다.

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

지난 15년 동안 개 아데노바이러스 2형(CAV2) 유래 벡터는 in vitro 및 in vivo 세포를 transduction하는 효율성이 입증되었으며 백신 접종 및 유전자 치료에 널리 사용됩니다. 여기에서는 CAV2 벡터를 생성, 생산 및 정제하여 high-titer 바이러스 현탁액을 생성하는 절차를 설명합니다.

Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 유래 벡터의 생산 및 정제

여기서는 원리 증명 가의 아데노 바이러스 타입 5 (의 Ad5) 벡터를 생성하는 프로토콜을 제시의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-그의 항원 캡시드 혼입 전략을 이용하여. 이 벡터는 성적 체력을 나타내는 것으로 입증되었다, 기능은 통합 항원의 Ad5 양성 시험관 내에서 혈청 및 항원뿐만 아니라 면역 원성을 탈출.

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

모든 바이러스 코딩 염기서열이 결여된 고용량 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 벡터 게놈에 포함된 전이유전자의 클로닝은 homing endonucleases를 기반으로 합니다. 부착 세포로 성장하고 현탁액에서 생산자 세포의 바이러스 증폭은 트랜스에 바이러스 유전자를 제공하는 보조 바이러스에 의존합니다.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

여기서, 우리는 pAdEasy 시스템을 사용하여 아데노바이러스 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 pAdTrack 및 pAdEasy-1 플라스미드의 재조합, 아데노바이러스 포장 및 증폭, 세포 용해 및 배양 배지에서 아데노바이러스 입자의 정제, 바이러스 적정, 아데노바이러스의 기능적 테스트를 포함한다.

아데노바이러스 생산을 위한 효율적인 방법

AAV 펩타이드 디스플레이 라이브러리 생성 및 차세대 AAV 생성을 위한 새로운 특성을 가진 후보 물질의 바코딩을 통한 후속 검증.

아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 변이체의 엔지니어링, 바코드 및 스크리닝을 통한 차세대 유전자 치료 벡터의 분리

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

이 프로토콜은 유전자 치료를 위한 중간엽 줄기세포(MSC) 유래 세포외 소포 생체 모방제를 생산 및 정제하는 방법을 도입하는 것을 목표로 합니다. 나노소포는 MSC 유래 지질 이중층으로 제한되어 있으며, 관심 유전자를 가진 재조합 AAV를 내강에 캡슐화합니다. 이 나노소포는 생체 내 유전자 전달을 위한 향상된 벡터를 제공합니다.

유전자 전달 증진을 위한 간엽 줄기세포 막 감싸 나노소포 개발

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

학습하세요 아데노바이러스 캡시드 화학적 변형 기법으로 유전자 치료 및 항암 치료용 벡터를 설계하는 방법을. 293 세포에서 90% 이상의 효율로 캡시드 단백질을 정밀하게 수정하여 맞춤형 유전자 전달 시스템을 구축할 수 있습니다.

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