Name: 실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 학습하세요 실시간 형광 현미경을 이용하여 완전한 상태의 murine 관절 연골에서 연골세포 손상을 평가하는 방법을. 이 기술은 퇴행성관절염 메커니즘 연구와 유전적 요인이 기계적 손상에 미치는 영향을 분석하는 데 활용됩니다.

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저자는 그들의 pH 미터 및 osmometer의 관대 한 사용에 대 한 박사 리처드 Waugh와 루이스 Delgadillo을 감사 하 고 싶습니다. 또한, 저자 안드레아 리 기계 테스트 시스템의 초기 발전에 기여 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 NIH P30 AR069655에 의해 투자 되었다.

모든 동물 작업 동물 자원에 로체스터의 대학 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 솔루션
<ol><li>행 크의 균형 소금 솔루션 준비 (1 X HBSS) 포함 하는 칼슘, 마그네슘, 아무 페 놀 레드. HCl 이나 NaOH의 소량을 추가 하 여 pH 7.4에 조정 합니다.</li>
	<li>NaCl 또는 이온된 수를 추가 하 여 303 mOsm osmolarity를 조정 합니다. 버퍼를 사용 하 여 해, 견본 준비 및 기계적 테스트 중.</li>
</ol>2. 원심 대 퇴 골과 완벽 하 게 그대로 관절 연골과 근 위 상 완 골의 해
<ol><li>뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입 챔버를 사용 하 여 기관의 지침에 따라 마우스를 안락사 무 균 기술을 통해 따릅니다. 참고: 8 및 81 주 어떤 긴장의 오래 된과 섹스 사이의 마우스 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>해에 대 한 다음과 같은 수술 도구를 사용 하 여: 마이크로-가 위 (절 개를 만들기 위해 사용), 표준 해가 위 (뼈를 절단 사용), # 11와 메스 메스 블레이드 (절단 부드러운 조직에 사용), 보석의 집게 (소프트의 제거에 사용 조직) 및 표준 집게 (부드러운 조직과 피부 필 링에 사용).</li>
	<li>원심 대 퇴 골의 해 에 대 한 아래의 지침을 따르십시오.<ol>
<li>부정사 위치에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>무릎의 앞쪽 부분에 피부에 절 개를 작은 (~ 5 m m)를 확인 합니다.</li>
		<li>무릎 주위 모든 방법으로 절 개를 확장 하 고 다시 무릎 관절과 다리 근육을 노출 피부를 당겨.</li>
		<li>대 퇴 골의 근 위 끝에서 시작 하는 것 사용해 원심 방향을 따라 잘라 메스 블레이드 (#11). 위치 블레이드 quadriceps 근육-힘 줄 단위 사이의 대 퇴 축의 앞쪽 측면입니다. 그리고 과거의 슬 개 골 컷을 확장 하 고 quadriceps 근육-힘 줄 단위 제거, 슬 개 골 힘 줄의 가운데를 잘라서 마무리.</li>
		<li>대 퇴 골의 근 위 끝에서 시작 하는 것 사용해 원심 방향을 따라 잘라 메스 블레이드 (#11). 햄 스트링 근육-힘 줄 단위와 퇴 축의 후부 측면 사이 블레이드를 놓습니다. 일단 컷 접근 무릎 관절, 메스와 대 퇴 골의 원심 condyles에 관절 표면 사이 접촉을 피하고 부드러운 조직을 통해 절단을 시작 합니다. 과거의 무릎 관절 절단 완료.</li>
		<li>다시 당겨 quadriceps와 대 퇴 골을 노출 하는 햄 스트링 근육. 멀리 대 퇴 골의 측면 및 중간 면에 어떤 과잉 근육을 잘라.</li>
		<li>근 위 경골의 후부 측면에서 종 아리 근육을 잘라내어 다리 대 퇴 골의 후부 측면 시각화를 플립.</li>
		<li>무릎 관절 주위 초과 조직을 제거 하 여 대 퇴 골의 근 위 경골의 후부 표면 원심 condyles을 노출 합니다.</li>
		<li>앞쪽 및 후부 십자 인 대 퇴 condyles 떨어져 절단, 메스를 사용 하 여 잘라. 당겨 대 퇴 골에서 경골 및 대 퇴 골에서 더 낮은 다리를 분리 모든 인 대를 잘라.</li>
		<li>측면 쪽에서 뼈 (tibio-대 퇴 관절 위에 8 m m)의 근 위 끝에는 대 퇴 골을 통해 잘라 표준 해가 위를 사용 하 여. 뼈를 절단 후 닦아 떨어져 어떤 보이는 골 수 골 수 세포에서 가능한 오염을 피하기 위하여 뼈의 외부에. 참고: 옆 측에서 절단 뼈 따라 균열 전파의 위험을 줄여줍니다.</li>
		<li>보석의 집게를 사용 하 여 대 퇴 골에서 부드러운 조직 (즉, 인 대 및 초과 근육)을 둘러싼 제거 하 고 대 퇴 골의 원심 끝에 두 condyles에 연골을 노출. 연골과 집게 사이 접촉을 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상 완 골의 해 에 대 한 아래의 지침을 따르십시오.<ol>
<li>부정사 위치에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>마이크로-가 위를 사용 하 여 팔꿈치의 후부 측면에서 피부에 절 개 (~ 5 m m)를 확인 하 고 확장 팔꿈치 주위 절 개 폭 팔과 어깨의 근육을 피부를 뒤로 당겨.</li>
		<li>상 완 골의 근 위 끝에서 시작 하는 것 사용해 원심 방향을 따라 잘라 메스 블레이드 (#11). 삼 두 근 근육-힘 줄 단위와 상 완 골의 후부 측면 사이 블레이드를 놓습니다. 상 완 골의 원심 끝으로 컷을 확장 하 고 삼 두 근의 힘 줄을 통해 절단 하 여 마무리.</li>
		<li>그런 다음 다시 당겨 삼 두 근은 상 완 골의 근 위 끝 상 박 골의 머리 노출 될 때까지.</li>
		<li>메스 블레이드 (#11)를 사용 하 여 상 박 골의 머리 주위 결합 조직 관절 표면을 없이 잘라 고 시체에서 사지 (팔과 어깨)를 제거 합니다. 주기적으로 하이드 레이트 HBSS와 상 박 골의 머리의 관절 표면.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 및 다음 상 완 골의 원심 끝 주위 결합 조직 절단 팔의 후부 측면에서 척 골의 근 위 끝에서 첫 번째 끊어서 팔에서 상 완 골을 분리 합니다. 상 완 골에 어떤 과잉 조직을 제거 합니다.</li>
		<li>표준 해가 위를 사용 하 여 상 완 골의 후부 측면에서 삼각형 tuberosity 잘라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HBSS 버퍼를 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 관으로 해 부 specimen(s)를 놓습니다.</li>
</ol>3. 라이브 (Calcein 오전) / 죽은 (Propidium 요오드 화물) 프로토콜을 얼룩이 지기
<ol><li>다음과 같이 calcein 오전을 사용 하 여 얼룩입니다.<ol>
<li>Calcein 오전, 4 mg/mL (4.02 m m)의 재고 농도 결과의 50 µ g의 유리병에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 12.5 µ L을 추가 하 여 calcein 오전의 재고 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>HBSS 칼슘 오전 10 µ g/mL (10.05 µ M)의 농도 도달에서 주식 calcein 솔루션 1:400 희석 (예를 들어, 추가 재고 솔루션의 1.25 µ L HBSS의 500 µ L).</li>
		<li>5 희석된 얼룩 솔루션 원심 때때로 튜브의 벽에 붙어 수 있습니다, 염료의 모든 버퍼와 혼합 되도록 2000 x g에서 s. 상쾌한을 제거 하지 마십시오. 적절 한 혼합 되도록 솔루션 소용돌이입니다.</li>
		<li>해 부 표본 희석된 얼룩 솔루션의 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 800 rpm에서 교 반 하면서는 thermomixer에서 30 분 동안 37 ° C에서 견본 품 어. 튜브는 빛에 노출 로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 덮여 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>Calcein 오전 무료 HBSS 버퍼에는 견본을 전송 합니다. 이 시점에서, 표본은 기계적 테스트를 위한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Propidium 요오드 화물 (PI) 다음과 같이 솔루션 얼룩을 준비 합니다.<ol>
<li>PI PI의 40 µ g/mL (60 µ M)를 도달 하는 HBSS에 구입한 재고 솔루션 (1 mg/mL, 1.5 m m) 1시 25분을 diluting 하 여 솔루션 얼룩을 준비 합니다. 예를 들어 HBSS의 1000 µ L을 재고 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>빛에 노출 로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 커버 솔루션 얼룩 PI를 유지. 기계적 시험 후 즉시 얼룩 솔루션을 사용 하 여 부상된 셀 (섹션 4 참조)을 검출. 참고: 하나는 PI 얼룩이 더 엄격 하 게는 해의 품질 평가를 로드 하기 전에 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 기계적 테스트 프로토콜
<ol><li>대 퇴 후부 condyles 또는 상 박 골의 머리에 관절 표면 유리 (그림 1)에 앉아 그런에 사용자 정의 현미경 실장 기계 테스트 장치의 유리 슬라이드 표본 (대 퇴 골 또는 상 완 골)을 놓습니다. 참고: 고정 10 m m 긴 나무 주걱 (직경 2 m m =) 평평한 표면에 견본을 안정화 하기 위해 장치에 그것을 배치 하기 전에 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 상 완 골 의 원심 측에. 기계적 테스트 플랫폼의 자세한 설명에 대 한 보충 파일 1을 참조: 섹션 1.</li>
	<li>HBSS와 표본 수 화 및 형광 현미경에 견본 장치 장소.</li>
	<li>Calcein 오전 관절 chondrocytes 스테인드 이미지 (여기/방출 파장 = 495/515 nm) 4 X 형광 현미경 부하의 응용 프로그램 (기본) 렌즈를 건조 하기 전에 (나 = 0.13). 이미지 품질을 최적화 하기 위해 인수 설정을 조정 합니다.</li>
	<li>견본은 위에 기계적 로드 관절 연골 커버 유리에 대 한 압축을 적용 합니다.<ol>
<li>정적 로드된 정적 부하 (예를 들어, 0.5 N) 표본 (대 퇴 골 또는 상 완 골) 위에 적용 됩니다. 5 분에 대 한 부하를 누른 다음 그것을 제거 합니다.</li>
		<li>영향, 적용 된 충격 에너지 (예를들면, 1 엠 제이)는 견본에 알려진된 무게 (예, 0.1 N)의 원통형 충돌 (예를 들어, 1 cm) 소정의 높이에서 떨어지고. 충격 후 부하 5 s를 놓습니다. 참고: 충돌 (mg)와 소정의 높이 (h)의 무게는 다음 수식을 사용 하 여 충격 에너지 (E)로 변환 될 수: E = mgh.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 솔루션 얼룩 PI에서 견본 품 어.</li>
	<li>Calcein 오전 관절 chondrocytes 스테인드 이미지와 PI (여기/방출 파장 = 535/617 nm) 형광 현미경 (그림 2).</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>계량 적용된 기계적 부하 처방으로 인해 부상/죽은 세포의 영역.<ol>
<li>ImageJ18기계 부하의 적용 전후 인수 관절 표면의 현미경을 엽니다.</li>
		<li>스택으로 이미지를 결합.</li>
		<li>이미지의 해상도에 따라 이미지의 규모를 설정 합니다.</li>
		<li>다각형 도구를 사용 하 여 셀 calcein-네거티브 (녹색 형광의 손실) 및 PI-긍정적인 (빨간 형광의 이득)를 되었다 영역 정의를. 이 세포는 부상 또는 죽은 간주 됩니다.</li>
		<li>측정 도구를 사용 하 여 부상/죽은 셀의 영역을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

위에서 설명한 방법 기계적 부하 또는 충격 처방 후 마우스 관절에서 관절 chondrocytes 실용적이 고 부상/죽은 현장에서 시각화를 성공적으로 채택 되었다. 특히, 우리는 두 개의 서로 다른 활 액 관절에서 완전히 그대로 관절 연골 내 chondrocytes의 기계적인 취약점 분석 수 있었다: 무릎 관절 (원심 화관)와 어깨 (humeri). 우리의 대표적인 결과 관절 표면에 세포 상해의 공간 정도 부하 크기와 충격 강도 (그림 3)에 민감하게 의존을 보여준다. 중요 한 것은,이 메서드를 사용 하 여 순수 관련 조건 기계적 부하에 세포질 응답의 조사를 지원합니다. 즉,는 그대로 생리 아래 관절에 관절 연골의 테스트 가능 하 고 supraphysiological 로드 ( 보충 파일 1참조: 2 절).
기준선, 일부 프로토콜 수정에 chondrocy...

관절 연골 (AC)는 베어링 커버와 부드러운 공동 조음을 제공 하는 활 액 관절에서 뼈를 보호 하는 조직 로드. 조직의 항상성 chondrocytes, AC에 있는 유일한 셀 타입의 생존 능력에 따라 달라 집니다. 그러나, 극단적인 세력 (예를 들어, 폭포, 차량 사고 또는 스포츠 부상) 외상 또는 외상 후 관절 불안정성 때문에 연골의 노출 chondrocyte 죽음, 관절 (관절염)의 돌이킬 수 없는 고장에 지도 일으킬 수 있다 1. 또한, osteochondral 손상 된 연골에 로컬 결함을 복구 하는 것을 목표로 하는 절차를 접목, 이식 삽입 관련 된 기계적 외상 chondrocyte 생존 능력을 감소에 수술 결과2에 해로운 효과가 있다.
연골 explant 모델 일반적으로 기계적으로 유도 된 세포 죽음을 관절 chondrocytes의 민감성을 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 모델 일반적으로를 사용 하 여 큰 동물에서 explants 로드 조건, 환경 조건 및 셀 취약점3,,45,6, 에 다른 요인의 효과 공부 7,8,9,10,11,12,13,,1415. 그러나, 네이티브 관절의 큰 크기 때문에 이러한 모델 제거 함으로써 네이티브 경계 조건 타협 그대로 관절의 관절 표면에서 플러그의 일반적으로 필요 합니다. 또한, 그들은 일반적으로 세포 상해를 유도 하기 위해 대형 기계 부하의 응용 프로그램을 필요 합니다. 또는, murine 연골 explant 모델 chondrocytes 제자리에 의 기계적인 취약점을 공부에 더 큰 동물 모델을 통해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 특히, 그들의 작은 크기 때문에 이러한 모델 완전히 그대로 관절 연골의 기본 조직의 무결성을 변경 하지 않고 테스트 촉진 한다. 또한, 로드 murine 연골의 발생 작은 접촉 지역에 같은 chondrocyte 사망/부상 작은 부하로 유도 될 수 있다 (< 1 N). 마지막으로, 마우스 게놈은 쉽게 조작, 어떻게 특정 유전자 영향의 기계적 상해 chondrocytes 제자리에 의 민감성을 테스트 가능.
이 원고에 도입 하는 방법의 전반적인 목표는 계량 하 고 시각화에 진짜 시간에서 공간 정도 완전히 그대로 마우스 연골에 뼈에 적용 된 기계 부하 때문 에 원래의 세포 죽음/상해의 explants 에 체 외. 이 방법은 현미경 실장 장치 비슷한 우리가 최근 개발 테스트 플랫폼을 사용 하 여 극히 스테인드 explants의 기계적 테스트 다음 chondrocyte 생존을 손상 없이 마우스 활 액 관절의 조심 해 부 요구 계량 murine 연골 기계적 성질16하. 기계적 테스트 하는 동안 해 부 뼈의 (그대로) 관절 표면의 큰 부분 부하를 적용 한 후 세포 생존 능력의 신속한 분석을 활성화 한 형광 현미경 사진에 표시 됩니다. 비슷한 분석 murine 연골 explants의 표면 세포 생존 능력의 이전, 하지만 로드17의 동시 신청 없이 수행 되었습니다. 우리의 방법의 잠재 애플리케이션으로 감도 감소 시키기 위한 치료 뿐만 아니라 다른 제어 환경 및 기계적 조건, 관절 chondrocytes의 취약점 조사를 비교 연구 기계적 부하를 chondrocytes.

<table><tbody><tr><td>칼세인, 오전&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific C3100MP의 Invitrogen</td><td></td><td>20x50mg , Eugene, OR, USA</td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td> 1 <td>mg/mL 용액 in water, 10mL, Eugene, OR, USA</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>1L DMSO, 무수; 99.9%, 세인트루이스, 미주리, 미국</td></tr><tr><td>HBSS (칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음)&nbsp;</td><td>Gibco by Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td>1X, 500mL, Grand Island, NY, USA</td></tr><tr><td>깃털 수술용 칼날 (#11)</td><td>VWR</td><td>102097-822</td><td>Hatfield, PA, USA</td></tr><tr><td>증기압 오스모미터, VAPRO</td><td>ELITechGroup</td><td>모델 5520</td><td>Puteaux, France</td></tr><tr><td>pH meter&nbsp;</td><td>Beckman</td><td>모델 Phi 32&nbsp;</td><td>브레아, 캘리포니아, 미국</td></tr><tr><td>Eppendorf 써모믹서&nbsp;</td><td>에펜도르프 AG&nbsp;</td><td>모델 5350</td><td>독일 함부르크</td></tr> 전동 <tr><td>도립 연구 현미경</td><td>올림무스</td><td>모델 IX-81</td><td>Center Valley, PA, USA</td></tr><tr><td>목재 어플리케이터</td><td>Puritan Medical Products Company, LLC</td><td>807</td><td>6"x100, Guilford, ME, USA</td></tr><tr><td>1.5 유리 커버슬립</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-1696</td><td>#1.5, 0.17mm 두께, 40mm 직경, Hamden, CT, USA</td></tr></tbody></table>

실시간 시각화 및 chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 murine 연골 explants 기계적 부하의 분석

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

관절 연골의 항상성 주민 세포 (chondrocytes)의 생존 능력에 따라 달라 집니다. 불행 하 게도, 기계적 외상은 잠재적으로 공동의 돌이킬 수 없는 고장 및 관절염의 발병에 이르는 광범위 한 chondrocyte 죽음을 유도할 수 있다. 또한, chondrocyte 생존 능력의 유지 관리는 최적의 수술 결과 대 한 osteochondral 이식 절차에서 중요 하다. 우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 활 액 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 이 메서드는 다른 기계적 부하 regimens, 다른 환경 조건이 나 유전자 조작의 효과 뿐만 아니라 다른 단계에 짧은-장기 연골 변성의 조사 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 원래의 관절 chondrocytes의 취약점입니다. 원고에 소개 하는 프로토콜의 목표 murine 활 액 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가입니다. 중요 한 것은,이 메서드는 네이티브 경계 조건 없이 완전히 그대로 연골에 테스트 수 있습니다. 또한, 그것은 vitally 스테인드 관절 chondrocytes의 실시간 시각화 및 제어 정적 및 영향 regimens 로드의 응용 프로그램에 의해 유도 된 세포 상해의 단일 이미지 기반 분석에 대 한 수 있습니다. 우리의 대표적인 결과 건강 한 연골 explants 세포 상해의 공간적 범위에 따라 달라 집니다 민감하게 부하 강도 및 충격 강도 보여줍니다. 우리의 방법은 쉽게 다른 기계적 부하 regimens, 다른 환경 조건이 나 관절 chondrocytes 제자리에 의 기계적인 취약점에 다른 유전자 조작의 효과 조사 하기 위해 적용할 수 있습니다.

6 다른 로드 프로토콜 적용 (정적 로드: 0.1 N, 0.5 N과 N 5 분; 및 충격 부하에 대 한 1: 1 엠 제이, 2 엠 4 엠 제이) reproducibly 8 10 주 오래 BALB/c 마우스 (에서 가져온 하는 대 퇴와 상 박 골의 연골에 세포 상해의 정량 지역화 된 영역을 유도 그림 2)입니다. 중요 한 것은, 관절 표면에 chondrocyte 상해의 공간 정도 ImageJ에 신속 하 고 쉽게 측정 했다. 대표 결과 관절 chondrocytes의 기계적인 취약점은 부하 강도 및 충격 강도 의해 영향을 보여줍니다. 특히, 높은 부하 크기 및 높은 충격 강도 크게 화관에 humeri (그림 3) 세포 상해의 공간 정도 악화.
<img alt="F...

우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 관절염, 유전 요인 및 다른 로드 regimens 영향 chondrocytes 제자리에서 의 취약점을 조사 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

이 방법을 사용하면 다양한 기계적 적재 요법, 환경 조건 또는 연골 변성의 단계가 시상 동맥 연골세포의 취약성에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다. 물리적 인 힘. 다른 기술과 달리 이러한 측정은 네이티브 경계 조건을 손상시키지 않으면서 실시간으로 완전히 손상되지 않은 연골에서 수행됩니다.이 기술의 또 다른 장점은 마우스 모델을 사용하여 특정 유전자가 기계적 상해에서 시투 연골 세포의 감수성에 어떻게 영향을 미치는지 테스트하는 것입니다. 해사 대퇴골의 해부의 경우 마우스를 척추 위치에 놓고 무릎의 전방 부분에 5 밀리미터 피부 절개를 합니다. 절개를 무릎 주위로 확장합니다.그리고 무릎 관절과 다리 근육을 노출피부를 다시 당깁니다. 대퇴골의 근위 쪽 끝에서 시작하여, 11번 메스 블레이드를 사용하여 말단 방향으로 뼈를 따라 자른다. 사두근 근육 힘줄 단위와 대퇴 샤프트의 전방 측 사이에 블레이드를 배치합니다.슬개골을 지나 절개를 확장합니다. 사두근 근육 힘줄 단위를 제거하기 위해 슬개골 힘줄의 중간을 절단. 다음으로, 대퇴골의 근위쪽 끝에서 시작하여, 햄스트링 근육 힘줄 단위와 대퇴샤프트의 후방 측 사이에 메스 블레이드를 배치하고 말단 방향으로 뼈를 따라 자른다.절개가 무릎 관절에 접근하면 연조직을 잘라 무릎 관절을 지나 컷을 완료합니다. 사두근과 햄스트링 근육을 뒤로 당겨 대퇴골을 노출시하십시오. 그리고 뼈의 측면과 내측에 어떤 과잉 근육을 잘라.근위 경골의 후방 측에 있는 종아리 근육을 잘라냅니다. 그리고 대퇴골의 후방 측면을 시각화하기 위해 다리를 뒤집습니다. 대퇴골의 단열 결체와 근위 경골의 후방 표면을 노출하기 위해 무릎 관절 주위의 과잉 조직을 제거합니다.대퇴엽에서 전방 및 후방 십자 인대를 잘라. 그리고 대퇴골에서 경골을 당겨 대퇴골에서 하반신을 분리하기 위해 모든 인대를 절단합니다. 표준 해부 가위를 사용하여, 측면에서 경골 관절 위의 약 8 밀리미터 뼈의 근위 끝에 대퇴골을 잘라.그리고 주얼러의 집게를 사용하여 대퇴골에서 주변 의 연조직을 제거하십시오. 그런 다음 대퇴골의 말단 끝에 두 연골에 연골을 노출시합니다. HBSS로 관절 표면을 주기적으로 수화합니다.상완골의 해부의 경우 마우스를 척추 위치에 놓습니다. 그리고 마이크로 가위를 사용하여 팔꿈치의 후방 쪽에 5 밀리미터 절개를합니다. 팔꿈치 주위의 절개를 확장하고 팔을 넓히기 위해 피부를 뒤로 당깁니다.상완골의 근위 쪽 끝에서 시작하여 삼두근 근육 힘줄 단위와 상완골의 후방 측 사이에 숫자 11 메스의 블레이드를 배치합니다. 그리고 말단 방향으로 뼈를 따라 잘라. 상완골의 단부 끝으로 절개를 확장하고 삼두근 힘줄을 통해 상완골 머리가 노출 될 때까지 상완골의 근위 끝을 향해 삼두근을 다시 당깁니다.관절 표면에 닿지 않고 상완골 머리 주위의 결합 조직을 잘라냅니다. 그리고 몸에서 사지를 제거합니다. 후얼 머리의 관절 표면을 HBSS로 수분처리합니다.팔의 상완골을 분리하려면 집게를 사용하여 팔의 후방 쪽의 척골끝의 근위 쪽 끝을 분리합니다. 그리고 상완골의 말단 주위 의 결합 조직을 잘라, 뼈에 어떤 과잉 조직을 제거. 그런 다음 표준 해부 가위를 사용하여 상완골의 후방 측에 있는 망상 형 관성을 제거합니다.그리고 해부된 표본을 HBSS를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 놓습니다. 샘플의 Calcein AM 염색의 경우, HBSS에서 10.05 마이크로 리터의 500 마이크로 리터를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 뼈를 전송합니다. 그리고 온도800 rpm에서 온도 37도의 온도에서 튜브를 온도로부터 보호합니다.30분 후, 신선한 HBSS로 시편을 10분간 세척합니다. 그리고 후피대모덕추도또는 상완두환의 관절표면이 유리에 앉아 있는 등, 맞춤형 현미경 장착 기계시험 장치의 유리 슬라이드에 표본을 이송한다. HBSS로 시편을 수분화하고 시편을 형광 현미경 단계에 배치합니다.4배 배율 하에서 하중 적용 전에 Calcein AM으로 염색된 관절 연골 세포를 이미지합니다. 수집 설정을 조정하여 이미지 품질을 최적화합니다. 정적 기계적 하중을 적용하려면, 하중을 제거하기 전에 5 분 동안 관절 연골이 커버 유리에 대해 압축되는 것을 시편 위에 규정 된 정적 부하를 유지합니다.충격 기계적 부하를 적용하려면 알려진 중량의 원통형 충격기를 지정된 높이에서 시편에 떨어뜨려 충격 5초 후에 하중을 방출합니다. 어느 부하가 제거된 직후, 새로 준비된 60 마이크로 어어 프로프리듐 요오드에 표본을 HBSS 1밀리리터로 배양한다. 실온에서 5분 동안, 단지 입증된 것처럼 형광 현미경으로 관절 연골을 다시 이미지화합니다.적용된 기계적 적재 요법으로 인해 부상 및 죽은 세포의 면적을 정량화하기 위해, 먼저 ImageJ에서 기계적 하중을 적용하기 전과 후에 획득한 관절 표면의 현미경 그래프를 엽니다. 이미지를 스택에 결합합니다. 이미지 해상도를 기반으로 이미지의 배율을 설정합니다.다음으로, 세포가 칼신 음성 및 PI 양성이 된 영역을 정의합니다. 이 세포는 다친 또는 죽은 것으로 간주됩니다. 그런 다음 측정 도구를 사용하여 부상당한 죽은 세포의 영역을 결정합니다.적어도 6개의 시험된 로딩 프로토콜은 8주에서 10주 된 밸브 C 마우스에서 얻은 대퇴및 상완연골에서 세포 손상의 정량화 된 지역적 영역을 재현가능하게 유도하였다. 테스트된 모든 로딩 프로토콜에서, 높은 부하 크기와 높은 충격 강도는 대퇴골과 후너리 모두에서 세포 손상의 간격 범위를 크게 악화시켰습니다. 해부를 수행하는 동안 수술 도구와 관절 연골에 접촉하지 않는 것이 중요합니다, 이것은 표본의 능력에 의해 기준선을 손상시킬 수 있기 때문에.이 미러링 모델의 사용은 질병이 유전, 식이, 또는 외과 적 조작을 통해 마우스에서 쉽게 유도하기 때문에 골관절염에서의 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 우리의 플랫폼은 또한 기본 과학 질문을 심문하고 연골세포의 기계적 취약성을 대상으로 치료 개입을 선별하기위한 도구를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

우리는 관절 연골 결손에 이전의 이식 연골의 BioComposite을 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 할 수 있습니다 소설 기계적 하중 생물 반응기를 설계했습니다.

조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서   영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

이 프로토콜 분석 endochondral 뼈 쥐에서 치유 하는 데 사용할 수 있습니다 대 퇴 골 골절의 표준화 된 안정화를 위한 intramedullary 나사를 사용 하 여 최소 침 습 osteosynthesis 기술을 설명 합니다.

Endochondral 골절 표준화 된 Biomechanical 조건 하에서 쥐에서 치유를 분석 하는 최소 침 습 모델

여기에서, 우리는 소 무릎에서 연골 이식의 격리 및 배양을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관절을 표적으로 하는 생물학적 자극 또는 새로운 치료법에 반응하여 조직 변화를 설명하기 위한 쉽고 접근가능한 도구를 제공한다.

소 무릎 이식에서 연골 리모델링의 전 생체 외 조직 문화 모델

여기에서는 20N 이상의 60 순환 압박에 의해 생성 된 쥐 무릎의 순환 로딩 유도 관절 내 연골 병변 모델을 제시하여 쥐의 대퇴 과두 연골에 손상을 입 힙니다.

래트 무릎의 순환 로딩 유도 관절내 연골 병변 모델을 생성하기 위한 비침습적 방법

본 프로토콜은 내측 소인대를 절단하여 마우스 무릎을 불안정하게 한 후 관절 연골의 표면에 조절된 마이크로블레이드 스크래치를 기술한다. 이 동물 모델은 골괴사 형성, 골경화증 및 초기 단계 통증을 연구하기에 적합한 가속 형태의 골관절염(OA)을 제시합니다.

내측 반월판 및 연골 스크래치 쥐의 불안정화 가속화된 골관절염의 모델

이 프로토콜은 청소년 뼈 성장판 손상에 대한 개선된 마우스 모델을 설명합니다. 성장판의 3개의 서로 다른 하층과 관련된 주요 매트릭스인 콜라겐 유형 I, II 및 X에 대한 삼계 형광 리포터가 있는 형질전환 마우스를 사용하여 현미경 아래의 기본 형광에 의해 손상 배치를 안내합니다.

성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

기계적 연골 과부하에 대한 연골 세포 손상 반응을 더 잘 이해하기 위해, 이 프로토콜은 24시간 동안 치명적이지 않은 체외 연골 충격 모델의 개발을 설명합니다.

체외(In Vitro ) 소 연골 외식에서 치명적 연골 세포 손상을 일으키는 충격 모델

여기서는 양 무릎에서 통제된 골연골 병변을 생성하는 통합 프로토콜을 제시하여 뼈 및 연골 조직 재생 연구에 적합한 실험 모델을 구축합니다. 프로토콜은 동물 복지에 미치는 영향과 결과 변동을 최소화하는 기법을 사용하여 대퇴골 과과에 전층 골연골 결손을 유도하는 방법을 제시합니다.

전층 골연골 결함의 양 모델 구축 및 평가

학습하세요 실시간 형광 현미경을 이용하여 완전한 상태의 murine 관절 연골에서 연골세포 손상을 평가하는 방법을. 이 기술은 퇴행성관절염 메커니즘 연구와 유전적 요인이 기계적 손상에 미치는 영향을 분석하는 데 활용됩니다.

실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석

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