Name: 구두 항생제 치료 후 Murine 장 Microbiota의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응-기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 생쥐 장내 미생물군집 변화를 정량화하는 qPCR 기반 분석 방법을. 구두 항생제 투여 후 미생물 불균형 연구에 활용할 수 있으며, 체중 감소를 최소화하는 효과적인 프로토콜을 제공합니다.

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이 작품은 영국 의학 연구 위원회 (샌드위치 미스터/L008157/1 부여);에 의해 투자 되었다 R.J. 마리 퀴리 Intra-European 화목 (H2020-MSCA-IF-2015-703639);에 의해 지원 되었다 P.M.B. 영국 의학 연구 위원회와 생물 의학 (미스터/N013700/1)에 왕의 대학 런던 박사 훈련 파트너십에서 재학 하 여 지원 했다.

여기에 설명 된 실험 6-8 주 오래 된 야생-타입 (C57BL6/J) 마우스는 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 시설에서 유지 관리를 사용 하 여 수행 했다. 모든 동물 실험은 왕의 대학 런던 및 프랜시스 크릭 연구소 동물 복지와 윤리적 검토 기관 및 영국 홈 오피스에 의해 승인 되었다. 어떤 동물 절차를 시작 하기 전에 적절 한 권한을 지역 기관/단체를 통해 가져온 확인 하십시오.
1입니다. 항생제의 관리
참고: 항생제 치료에 대 한 두 가지 대체 방법을 제공 됩니다: 구강 (단계 1.1) 및 식 수 (1.2 단계)를 통해 항생제의 관리.
<ol><li>구강<ol>
<li>다음과 같은 농도에서 압력가 마로 소독 물에 그들을 용 해 하 여 개별 항생제의 주식을 준비: 100 mg/mL에서 암 피 실린, 100 mg/mL에서 Gentamicin, 100 mg/mL에서 네오 마이 신, 10 mg/mL에 Metronidazole 및 100 mg/mL에서 Vancomycin. 필터는 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 약 수와-20 ° c.에 게</li>
		<li>위에 준비 하는 주식을 혼합 하 여 항생제의 칵테일을 준비 합니다. 1 mL의 볼륨에 대 한 암 피 실린 (5 mg/mL 최종)의 50 µ L, Gentamicin (5 mg/mL 최종)의 50 µ L, 네오 마이 신 (5 mg/mL 최종)의 50 µ L, Metronidazole (5 mg/mL 최종)의 500 µ L, Vancomycin (2.5 mg/mL 최종)의 25 µ L과 325 µ L의 물 혼합. 사용 하기 전에 칵테일 신선한 준비.</li>
		<li>살 균 1 mL 주사기로 항생제 혼합을 로드 하 고 모든 거품을 제거 하는 동안 적절 한 게이지 gavage 바늘 (20 G 15-20 g 마우스)을 수정.</li>
		<li>항생제 혼합의 200 µ L와 gavage 쥐입니다.<ol>
<li>마우스 어깨 피부를 단단히 잡고, 머리와 목 식도을 스트레칭. 볼-지붕 입 및 인 두의 뒤쪽을 따라 먹이 바늘의 팁을 직접. 그런 다음, 부드럽게 식도로 통과 하 고 200 μ 솔루션을 주입.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실험의 기간에 대 한 항생제 칵테일 한 번을 매일 관리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>식 수에 항생제 주의:은 신중 하 게 항생제 관리 식 수에서의 첫 2 주 동안 매일에 마우스 체중을 모니터링 합니다.<ol>
<li>압력가 마로 소독 물 1 L에 다음을 용 해 하 여 항생제의 칵테일을 준비: 암 피 실린 (1 g/L 최종), 네오 마이 신 (1 g/L 최종)에 Metronidazole (1 g/L 최종), Vancomycin (0.5 g/L 최종) 및 인공의 8 향 낭 (각 0.75 g) 0.5 g 1 g 1 g 1 g 감미료 (60 g/L 최종)입니다. 해산 때까지 흔들어. 4 ° c.에 게 참고: 감미료를 항생제의 맛을 숨기고 쥐 탈수를 방지 추가 됩니다. 몇 가지 감미료 브랜드 수 있습니다 작동 하는 동안 필요한 최종 농도 각 특정 브랜드에 대 한 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>물 병에 항생제 칵테일을 입력 (~ 100 mL/병) 마우스 케이지는 병을 놓습니다. 참고: 갈색 병을 사용 하거나 빛에서 항생제를 보호 하기 위해 호 일 병을 커버.</li>
		<li>실험 기간 동안 일주일에 두 번 신선한 주식으로 항생제 칵테일을 바꿉니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2.의 자, 회장, 내용과 회장 벽에서 배설물 샘플의 수집
<ol><li>무게 및 레이블 2 mL 샘플 컬렉션 압력가 관.</li>
	<li>신선한 대변 샘플의 컬렉션에 대 한 각 마우스는 restrainer에 놓고 컬렉션 튜브의 항문에서 직접 분 변 알갱이 수집 합니다. 참고: 샘플 또한 깨끗 한 압력가 장에 마우스를 배치 하 고 깨끗 한 소독된 집게와 대변 샘플을 수집 하 여 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>CO2 질 식 자 궁 경관 탈 구 다음으로 쥐를 안락사.</li>
	<li>완전히 노출 하는 복 부와 마우스 시체를 복 부 지역 70% 에탄올 스프레이.</li>
	<li>소독된 집게와가 위를 사용, 어떤 내부 조직을 손상 하지 않고 복 노출 하 복 부에 가로 절 개를 만들. 복 들어올린 내장 노출 절 개.</li>
	<li>집게와가 위 (위장 콜론)에서 내장을 제거 하 고 멸 균 페 트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>신중 하 게 사용 하 여 집게 소장 (SI)를 애타게 mesenteric 동맥과 지방. 소장을 확장 하 고 깨끗 한 실험실 지우기에 배치.</li>
	<li>통치자, 측정 고 시 (맹에 가까운 부분)의 말 초 회장의 4 cm를 잘라. 잘라내어 버리고 맹 근 위 소장 1 cm. 회장은 장내 박테리아를 수집 하는 데 사용할 것입니다 왼쪽의 3 cm 부분 있을 것입니다.</li>
	<li>2 mL 무 균 튜브에 회장 부분 (3 cm)를 개최. 밀어내어 직접 장과 colleting 튜브에서 샘플 장 콘텐츠를 수집 합니다. 이 샘플은 회장 내용에서 박테리아를 있을 것 이다.</li>
	<li>버퍼링 차가운 인산 염 (PBS)와 20 mL 주사기를 준비 하 고 플러시 회장 부분 (흐름을 통해 삭제).</li>
	<li>깨끗 한 종이 타월에 회장 부분을 놓고가 위 경도 열.</li>
	<li>메스와 회장 벽의 내부를 다쳤어요.</li>
	<li>깨끗 한 원심 분리기 튜브 위에 PBS의 1 mL를 메스를 세척 하 여 메스에 어떤 박테리아를 수집 합니다. 작은 박테리아는 상쾌한 삭제를 5 분 동안 8000 × g 에서 회전 합니다. 이 샘플은 회장 벽에서 박테리아를 포함 합니다. 참고:의 자, 회장 콘텐츠 및 벽에서 배설물 샘플 냉동 고 사용까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>무게는 튜브의 자 및 회장 콘텐츠 샘플을 포함 하 고 각 샘플에 배설물로 무게를 (에서 2.1 단계) 빈 관에서 체중을 빼기.</li>
	<li>자, 회장 콘텐츠 및 상용 키트를 사용 하 여 회장 벽 샘플에서 세균성 DNA를 추출 합니다. 사용까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>3입니다. 정량에 의해 장 Microbiota의 정량화
참고:이 절차 포함 표준 (3.1 단계)의 생성 및 표준과 배설물 샘플 (3.2 단계)에 대 한 정량 설정 하는 방법
<ol><li>정량에 대 한 표준의 생성<ol>
<li>연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 게놈 DNA 추출 시 약13 및 표 1에 자세히 설명 하는 PCR 조건 사용 하 여 세균성 문화에서에서 16S rRNA 유전자를 증폭 하는.</li>
		<li>1.5 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 하 고 상용 DNA 추출 키트를 사용 하 여 DNA 밴드를 정화.</li>
		<li>순화 된 DNA 조각 사용 하 여 참조 테이블의 자료, 항생제 내성 마커 및 블루/화이트 식민지 선택에 대 한 β-galactosidase (LacZ) 유전자 융해를 포함 하는 벡터를 사용 하 여 키트는 복제 선 DH10 유능한 변환 대장균 제조업체의 지침에 따라. 암 피 실린에 변환 접시 (100 µ g/mL), X-여자 (20 µ g/mL) Luria Bertani (파운드) 한 천 배지 (10 g/L Tryptone, 효 모 추출 물, 10 g/L NaCl, 15 g/L 한 천 5 g/L). 품 어 오버 나이트 (O/N) 37 ° c.</li>
		<li>접시에서 단일 포지티브 (흰색) 식민지를 선택 합니다. 5 mL 파운드 국물 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된에서 예방 하 고 O/N 37 ° C, 250 rpm에서 떨고에서 품 어.</li>
		<li>O/N 문화에서 분리 하 고 제조업체의 지침에 따라 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 플라스 미드 정화. 참고:이 단계에서 플라스 미드 16S rRNA 유전자의 복사본을 하나만 포함 되어 있는지 확인 하 고 자료 쌍 (bp)의 길이 결정 하는 플라스 미드 삽입 순서 중요 하다.</li>
		<li>플라스 미드를 한 번만 인하를 제한 효소로 플라스 미드 선형화</li>
		<li>상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 선형화 플라스 미드 정화.</li>
		<li>260에서 흡 광도 측정 하 여 플라스 미드의 농도 결정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>다음 수식14를 사용 하 여 샘플의 플라스 미드 복사본 / µ L의 수를 계산. 복사본의 수 = (금액 * 6.022 × 1023) / (길이 * 1 × 109 * 650) 금액이 3.1.8 (ng / µ L);에 단계에서 얻은 DNA 농도 그리고 길이 혈압에 (삽입)와 플라스 미드의 총 길이. 사본의 수 복사본 / µ L로 얻을 것 이다. 참고: 플라스 미드 사본의 수의 쉬운 계산 수 있도록 위의 수식에 따라 온라인 도구가 있습니다.</li>
		<li>약 수 그리고 저장소 사용까지-20 ° C에서 필요에 따라 표준.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정량 표준 및 배설물 샘플에 대 한 설정<ol>
<li>녹여 정량 (에서 단계 3.1.10) 표준, (에서 단계 2.15) 배설물 샘플 DNA 및 얼음에 (에서 상용 키트) 정량 시 약. 참고:이 예제에서 사용 하는 정량 Pcr 시 약 포함 SYBR 녹색 정량 Pcr 반응 혼합 및 역방향 뇌관 (표 2).</li>
		<li>10에서 범위에서 살 균 DNA 무료 물에서 표준 희석7 102 복사본 / µ L (10에서예를 들어, 1/5 직렬 희석7 102 복사본 / µ L x 6.4). 희석 배설물 샘플 DNA를 1/2, 1/5, 1/10.
</li>
		<li>반응 플러스 1 (표 2)의 총 수에 대 한 마스터 혼합 반응을 확인 합니다.</li>
		<li>믹스 마스터 및 서식 파일 (표준, 샘플 또는 부정적인 제어를 위한 물)의 5 µ L의 믹스 30 µ L</li>
		<li>384 잘 광 정량 접시에 각 잘에이 혼합의 10 µ L를 추가 합니다. 3 중 각 반응을 수행 합니다.</li>
		<li>정량 장소 인감, 간단히 원심 및 로드 자전거 다음과 프로그램 정량 Pcr 기계에 접시: 95 ° C의 40 주기 뒤 20 분 동안 95 ° C 15 s를 1 분 동안 60 ° C.</li>
		<li>표준 및 샘플에 대 한 CT 값을 가져옵니다.</li>
		<li>(으로 단계 3.1.9에서에서 계산) 플라스 미드의 사본 숫자의 로그 대 표준에 대 한 CT 값을 플롯 하 여 표준 곡선을 생성 합니다. 표준 곡선의 직계 회귀를 수행 합니다.</li>
		<li>표준 곡선에서 (단계 3.2.2에서에서 얻은) CT 값을 보간하여 배설물 샘플 16S rDNA 복사본 수를 계산 합니다. 참고: 각 샘플에 대 한 16S rDNA 복사 번호 수정 해야 합니다 (으로 단계 3.2.2에서에서 준비) 샘플의 희석 비율을 고려 하 고 최종 볼륨 핵 산 (2.15 단계)에서 eluted 했다 그를 분 변 샘플 (에서 계산된 단계 2.14)의 양 유전자는 배설물의 그램 당 복사합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리가 제공 실험 프로토콜 항생제의 구강 관리에 대 한 마우스 및 배설물 박테리아의 정량화를 정량 하 여. 항생제의 조합 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 박테리아의 전체 스펙트럼에 대 한 살 균 활동을 제공 하 고이 프로토콜 (암 피 실린, gentamicin, 네오 마이 신, metronidazole, vancomycin를 포함 하는) 대상에 사용. 구강 및 식 수에 항생제의 관리 크게 배설물 박테리아 감소 로드5,,612. 또한, 두 치료 그들은 몇 가지 특성 감소 비장의 크기 확대 맹 등 무 균 쥐의 전형적인 개발 쥐의 표현 형에 깊은 영향을 있다. 항생제 관리에 대 한 특정 메서드의 선택 가능 하 게 따라 달라질 수 있습니다 실험의 길이에 구강 방법을 필요로 더 노동 집약 되 고 가능 하 게에 더 많은 불편을 초래 하는 항생제의 매일 관리는 장기간에서 동물입니다.
식 수에 항생제의 관리에 대 한 주의 해야 합니다 촬영 항생제 혼합물에 감미료의 추가 함께이 탈수에서 생쥐를 유지 하는 중요 한 요소입니다. 몇몇 그룹 (감미료의 추가) 없이 식 수에 항생제의 관리 모든 쥐 실험5 의 처음 몇 일 이내에 초기 몸 무게의 20%를 잃고 매우 심각 하 고 급속 한 체중 감량을 리드 어떻게 나타났습니다. , 6. 우리의 프로토콜에 기반 설탕 감미료를 사용 하 여 물, 항생제 관리 후 처음 몇 일에 무게를 잃은 마우스에 항생제 맛을 마스크에 충분 한 것 같았다 하지만 그 ( 후 그들의 무게를 신속 하 게 복구 그림 1). 그럼에도 불구 하 고, 우리의 실험에서 쥐의 5-10% 아직도 도달의 인간의 끝점 > 기준선의 20% 손실 체중 및 안락사 될 하는 데 필요한. 우리는 또한 완전히 쥐 탈수를 방지 하지 못했습니다 sucralose 기반 감미료 테스트 (쥐 손실의 100% > 체중의 20%) 다른 저자는 감미료 아스파탐 기반5,6에 대 한 유사한 오류를 출판 하는 동안. 이것에 추가, 나이, 유전적 배경 및 일반적인 건강 상태는 실험을 위해 사용 하는 마우스의 고려 되어야 한다, 그들은 영향을 미칠 수-체중 및 동물 복지 항생제 치료 중으로. 따라서, 마우스 무게와 일반 건강 상태 주의 모니터링 구두 항생제 관리의 첫 2 주 동안 매일 수행 되어야 한다.
정량 방법 배설물 샘플에 16S rRNA의 정량화에 대 한 신속 하 고 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 그러나, 몇 가지 제한 사항이 포함 하 여이 기술에 대해 고려해 야 합니다: 내가) 믿을 수 있는 높은 품질 표준;에 대 한 요구 사항 ii) 설계 및 정량 Pcr 뇌관;의 효율성 3) 미생물 16S rRNA 유전자의 다른 복사본 수를 할 수 있다는 사실, 따라서 유전자 사본 수 있습니다 직접 평등 하지 셀 수15. 그럼에도 불구 하 고, 정량 배설물 샘플의 신속한 분석을 가능 하 게 강력 하 고 중요 한 방법입니다. 이 메서드는 신속 하 게 자세한 여기로 배설물의 세균 중에 다양 한 치료 (항생제 등)의 효과 확인 하기 위해 특히 유용할 수 있습니다. 또한, 우리가 총 16 기의 정량화에 대 한 프로토콜을 제공 rRNA,이 방법을 적용할 수 있습니다 쉽게 (특정 뇌관16여)을 양적 모두 제공 하는 개별 세균성 taxa의 식별을 가능 하 게 하 고 미생물 크기와 구성에 대 한 질적 정보입니다.
요약 하자면, 우리가 제공한 두 개의 프로토콜 마우스 및 배설물 박테리아에 항생제 유도 변화 척도를 정량 기반 방법의 경구 항생제 치료에 대 한. 이러한 프로토콜을 더 최적화 될 수 있으며 개별 실험 필요에 따라 다른 접근에와 함께, 그들은 수 역할을 빠르고 비용 효율적이 고 안정적인 도구 murine 장 microbiota를 조작 하 고 효과의 연구 장 항상성 그리고 질병에 항생제 치료.

포유류 위장 점 막의 호스트와 함께 mutualistic 관계를 설정 하는 매우 복잡 한 혼합물에 의해 식민지 독특한 환경 이다. 장 점 막의 방어 시스템 구성 상피 층과 그들의 수 및 다양성을 유지 하면서 소장 내에서 공생을 제한 하는 면역 세포의 과다. 반대로, 공생 생물은 완전히 기능 면역 시스템의 개발에 필요한. 호스트 및 공생 박테리아 사이의 상호 작용은 일반적으로 도움이 되 고 점점 더 분명 그 dysregulated 면역 시스템 microbiota 누화 만성 염증 성 질병, asinflammatory 대 장 등의 개발을 찬성 수 있습니다. 질병, 관절염 이나 천식1,2.
본질적인 microbiota 다양 한 요인에 의해 변경 될 수 있습니다 하지만 아마도 가장 급격 한 변화는 심각 하 게 변경 하는 크기와 세균성 지역 사회3,4의 항생제 치료에 의해 유도 된다. 감염을 치료 하는 항생제의 장점은 의심, 하는 동안 인간의 항생제 노출에 의해 유도 된 microbiota 변화 건강에 해로운 영향으로 이어질 수 있는 면역 방어를 수정할 수도 있습니다. 예를 들어, 인 간에 있는 항생제 치료 Clostridium 남과 어울리지 않는의 위험 증가에 연결 되었습니다-설사, 천식 그리고 특정 유형의 암3유도. 쥐에 항생제 치료 영향 및 장기 변경 항생제 치료 환자의 창 자 커뮤니티에서 발견이 고 미생물 지역 사회 변화 및 면역 세포 기능 간의 기계적 링크의 조사를 사용할 수 있다. 그러나, 몇 가지 보고서로 쥐의 파울 맛5,6때문에 아마도 식 수에서 참 음료수 광고 libitum 에 항생제의 관리 매우 눈에 띄는 체중 감량 결과 나타났습니다. 따라서, 이러한 모델에 구두 항생제 관리를 수 반하는 심한 탈수 있습니다 복잡 하 게 면역 세포 기능에 항생제 치료의 효과 확인 하는 것을 목표로 하는 실험의 해석.
몇 가지 방법은 크기와 장 구획7미생물 커뮤니티의 구성에 사용할 수 있습니다. 하지만 차세대 시퀀싱 기술 이러한 메서드는 상대적으로 저렴이 문제8, 귀중 한 데이터 제공 하 고 데이터의 해석에 대 한 전문가 bioinformatic 분석 필요. 다른 한편으로, 전통 미생물 문화 방법 세균성 종 검출을 허용 하지만 그들은 낮은 감도 있고 공생 박테리아 (특히 anaerobes)의 큰 분수는 매우 어렵거나와 육성 현재 사용할 수 있는 방법8. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 기법 사용 되고있다 점점 정량화 및 지저분한 세균성 종의 식별에 대 한 총 미생물 부하의 신속 하 고 안정적인 문화 독립적인 측정을 제공 하는 그들은. 따라서, 정량 방법 나이 또는 선 동적인 장 질병9,10를 포함 하 여 여러 질병의 진행과 관련 된 microbiota에 변화를 공부 하는 데 유용 증명. 이 맞춰 정량 메서드는 지저분한 세균성 부하 및 microbiota 구성10,,1112(항생제 등) 다양 한 치료의 효과 확인 하기 위해 신속 하 고 비용 효율적인 접근을 제공 합니다.
여기, 선물이 구두 항생제 관리에 대 한 두 가지 프로토콜의 자세한 단계별 계정 쥐, 배설물 샘플 수집, DNA 추출, 표준의 준비 및 배설물 샘플에서 박테리아의 정량화를 정량 하 여. 이러한 프로토콜 쥐에서 장 microbiota를 조작 하 고 장내 항상성 및 질병에 항생제 치료의 효과의 연구를 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>네오믹닌 트리설페이트 염 수화물</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>N1876</td><td></td></tr><tr><td>메트로니다졸</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>반코마이신 염산염</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>V2002</td><td></td></tr><tr><td>황산 겐타마이신 염</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>감미료 Sweet'n Low</td><td>Sweet'N Low</td><td></td> 영국<td>에서 Amazon.co.uk</td></tr><tr><td>X-Gal(5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside)</td>Fisher에서 사용 가능 <td> 과학적</td><td>10234923</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>초순수 아가로스</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR 등급 물</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) 용액 혼합물</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725124</td><td>with ROX</td></tr><tr><td>TOPO TA cloningTM for sequencing</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td> <td>450030</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp fast DNA 스툴 미니 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 Miniprep 키트</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel&nbsp; 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 0.45 &micro; m</td><td>Fisher scientific</td><td>10460031</td><td></td></tr><tr><td>Swann-MortonTM 탄소강 멸균 메스 블레이드</td><td>Fisher scientific</td><td>11792724</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (1 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (20 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Crystal clear microcentriguge tube</td><td>StarLab</td><td>E1415-1500</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Ultra high 회수 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>StarLab</td><td>I1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>구강 투여 바늘 20 G x 38 mm 곡선 (pk/3)</td><td>Vet-Tech</td><td>DE008A</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 페트리 디쉬 50 mm&nbsp;</td><td>과학 실험실 용품</td><td>PET2020</td><td></td></tr><tr><td>절대 qPCR 플레이트 씰</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmpTM 광학 384-웰 플레이트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>384웰 블록이 있는 ViiA7TM 7 real-time PCR 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계 (Nanodrop 1000)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Prism microcentrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2500</td><td></td></tr><tr><td>MultiGene Optimax Thermal cycler</td><td>랩넷</td><td>TC9610</td><td></td></tr></tbody></table>

구두 항생제 치료 후 murine 장 microbiota의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응-기반 분석

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

본질적인 microbiota은 인간의 건강에 중앙 영향. 미생물 dysbiosis 선 동적인 장 질병, 천식, 관절염 등 많은 일반적인 immunopathologies와 연결 됩니다. 따라서, 중요 한 중요성의 이다 누화 microbiota 면역 시스템을 기본 메커니즘을 이해. 병원 체 허가 방 조 하는 동안 항생제 관리는 또한 크기와 인간의 건강에 영향을 미칠 수 있는 장내 세균 커뮤니티의 구성에 과감 한 변화를 유도 합니다. 쥐에 항생제 치료 영향 및 항생제 치료 환자에서 인간의 microbiota에 장기적인 변화가 고 미생물 지역 사회 변화 및 면역 세포 기능 간의 기계적 링크의 조사. 쥐의 항생제 치료에 대 한 몇 가지 메서드를 설명 하는 동안 그들 중 일부는 심한 탈수와 체중 데이터의 해석을 복잡 하 게 유도. 여기, 구두 항생제 관리 주요 체중 감량을 유도 하지 않고 마우스의 장기 처리를 위해 사용 될 수 있는 두 개의 프로토콜 제공 합니다. 이러한 프로토콜 항생제의 조합을 대상으로 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 사용 하 게 하 고 어느 광고 libitum 식용 수 또는 구강에 의해 제공 될 수 있다. 또한, 항생제 치료의 효능을 확인 하는 데 사용할 수 있는 정량 하 여 배설물 샘플에 미생물 밀도의 정량화 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 접근의 조합 장 microbiota의 조작 및 쥐에 항생제 치료의 효과의 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 방법론을 제공합니다.

여기 우리는 쥐의 경구 항생제 치료에 대 한 두 개의 대체 프로토콜을 제공합니다. 그림 1 마우스 연속 10 일 동안 항생제로 구강 (빨간색) 이나 식 수 (블루) 치료에 몸 무게 (각 동물에 대 한 원래 기본 선 두께 관련)의 비율을 보여줍니다. 아니 눈에 띄는 체중 감량은 구강으로 항생제를 수신 하는 쥐에서 발견 된다. 때 마우스 항생제 광고 libitum 식 수에서로 처리 됩니다, 그들은 체중 (~ 10%), 항생제 관리의 처음 몇 일 이내에 그러나, 복구 정상적인 체중 증가 그 후 (그림 1). 그럼에도 불구 하 고, 약 5-10% 식용 수에서 항생제를 받은 쥐의 도달할 수 &gt; 20% 체중 감소 치료의 첫 번째 주 내에서 그들은 안락사는 어떤 경우에.
분 변 샘플에서 박테리아의 정량화는 정량 (3.2.7 단계)에서 얻은 CT 값 대 (와 단계 3.2.2에서에서 계산 된) 표준에 대 한 복사 숫자의 로그를 플롯 하 여 적절 한 표준 곡선의 사용을 해야 합니다. 그림 2A 는 R2 값이 0.99827,-3.09 및 효율을 기울기의 표준 곡선 성능 기준에 부합 하는 표준 곡선에서 대표적인 예를 보여 줍니다 ((-1 + 110%의 10^(-1/slope))*100). 0.99 및 PCR 효율 90 ~ 110%의 범위 내에서 R2 값은 기본 설정입니다. 선형 범위 내에서 회귀 분석 방정식 배설물 샘플 내에서 16S rDNA 풍부의 정량화를 수 있습니다. 그림 2B 지저분한 대변, 시 내용과 시 벽에 16S rDNA 복사본의 수를 나타냅니다. 그림 2B 에서 데이터는 지저분한 대변 및 SI 콘텐츠에 대 한 배설물 샘플의 16S rDNA 복사본/g로 표시 됩니다. 시 벽에 대 한 데이터 (수량 시작 물자의 정확한 무게를 너무 작습니다)로 시 벽의 3 cm에서 복구 하는 박테리아에서 얻은 16S rDNA의 총 수로 표시 됩니다.
분 변 샘플에서 박테리아의 밀도에 항생제의 효과 평가 하려면 마우스 했다 항생제로 치료 구강에 의해 매일 10 일 동안 (1 ~ 10 일) 전날 (0), 대변 샘플 수집 된 및 항생제 치료 (동안 서로 다른 시간 지점에서 일 5, 10), 그리고 항생제 관리 (하루 17; 중지 한 후 7 일 그림 3A)입니다. 그림 3B에서 같이, 항생제 치료 16S rDNA 복사본/g 5와 10 일 동안 정상 수준 (전처리에 비해) 후 1 주 복구 하는 배설물에 박테리아의 밀도 배설물의 수에서 강한 감소를 유도 항생제 관리 (17 일) 중지 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg"> 그림 1: 항생제의 관리. 마우스 구강 (빨간색) 이나 식 수 (블루) 10 일 연속에 대 한 항생제를 받았다. 플롯 항생제 관리 (0 일) 전에 원래 무게를 기준으로 실험 기간 내내 쥐의 가중치를 보여 줍니다. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg"> 그림 2: 표준 및 배설물 샘플의 16S rRNA 유전자 정량 Pcr 증폭. (A) 표준 곡선 설명자 표준 곡선의 선형 회귀. (B) 유전자 나타났는데 지저분한 샘플에서 계산 합니다. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg"> 그림 3: 배설물 박테리아 항생제 치료 중. 구강 (Ab) 및 샘플 컬렉션으로 표시 하 여 항생제 관리에 대 한 일정의 개략도 (A) *. (B) 16S rDNA 마우스 표시 일 수집에서 대변 샘플에 배설물의 그램 당 복사 합니다. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>8 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>버퍼 10 X</td>
			<td>2 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>0.4 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria-F 뇌관 (10 mM)</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria-R 뇌관 (10 mM)</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq Polimerase</td>
			<td>0.2 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>7.4 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>총 볼륨</td>
			<td>20 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 순서</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria-F 뇌관</td>
			<td>5 ' 3' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria-R 뇌관</td>
			<td>5 ' 3' ATTACCGCGGCTGCTGGC</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>사이클링 조건</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>온도</td>
			<td>시간</td>
			<td>사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>5 분</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>1 분</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>5 분</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: PCR 시 약 및 조건. 이 표에서 시 약 및 정량 분석 실험에서 사용 하는 표준의 생성에 대 한 세균성 문화에서 16S rRNA 유전자 증폭 PCR 순환 상태를 제공 합니다. 뇌관 시퀀스 Kruglov 그 외 여러분 에 의해 원래 간행 되었다 13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>SYBR 녹색 마스터 믹스 (2 배)</td>
			<td>17.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria-F 뇌관 (10 mM)</td>
			<td>0.7 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubacteria-R 뇌관 (10 mM)</td>
			<td>0.7 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>11.1 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 정량 마스터 믹스. 볼륨 표시 (최종 볼륨 35 µ L) 3 중 (10 µ L 각) 384-잘 정량 접시 (5 µ L pipetting 오류에 대 한 추가 고려)에 실행 되도록 단일 샘플에 대 한 있습니다. 양은 분석할 샘플 수에 따라 확장할 수 있습니다.

여기 우리가 제공 자세한 프로토콜 항생제의 구강 관리에 대 한 쥐, 배설물 샘플, DNA 추출 및 배설물 박테리아의 정량화를 정량 하 여.

구두 항생제 치료 후 Murine 장 Microbiota의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응-기반 분석

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

이 프로토콜은 경구 항생제 투여 에 따른 마우스의 장 내 미생물제 변화를 정량화하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 이것은 선동적인 장 질병과 같은 미생물 dysbiosis와 관련되었던 병리에 있는 통찰력을 제공하는 교차 microbiota 상호 작용에 대한 연구를 도울 수 있습니다. 이러한 항생제 치료 정권의 주요 장점은 일반적으로 마우스에 경구 항생제 투여와 관련된 특성 체중 감소를 방지한다는 것입니다.경구 개비지를 통해 항생제 치료를 개혁하기 위해 기술 프로토콜에 설명된 대로 준비된 스톡 솔루션을 혼합하여 항생제의 칵테일을 준비한다. 밀리리터 믹스 50 암피실린 마이크로리터, 젠타미신 50 마이크로리터, 네오마이신 50 마이크로리터, 500 마이크로리터 의 메트로니다졸, 25 개의 반코미신 및 325 마이크로 리터의 물. 항생제 믹스를 1밀리리터 주사기에 적재하고 거품을 제거하고 적절한 게이지 게이지 바늘을 부착합니다.마우스 어깨 위에 피부를 단단히 잡고 머리와 목을 스트레칭하여 식도를 곧게 펴습니다. 입의 지붕을 따라 그리고 인두 뒤쪽으로 먹이 바늘의 볼 끝을 지시합니다. 그런 다음 식도에 부드럽게 전달하고 200 마이크로 리터의 용액을 주입하십시오.실험 기간 동안 매일 항생제 칵테일을 투여하십시오. 또는 식수를 통해 항생제를 투여하기 위해 기술 프로토콜에 설명된 항생제 칵테일을 준비하십시오. 이것은 마우스 탈수를 방지하기 위하여 결정적인 요인이기 때문에 항생제 혼합물에 감미료를 포함하는 것이 중요합니다.항생제 칵테일을 병당 약 100 밀리리터로 물병에 넣습니다. 병에 가볍고 마우스 케이지에 배치하십시오. 실험 기간 동안 항생제 칵테일을 일주일에 두 번 신선한 육수로 대체하십시오.마우스 무게와 일반적인 건강 상태의 주의 깊은 모니터링은 항생제 투여 를 통해 매일 미리 형성되어야합니다. 샘플 수집을 위해 2밀리리터 오토클레이브 튜브의 무게를 측정하고 라벨을 부착합니다. 신선한 대변 샘플의 컬렉션은 억제제에 각 마우스를 배치합니다.그런 다음 수집 튜브에서 항문에서 직접 배설물 펠릿을 수집합니다. 기술 프로토콜에 설명된 바와 같이 안락사를 수행한 후 복부가 완전히 노출된 마우스 시체를 낳고 70%에탄올로 복부 부위를 분사한다. 멸균 된 집게와 가위를 사용하면 복부에 횡절개를하여 내부 조직을 손상시키지 않고 페라테늄을 노출시합니다.페라테늄을 들어 올리고 내장을 노출하기 위해 절개를합니다. 집게와 가위로 내장을 제거하고 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 조심스럽게 막힘 동맥과 지방에서 소장을 애타게하는 집게를 사용합니다.내장을 확장하고 깨끗한 실험실 닦아에 놓습니다. 통치자 측정과 소장의 말단 일체의 4 센티미터를 잘라. 절단하고 cecum에 내장 근위1 센티미터를 폐기.장 내 세균을 수집하는 데 사용되는 장왼쪽 의 3 센티미터 부분이있을 것입니다. 2 밀리리터 멸균 튜브 위에 ileum 부분을 누릅니다. 내장을 직접 압출하고 튜브에서 샘플을 수집하여 장 함량을 수집합니다.이 샘플은 ileum 함량에서 박테리아를 가질 것이다. 차가운 인산염 완충식식염으로 20 밀리리터 주사기를 준비하고 흐름을 버리는 일루를 플러시합니다. 멸균 페트리 접시에 ileum 부분을 놓고 가위로 세로로 엽니다.테리움 벽의 내부를 메스로 긁어냅니다. 깨끗한 원심분리기 튜브 위에 PBS 1밀리리터로 세척하여 메스에 박테리아를 수집합니다. 박테리아를 펠릿 5 분 동안 8천 번 G에서 회전.원심분리에 따라 상체가 폐기됩니다. 이 샘플은 ileum 벽에서 박테리아를 포함 합니다. 대변과 일루에서 샘플을 포함하는 튜브를 무게.각 샘플에서 배설물 무게를 얻기 위해 빈 튜브에서 무게를 빼냅니다. 시판되는 키트를 사용하여 대변, ileum 함량 및 ileum 벽 샘플에서 세균 DNA를 추출합니다. 사용 전까지 DNA 샘플을 영하 20도에서 보관하십시오.qPCR 표준, 대변 샘플 DNA 및 qPCR 시약을 얼음에 시판되는 키트에서 해동하십시오. 10에서 7에서 10까지의 범위에서 미생물 DNA 없는 물에 있는 표준을 마이크로리터 당 2개의 사본에 희석시 희석시. 배설물 샘플 DNA를 반, 15및 10분의 1 농도로 희석시.그런 다음 총 반응 수와 1개에 대한 마스터 믹스 반응을 만듭니다. 마스터 믹스의 마이크로리터 30개와 네거티브 컨트롤을 위한 표준, 샘플 또는 물인 템플릿의 마이크로리터 5개들을 혼합합니다. 그런 다음 384 개의 잘 광학 qPCR 플레이트에 이 믹스의 10 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다.트리플리케이트로 각 반응을 수행합니다. qPCR 플레이트와 원심분리기를 간단히 밀봉합니다. 그런 다음 기술 프로토콜에 나열된 대로 프로그래밍된 qPCR 컴퓨터에 플레이트를 로드합니다.마지막으로 배설물 샘플에 대한 16S rDNA 복사 번호를 계산하기 전에 표준 및 샘플에 대한 사이클 임계값값을 가져옵니다. 대표적인 결과는 구강 개비에 의한 항생제 투여 후 또는 식수를 통해 마우스에서 체중 감소를 나타낸다. 구강 개비에 의해 항생제를 받는 마우스에서는 눈에 띄는 체중 감소가 발견되지 않습니다.마우스가 식수에서 항생제로 치료될 때 치료 후 정상적인 체중 증가를 회복하는 첫 며칠 이내에 체중의 약 10 %를 느슨하게합니다. 배설물 시료에서 박테리아의 정량화는 qPCR에서 얻은 C-T 값과 표준에 대한 복사 수의 logarithm을 플로팅하여 얻은 표준 곡선의 사용을 요구한다. 선형 범위 내에서 회귀 분석 방정식은 배설물 샘플 내에서 16S rDNA 풍부를 정량화할 수 있게 한다.대변, 소장 함량 및 소장 벽 샘플에 대해 여기에 표시된 바와 같이. 경구 항생제 투여 5 일 또는 10 일 후에 항생제 처리된 마우스에서 대변 견본에 있는 박테리아의 밀도에 있는 강한 감소가 있습니다. 그러나 대변에 있는 박테리아의 조밀도는 항생제 행정이 중단된 후에 1 주일 정상 수준으로 회복되었습니다.구강 개간및 식수내 항생제 투여모두 처리된 마우스의 배설물 세균 부하를 잠시 감소시다. 치료 기간과 같은 요인을 고려하여 실험 요구 사항에 더 잘 맞는 개별 방법을 선택하는 연구원. 박테리아의 정량화를 위한 qPCR 방법은 특정 프라이머를 사용하여 개별 세균성 택시를 정량화하도록 수정될 수 있다.이것은 미생물군유전체 크기와 조성에 대한 정량적 및 자질 정보를 모두 제공합니다.

quantitative-polymerase-chain-reaction-based-analyses-murine

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Lo, B. C. 외 만성 살모넬라 감염으로 인한 장섬유증. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 스트렙토마이신 내성 살모넬라 티피무리움 에 감염된 마우스 모델에서 박테리아 부하를 정량화하는 과정을 보여줍니다. 안락사와 멸균 해리 후에는 맹장과 비장 조직을 채취하여 박테리아를 방출하기 위해 강철 구슬로 균질화하고, 연속적으로 희석합니다. 희석액은 선택적 한천에 도판되며, 가시적 군락을 세기 위해 장 및 전신 부위의 조직당 세균 부하를 추정합니다.

만성 장 감염 마우스 모델에서 조직 세균 부하의 정량화

항생제 효능은 가장 일반적으로 사멸 역학 연구를 수행하고 집락 형성 단위(CFU)를 측정하여 결정됩니다. 주사전자현미경(SEM)을 이러한 표준 방법과 통합함으로써 다양한 항생제 간의 치료의 약리학적 효과를 구별할 수 있습니다.

형태 변화를 규명하기위한 프로토콜<em&gt; 클로스 트리 디움 디피 실</em&gt; 항생제 치료에 대한 반응

박테리오신은 다양한 생태 학적 틈새에서 미생물 다양성을 정의하는 데 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 여기서 우리는 박테리오신이 동물 모델에서 장내 미생물 구성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다.

마우스의 장내 미생물에 대한 박테리오신 효과 평가 방법

이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

환경 농축 (EE) 생활, 스트레스, 질병 사이 연결의 기반이 되는 메커니즘을 공개 하는 데 사용 되는 동물 주택 환경입니다. 이 프로토콜에서는 콜론 tumorigenesis EE의 마우스 모델을 사용 하 여 특별히 microbiota 생물 다양성 동물 사망률에 영향을 줄 수 있는 변경을 정의 하는 프로시저를 설명 합니다.

마우스 결 장 종양 모델에서 콜론 미생물 생물 다양성에 환경 농축의 효과 정의 하는 방법

여기, 선물이 위장 장 관의 생리 조건을 시뮬레이션 bioreactors의 시리즈를 사용 하 여 콜론 생체 외에서, 의 본질적인 microbiota 경작을 위한 프로토콜.

인간의 본질적인 Microbiota 공부 기술을 경작 하는 체 외에서 고급 적용

이 프로토콜은 자가면역 질환 발병 중 쥐 장내 미생물 변화를 분석하기 위한 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 제공합니다.

간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석

여기에서는 연구 동물이 최소한의 스트레스와 불편함으로 치료제를 쉽게 섭취하도록 장려하는 구강 배당의 대체 방법으로 마이크로피펫 유도 약물 투여(MDA)를 설명합니다.

설치류 모델에서 구강 배게이지에 대한 대체 방법으로 마이크로피펫 유도 약물 투여 사용

이 프로토콜은 비염증 조건에서 pks+ 대장 균 쥐를 정착하는 데 필요한 절차와, 대변 내 pks+ 대장균 확장의 비침습적 확립 및 평가 방법을 설명합니다.

비염증 조건에서 마우스 pks+ 대장균에 의한 정착

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

배우세요 생쥐 장내 미생물군집 변화를 정량화하는 qPCR 기반 분석 방법을. 구두 항생제 투여 후 미생물 불균형 연구에 활용할 수 있으며, 체중 감소를 최소화하는 효과적인 프로토콜을 제공합니다.

구두 항생제 치료 후 Murine 장 Microbiota의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응-기반 분석

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