Name: Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 닭 원발 법스 세포 배양 및 IBDV 감염 모델을 통해 조류 바이러스학 연구를 수행하는 방법을. 이 기술은 면역억제 바이러스와 B 세포 상호작용을 연구하며 동물 실험의 3R 원칙을 지원합니다.

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저자는 그들의 전문성 해칭, 양육, 및 aseptically 제거 부르사의 파에 조류와 캐롤라인 홀 트의 전문성을 학살에 대 한 Pirbright 연구소에서 동물 서비스 팀을 감사 하 고 싶습니다. A.B. 생명 공학 통해 자금과 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC) 통해 부여 게시판/E/I/00001845, K.D. 재학 통해 BBSRC 게시판/E/I/00002115을 통해 자금과 A.A.에 대 한 국립 센터를 통해 투자는 대체, 수정 & 연구 (NC3Rs) 를 통해 서 동물의 감소 NC/R001138/1을 부여합니다.

동물 들과 함께 모든 절차 승인 되어야 합니다 윤리적으로 사전에. 우리의 기관에 모든 절차는 내부 동물 복지 및 윤리 검토 위원회 (AWERB)의 승인 후 홈 오피스 설립, 개인 및 프로젝트 라이선스에서 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986에 따라 수행 됩니다.
1입니다. chCD40L의 준비
<ol><li>안정적으로 수용 성 chCD40L을 표현 하는 문화 HEK 293-msCD8-CD40L 셀 송아지 태아 혈 청 (FCS) 및 5%를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 1 µ g/mL puromycin 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체 10% 열 비활성화 보완 (안녕하세요) x 1에 생성 CO 2. 참고: 이러한 셀 다음 적절 한 자료 전송 계약에 서명 하는 Pirbright 연구소에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>1:5 밀도 confluent 때 셀을 분할 합니다. 수집 (수용 성 chCD40L 구문이 포함) 상쾌한 때마다 셀 분할 세포질 파편을 제거 하 고 4 ° c.에 그것을 저장 하는 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심</li>
	<li>상쾌한의 500 mL를 수집 하는 때 액체 수영장 하 고 필터-소독 그것 0.2 µ m 필터를 통해.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 10 K의 분자 무게 컷오프와 원심 단백질 집중 장치를 사용 하 여 상쾌한 집중. 각 열에서 집중된 상쾌한을 추출 하 고, 함께 수영장 필터-소독 그것 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 그것을 전달 하 여.</li>
	<li>직렬 1에서 chCD40L 솔루션을 희석 하 여 실험에 사용 될 최종 농도 결정 x Iscove의 Dulbecco의 매체 (IMDM) (에서 설명한 단계 2.4)와 희석 존재 자란 기본 bursal 셀 수정. 최대 1 주일 동안 매일 세포의 수와 백분율 생존 능력을 결정 합니다. 참고: 세포 증식과 생존 능력은 적절 한 최저 농도 분석 결과에 사용 하 여 농도가 이다. 이 1시 20분, 1시 50분 사이 있을 것입니다.</li>
</ol>2. 치킨 기본 Bursal 셀 격리 솔루션의 준비
<ol><li>살 균 H2O의 0.47 90 mL에 Ca와 10 x HBBS의 10 mL를 추가 하 여 칼슘 (Ca) 행 크 스 균형된 소금 솔루션 (HBBS) x 1을 준비 7.5% NaHCO3의 µ L.</li>
	<li>0.2 µ M 필터를 통해 Ca. 필터를 소독을 1 x HBBS에서 8 mg/mL에서 콜라 D 재고 솔루션 솔루션을 준비 합니다. 참고: 그것은 5 mL aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에서 그들을 멈추게 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>1 준비 x RPMI 매체 보충 5% 안녕하세요 FCS. 4 ° c.에 미디어를 저장</li>
	<li>준비 1 x 500 mL IMDM의 보충 8% 안녕하세요 FCS, 2% 안녕하세요 닭 혈 청, β-mercaptoethanol 50 m m, 50 µ L 인슐린-처리가-나트륨-selenite, 및 1% 페니실린/스. 4 ° c.에 미디어를 저장 참고: 위에서 언급 한 모든 솔루션을 사전에 준비 합니다.</li>
	<li>1 x HBBS Ca. 저장소와 얼음에 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>살 균 H2O, 7.5% NaHCO3, 0.47 µ L EDTA 10 m m의 최종 농도에 90 mL에 Ca 없이 10 x HBBS의 10 mL를 추가 하 여 Ca 없이 1 x HBBS를 준비 합니다. 얼음에 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>18 mL의 총 수 있도록 Ca와 HBBS의 13 ml 콜라 D 재고 솔루션의 5 mL을 추가 하 여 1 x 콜라 D 솔루션을 준비 합니다. 얼음에 솔루션을 저장 합니다. 참고: 실험의 하루에 2.5-2.7 단계에서 언급 한 솔루션을 준비 합니다.</li>
</ol>3. 부르사의 파 (BF)의 제거
<ol><li>후면 및 해치 닭 적절 한, 승인 된 시설에 고통 없이 나이의 2-3 주에 따. 참고: 학살에 대 한 연구소 승인 메서드를 사용 합니다.</li>
	<li>
무 균 기술을 사용 하 여 각 치킨에서 BF를 수집 합니다. 참고: 프로토콜을 사용 하 여 기관에 장소에.<ol>
<li>등 recumbency에 시체를 놓고 소독 피부 및 깃털 70% 에탄올, 물에 희석의 솔루션으로는 복 부와 흉부를 오버레이 합니다.</li>
		<li>멸 균된 메스 또는 위를 사용 하 여 더 낮은 복 부에 복 부 정중 선 절 개를 확인 합니다.</li>
		<li>두개골은 cloaca 콜론의 꼬리 부분에 연결 된 부르사의 파를 찾습니다.</li>
		<li>소독된 집게와가 위, 콜론에서 부르사의 파를 잘라 사용 합니다. 용기를 puncturing 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차가운 PBS에 장기를 놓고 얼음에 실험실으로 전송 합니다. 참고: 기본 셀 장기 수확 후 즉시 격리 해야 합니다.</li>
</ol>4입니다. 닭 기본 Bursal 셀의 격리
<ol><li>BF 적어도 3 세척 미생물 안전 캐비닛에서 일하고 차가운 PBS의 30 mL에 x.</li>
	<li>조직 배양 접시 (지름, 높이 21 m m 92 mm)을 전송 하 고 1 x 콜라 D 솔루션의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>살 균가 위 또는 BF 직경에서 5 m m 미만의 조각으로 잘라 메스 블레이드를 사용 합니다.</li>
	<li>30 분에 대 한 정기적인 부드러운 동요와 37 ° C에서 조직 품 어. 참고: 콜라 솔루션 조직 소화 시작 됩니다.</li>
	<li>조직의 해체를 장려 하기 위해 혼합물을 발음 반복 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 필요한 경우 조직을 작은 조각으로 잘라.</li>
	<li>조직에 1 x 콜라 D 솔루션의 또 다른 5 mL을 추가 하 고 또 다른 30 분에 대 한 정기적인 부드러운 동요와 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>조직을 완전히 소화 될 때까지 4.6-4.7 단계를 반복 합니다. 참고: 있을 것입니다 더 이상 분해 되지 않는 작은 알갱이.</li>
	<li>세포 현 탁 액을 Ca 없이 1 x HBBS의 20 mL로 100 µ m 셀 여과기에 통과.</li>
	<li>셀 서 스 펜 션 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 1의 10 mL에 펠 릿을 resuspend x RPMI 5 %fcs.</li>
	<li>Polysucrose와 나트륨 diatrizoate를 포함 하는 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 위에 세포 현 탁 액 10 mL를 오버레이 또는 10 mL 세포 현 탁 액 아래 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 언더레이. 거기 2 사이 명확한 인터페이스 인지 확인 합니다.</li>
	<li>900 x g 4 ° c.에 20 분에 오버레이 원심 낮은 또는 원심 브레이크를 제거 합니다. 참고: 셀 셀 미디어와 밀도 그라데이션 미디어 간의 인터페이스에 밴드를 형성 한다.</li>
	<li>살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 제거 하 고 차가운 PBS에 넣어. 3 세포를 씻어 x 400 x g 5 분에 centrifuging와 차가운 PBS에 그들을 resuspending.</li>
</ol>5입니다. 닭 기본 Bursal 세포의 문화
<ol><li>400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 하 고 완전 한 IMDM x 1에서 그들을 resuspend.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 약 수를 받아, Trypan 블루 솔루션에 추가 하 고 Trypan 블루 제외 가능한 셀의 수를 계산. 백분율 생존 세포의 수를 결정 합니다.</li>
	<li>400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심과 1시 20분으로 보완 하는 완전 한 IMDM에 resuspend 1 x 107 셀/mL의 조밀도에 치킨 CD40L의 희석. 결정은 범위 1시 10분 ~ 1시 50분에 최적의 희석 chCD40L를 포함 하는 집중된 상쾌한 적정</li>
	<li>48-72 h. U 바닥 96 잘 접시 바닥 접시 보다는 37 ° C에 96-24 잘 접시 중에 셀 문화. 참고: 셀 40 ° C에서 경작 될 수 있다 또한</li>
</ol>6. 닭 기본 Bursal 셀 IBDV의 감염
<ol><li>48-72 h 후 절연, 바이러스, 소용돌이 샘플의 약 수를 녹여 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>Resuspend 기본 bursal 셀 10 µ L 셀 서 스 펜 션의 aliquot 걸릴, Trypan 블루 솔루션의 10 µ L을 추가 하 고 셀 및 백분율 가능성의 수를 결정.</li>
	<li>바이러스 감염 (MOI) 수 있도록 바이러스 inoculum 소용돌이의 적절 한 다중성을 완전 한 IMDM x 1에 희석.</li>
	<li>셀 서 스 펜 션 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 바이러스 inoculum 셀 resuspend.</li>
	<li>정기적인 동요와 1 시간 동안 37 ° C에 세포 현 탁 액을 품 어.</li>
	<li>400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 바이러스 inoculum을 제거 하 고 완전 한 IMDM 미디어 x 1에 있는 셀을 씻어.</li>
	<li>400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 상쾌한, 제거 하 고 닭고기 CD40L mL 당 1 x 107 세포의 밀도와 보완 하는 완전 한 IMDM 미디어 셀 resuspend.</li>
	<li>37 ° c.에 96-또는 24-잘 접시 중에 셀 문화 참고: 셀 40 ° C에서 경작 될 수 있다 또한</li>
</ol>7. 닭 기본 Bursal 셀에 IBDV 복제의 정량화
<ol><li>원하는 시간 포인트 바람직합니다에 셀 resuspend, 적절 한 튜브에 그들을 전송, 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 고 수확 바이러스 적정에 대 한 상쾌한 패 분석 결과 또는 리드 Muench 당 TCID50 분석 결과 방법15.</li>
	<li>PBS의 1 mL에 세포를 씻어와 IBDV, 특정 항 체와 immunostaining에 대 한 준비 또는 RNA (제조업체의 지침에 따라) 적절 한 키트를 사용 하 여 추출 및 수행 반전 녹음 방송 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량) 사용 하 여 뇌관 (앞으로, GAGGTGGCCGACCTCAACT; IBDV 유전자에 대 한 특정 리버스, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG)입니다. 모의 감염 된 세포 배양 컨트롤으로 사용 되어야 한다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 우리 닭 기본 bursal 셀 비보 전 수용 성 chCD40L 존재의 성공적인 문화를 설명 하 고 이러한 셀 감쇠 긴장과 IBDV의 매우 악성 긴장의 복제를 지원할 수 있습니다 입증. 이 비보 전 모델 세포는 IBDV 감염13, vivo에서 그리고 생체 외에서 연구에 비해 뚜렷한 장점이 있는에 대처 하는 방법을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
BF, 수확 때 하지 펑크 격리 bursal 셀의 세균 오염을 피하기 위하여 용기에 중요 하다. 또한, 그것은 세포 죽음을 제한 하려면 장기 수확 후 최대한 빨리 1 차 셀을 분리 하는 것이 중요입니다. ChCD40L를 사용 하는 필요는 제한 기술; 그러나, Soubies 그 외 여러분 에 의해 실시 하는 작업 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) chCD40L14 대신 bursal 세포 생존을 머리말을 붙이는 사용 실험실의 큰 숫자로 채택 모델을 활성화 수 있습니다 보여줍니다. 위에서 설명한 프로토콜 순차적으로 희석된 농도 분자 관찰 세포 증식과 생존에 기본 B 세포를 배양 하 여 경험적으로, chCD40L의 최적 농도를 결정 합니다. 한 잠재적인 수정 프로토콜에 chCD40L 분자를 정화 하 고 배치 배치 변화를 피하기 위해 세포 배양에 특정 농도 추가 될 수 있습니다.
Vivo에서 연구 결과 나타났습니다 그 다음 IBDV 감염, 프로-염증 성 cytokine 응답, 유형 I IFN 응답 및 BF5,9,10 apoptosis에서 포함 된 유전자의 표정 증가 . 그러나, 감염, 다음과 같은 염증 성 세포와 감염 된 B 세포 인구9에 비해 유전자 표현에 다는 BF로 이펙터 T 세포의 유입이입니다. 그것은, 따라서, IBDV에 어떻게 감염된 세포 응답 해석 어렵다입니다. 이 해결 하기 위해 일부 연구 그룹 셀 문화16,17,,1819,20IBDV 감염의 transcriptional 응답을 특징 있다. 이러한 생체 외에서 연구 분명 MOIs 및 시간 포인트 바람직합니다의 이점이 있다. 그러나, 생체 외에서 연구는 일반적으로 섬유 아 세포 세포16,,1720 또는 수지상 세포18특징 되었습니다. 동안 호스트 셀-IBDV 상호 작용에 몇 가지 통찰력, 현재 믿음 이다 B 세포의 감염 IBDV의 병 인 및, 따라서, 데이터의 관련성에 중요 한 제공 overinterpreted 수 없습니다. 우리의 비보 전 bursal 셀 문화 모델, 이전 한 연구 IBDV 감염19; B 세포의 세포질 응답 특징 했다 그러나,이 연구에 활용 B 세포를 불멸 하 게 라인을 만들 수 있는 결론을 제한 하는 ALV와 감염에의 한 변형 되었다. 대조적으로, 여기서 설명 하는 IBDV 감염의 비보 전 모델에는 연구원을 생체 외에서 학문, 정의 MOIs의 관련 호스트 세포와 바이러스의 상호 작용을 공부 하는 동안 시간 포인트 등의 장점을 유지 하 수 있습니다. Flow cytometry (표준 상태를 사용 하 여), 다음 chCD40L 자극, 세포 인구의 97%에 대 한 긍정적인 기본 bursal 세포 감염된 BF 조직에서 얻을 수 있습니다, 그리고 거기 아무 염증 성 또는 T 세포, 그리고 우리는 의해 증명 B 셀 표식 부-1 (데이터 표시 되지 않음)입니다. 감안할 때 그 세포의 3%는 부 1 부정적, 그것은 재미 있을 것입니다 이러한 셀 IBDV에 감염 되는 병 인에 그들의 유전자 발현 및 기여를 탐험 있는지 확인.
우리 기대 하 고 ex vivo 닭 기본 bursal 셀 문화 모델도 다른 B 세포 트로픽 바이러스 감염 ALV 등 계, 닭의 호스트 세포 바이러스 상호 작용 연구를 확장 될 수 있습니다. 및 다른 조류 종 (또한 확장 될 수 있습니다. 예를 들어, 오리 또는 칠면조). 또한 기본 bursal 셀 비보 전 문화 능력 pathogenesis 및 조류를 감염 하는 필요 없이이 바이러스로 인 한 면역 억제의 측면을 공부 하는 가능성을 엽니다. Vivo에서 학문 중요 한 병 적 원인,이 연구에서 교체, 수정, 및 동물의 사용의 감소에 상당한 영향을 가질 것 이다.
요약 하자면, 비보 전 닭 기본 bursal 셀 문화 모델 여기에 설명 된 어떻게 조류 B 셀에 트로픽 바이러스에 vivo 에서 사용 하는 새의 수를 감소 시키고 있는 동안 자신의 호스트 세포 상호 작용의 이해를 확장 가능성이 있다 감염 연구입니다. 기술을 여러 림프 기관에 적용할 수 있는 여러 바이러스, 그리고 잠재적으로, 여러 종의 조류, 조류 바이러스학 및 면역학 분야에 기여할 수 있는 매력적인 모델 만들기.

글로벌 가금류 업계는 확장 인간 인구에 대 한 충분 한 음식을 확보 필수적 이다. 그러나, 면역 억제 식량 안보 위협 및 영향을 받는 새 복지 이며 업계 주요 경제 도전을 나타냅니다. 대부분의 경우 닭 면역 억제의 가장 혼란 후천성 면역 T와 B 림프 톨1차 있는 굴곡 운동 하는 데 대 한 책임으로 면역 바이러스 감염에 의해 발생 합니다. 조류, B 세포의 대부분은 부르사의 파 (BF)로 알려진 기관 내에 있습니다. B 세포는 IBDV와 마렉의 질병 바이러스 (MDV), 세포의 용 해를 일으키는 원인이 되 고 조류 leukosis 바이러스 (ALV)와 reticuloendotheliosis 바이러스 (와 같은 변환 시키는 그를 포함 하 여 여러 가지 면역 바이러스 감염에 취약 회전)
이러한 감염을 제어 하기 위한 더 나은 전략을 개발 하기 위하여 닭 B 세포와 바이러스의 상호 작용의 특성을 필수적 이다. 그러나, B 세포는 조류에서 제거 되, 그들은 하지 비보 전 문화2, 치킨 B 세포, 또는 다음 ALV 또는 계 감염 초기 이벤트와 IBDV의 상호 작용의 철저 한 분석을 수행 하기 어려운 만들기에서 잘 살아남을지 않습니다. 따라서, 많은 호스트 세포 바이러스 상호 작용 공부 vivo에서3,,45,6,7,8,9, 되었습니다. 10. 이러한 연구를 유익 하지 않더라도, 그들은 심각한 될 수 있는 질병 으로부터 고통 받는 감염 된 조류의 사용을 포함 한다.
CD40 ligand 유도 B 세포 확산11분자 이다. (ChCD40L) 유전자 인코딩 치킨 CD40L의 식별, 다음 성 융해 단백질 설계 되었습니다, 문화 미디어에 추가 될 때 닭 기본 B 세포 vivo ex12의 확산을 유도. 2015, B 셀이이 패션에 교양 2017에 MDV2 의 복제, 우리와 다른 사람을 지원 하기 위해 chCD40L을 자극된 기본 bursal 셀 IBDV 복제13,14공부 모델으로 사용 될 수 하는 것을 발견 발견 했다. 여기, 우리가 격리와 치킨 기본 bursal 셀의 문화, IBDV, 포함 된 셀의 감염과 바이러스 성 복제의 정량화 설명합니다. BF의 컨텍스트에서 메서드를 설명 하 고, 비록이 다른 림프 기관에서 격리와 문화 셀에 적용 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 미디엄</td><td>Merck</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>56°C에서 열-비활성화; C 1시간 동안</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>PES 멤브레인이 있는 Nalgene Rapid-Flow 멸균 일회용 필터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88528</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Millex-GP 주사기 필터</td><td>Merck</td><td>F7648</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>14060-040</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 산 용액 (EDTA)</td><td>Merck</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 변형 Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Serum</td><td>Merck</td><td>C5405-100ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol 50 mM</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-나트륨-셀레나이트</td><td>gibco 기술</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 D</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 세포 스트레이너</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Merck</td><td>10831-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 솔루션</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Nunc96 웰 폴리스티렌 라운드 바닥 마이크로웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>163320</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24웰 투명 평면 바닥 TC 처리 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함, 멸균</td><td>코닝</td><td></td><td></td>353047</tr><tr><td>Rneasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr></tbody></table>

bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 ex vivo 닭 기본 bursal 세포 배양 모델

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Bursal 전염병 바이러스 (IBDV)가 금 산업에 경제 중요성의 birnavirus 이다. 바이러스 감염 된 조류에서 질병 률, 사망률, 그리고 면역 억제를 일으키는 원인이 되는 B 세포를 감염. 이 연구에서 우리는 부르사의 파, 문화 그리고 IBDV, 포함 된 셀의 감염 및 바이러스 성 복제의 정량화에서 치킨 기본 bursal 셀의 설명합니다. 치킨 CD40 ligand의 추가 크게 세포 증식 대금 6 일 문화와 크게 향상 된 세포 생존 능력의 증가. IBDV의 2 개의 긴장, 셀 문화 적응, D78, 긴장과 매우 악성 긴장, UK661, ex vivo 세포 배양에서 잘 복제. 이 모델 셀 IBDV 감염에 대응 하 고 IBDV 병 인 연구에 사용 하는 감염 된 조류의 수에 있는 감소를 허용 하는 어떻게 결정 하는 데 사용 될 것입니다. 모델도 다른 바이러스를 포함 하도록 확장 될 수 있다 고 새의 다른 종에 적용 될 수 있었다.

치킨 기본 Bursal 셀 치킨 CD40L 존재 경작 수 있습니다.
치킨 기본 bursal 셀 수용 성 chCD40L 존재 경작 했다, 세포 수 증가 사중 9.02 x 10에서5 3.63 x 106 그것이 결 석과 달리 6 일의 기간 동안 mL 당 (p &lt; 0.05) ( 그림 1A). 세포 생존 능력 또한 크게 개선 되었습니다, 예를 들어 chCD40L chCD40L의 48%의 부재에 3 일 후 문화에 25%에서 (p &lt; 0.05) (그림 1B)13.
치킨 기본 Bursal 셀 두 셀 문화 적응의 복제 및 IBDV의 매우 악성 긴장을 지원할 수 있습니다.
모의 감염 및 감염 된 세포 배양 18 h 고정 했다 postinfection, IBDV VP2와 알 렉 사 Fluor 488, 활용 및 DAPI와 counterstained 이차 항 체에 대 한 단일 클론 항 체로 분류. 감염 된 세포의 핵 (그림 2A), 세포질에서 IBDV의 존재와 주위 녹색 형광 증거를 했다. 이것은 IBDV의 두 변종에 대 한 분명, 셀 문화 적응, D78, 긴장과 매우 악성 긴장, UK661 (그림 2A). 5, 18, 24, 및 48 h 바람직합니다, RNA 감염 된 문화에서 추출 하 고 IBDV VP4 유전자의 보존된 지역에 특정 한 뇌관으로 실시간 정량 Pcr을 복종 되었다. VP4 표현 먼저 집 유지 유전자 TBP 정규화 이었고 ΔΔCt 분석에서 모의 샘플을 기준으로 배 변경으로 표현. IBDV VP4 식 D78와 48 h 바람직합니다에 16,603 사본 및 38,632 사본을 UK661로 48 h 바람직합니다에 증가. 함께 찍은, 이러한 데이터는 닭 기본 bursal 셀 셀 문화 적응 및 매우 악성 IBDV 긴장13의 복제를 지원 수 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> 그림 1: 치킨 기본 bursal 셀 치킨 CD40L 존재 양식 수 있습니다. 치킨 기본 bursal 셀 chCD40L의 유무에 교양 있었다 (검은 바와 흰색 막대, 각각). (A) 수 라이브 셀와 (B) 실행 가능한 세포의 백분율 표시 시간-포인트 바람직합니다에 결정 되었다. 표시 되는 데이터는 3 개 이상 복제 실험의 대표, 오차 막대의 평균, 표준 편차 나타내고 통계적 의미 쌍된 학생의 t를 사용 하 여 결정 했다-각 시간 지점에서 테스트 * p &lt; 0.05.이 그림 Dulwich 외 허가 수정 되었습니다. 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> 그림 2: 닭 기본 bursal 셀 모두 셀 문화 적응의 복제 및 IBDV의 매우 악성 긴장을 지원할 수 있습니다. (A) 닭 기본 bursal 셀 모의 감염 또는 D78 또는 UK661에 감염 되었고 각 문화에서 샘플 고정, 표시 이미지: IBDV VP2, 녹색; 핵, 파란색입니다. 눈금 막대 = 7 µ m. (B) RNA는 리버스 복사할 지정된 시간-포인트 바람직합니다에 추출 하 고 IBDV VP4 유전자의 보존된 지역의 양이 많은 PCR에 의해 증폭 되었다. 로그10 배 변화 VP4 복사 번호 TBP 하우스키핑 유전자를 정상화 하 고 2-ΔΔCT 방법에 따라 모의 감염 샘플을 기준으로 표현 했다. 표시 되는 데이터는 3 개 이상 복제 실험의 대표 하 고 오차 막대의 평균 표준 편차를 나타냅니다. 이 수치는 Dulwich 외 허가 수정 되었습니다. 13.

여기는 닭고기 기본 bursal 셀 부르사의 파, 문화와 bursal 전염병 바이러스와 세포의 감염 및 바이러스 성 복제의 정량화에서의 격리에 설명합니다.

Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

이 방법은 면역 억제 바이러스가 B 세포와 상호 작용하는 방법과 같은 조류 바이러스 학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 현재 실험실에서 사용되는 불멸의 세포주보다 더 관련이 있다는 것입니다. 이 방법은 닭 세포가 IBDV에 어떻게 반응하는지에 대한 통찰력을 제공하지만 ALV 및 REV에도 적용 할 수 있습니다.이 방법은 우리의 연구에서 조류의 수를 감소, 그것은 연구에서 동물의 사용의 교체, 감소 및 정제를 의미 하는 세 Rs에 도움이. 미생물 안전 캐비닛에서 BF를 30 밀리리터의 감기 PBS로 적어도 세 번 세척하십시오. 세척된 조직을 페트리 접시에 옮기고 1X 콜라게나아제 D 용액의 5밀리리터를 추가합니다.멸균 가위 나 메스 블레이드를 사용하여 BF를 직경 5 밀리미터 미만의 조각으로 자른다. 섭씨 37도에서 30분 동안 주기적인 부드러운 동요를 통해 배양하세요. 그 후, 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 혼합물을 반복적으로 흡인하여 조직의 붕괴를 장려합니다.조직에 1X 콜라게나아제 D 용액의 5밀리리터를 추가하고, 37°C에서 주기적인 부드러운 동요로 30분간 배양합니다. 이 과정을 반복하여 혼합물을 흡수하고 신선한 콜라게나아제 D 용액을 추가하고 조직이 완전히 소화될 때까지 배양합니다. 더 이상 용해되지 않는 작은 과립이 있을 것입니다.소화된 세포 현탁액을 100미크론 세포 여과기를 칼슘 없이 1X HBBS의 20밀리리터로 전달합니다. 원심 분리기는 5 분 동안 400 배 g에서. 상체를 버리고 펠릿을 10 밀리리터의 10 밀리리터에서 5%의 FBS로 재보페합니다.그런 다음, 다당류와 디아트리조아테를 포함하는 밀도 그라데이션 미디어의 5밀리리터 위에 세포 현탁액의 10 밀리리터를 오버레이. 두 레이어 사이에 명확한 인터페이스가 있는지 확인합니다. 원심분리기는 900g, 섭씨 4도에서 20분 간.셀은 세포 미디어와 밀도 그라데이션 미디어 사이의 인터페이스에서 대역을 형성해야 합니다. 다음으로, 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세포를 제거하고 차가운 PBS를 포함하는 튜브로 옮춥시다. 세포를 원심분리하여 5분 동안 400회 g로 씻어낸 다음 차가운 PBS에서 다시 분리합니다.이 세척을 세 번 반복합니다. 먼저, 5분 동안 세포 현탁액을 400배 g로 원심분리합니다. 1X 완전 IMDM의 30 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.셀 서스펜션의 알리쿼트를 가져 와서 Trypan 파란색 용액에 추가하십시오. Trypan 청을 제외한 실행 가능한 셀 수를 계산하고 셀 수와 백분율 생존가능성을 결정합니다. 그 후, 5분 동안 세포 현탁액을 400배 g로 원심분리합니다.밀리리터당 1,000만 개의 세포밀도로 닭고기 CD40 리간드의 1-20 희석으로 보충된 완전한 IMDM에서 세포를 재중단합니다. 48~72시간 동안 96-또는 24웰 플레이트에서 세포를 배양한다. 48 ~ 72 시간 후 격리, 바이러스의 알리쿼시를 해동.샘플을 소용돌이치게 하고 얼음 위에 보관하십시오. IMDM 배지에서 1차 활액 세포를 다시 중단합니다. 셀 서스펜션의 10 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 사용하여 Trypan blue 용액의 10마이크로리터에 추가합니다.그런 다음 셀 수와 백분율 생존가능성을 결정합니다. 바이러스를 접종할 수 있도록 적절한 복합감염으로 1X 완전 IMDM으로 바이러스를 희석시. 이 희석을 소용돌이에 섞습니다.5 분 동안 400 배 g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 다음으로, 상체를 제거하고 바이러스 접종에서 세포를 다시 중단합니다. 주기적인 동요로 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.그 후, 5분 동안 세포 현탁액을 400배 g로 원심분리합니다. 바이러스 접종을 제거하고 1X 완전한 IMDM 매체로 세포를 세척한다. 96-또는 24웰 플레이트중 하나에서 세포를 배양합니다.이 연구에서, 닭 원발성 bursal 세포는 수용성 닭 CD40 리간드의 존재에 연속적으로 배양 ex vivo. 수용성 닭 CD40 리간드의 존재에서 배양된 세포는 6일 동안 밀리리터당 902, 000에서 363만 으로 4배 증가하는 것으로 여겨진다. 닭 CD40 리간드의 존재에서 세포 생존도 크게 향상됩니다.대표적인 공초점 현미경 심상에서, 감염된 세포는 세포질에 있는 IBDV의 존재와 일치하는 핵의 주위에 녹색 형광이 있는 것을 보입니다. 이것은 IBDV의 2개의 긴장, 세포 배양 적응한 긴장, D78 및 아주 악성 긴장, UK661를 위해 분명합니다. RNA는 감염 후 5, 18, 24 및 48시간에서 추출되고 IBDV VP4 유전자의 보존 된 영역에 특정 된 프라이머를 가진 RT-qPCR을 실시한다.IBDV VP4 발현은 D78을 감염한 후 48시간 동안 16, 603부, UK661로 48시간 후소시로 38개, 632부로 증가한다. 이 데이터는 닭 1 차 적인 bursal 세포세포가 세포 배양 적응하고 아주 악성 IBDV 긴장의 복제를 지원할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이 절차에 따라 RT-qPCR, 마이크로어레이 또는 RNA-Seq와 같은 다른 방법은 세포가 감염에 어떻게 반응하는지와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다.우리는 세포가 감쇠된 긴장및 IBDV의 아주 악성 긴장으로 감염에 어떻게 반응하는지 비교하고 우리의 지금 그(것)들이 그밖 바이러스성 감염에 어떻게 반응하는지 조사하고 있습니다. 이 세포를 배양하는 기능은 우리가 조류를 감염시킬 필요 없이 바이러스 병인및 면역 억제의 양상을 연구할 수 있습니다. 이것은 연구에서 동물의 사용의 교체, 정제 및 감소세 Rs에 상당한 영향을 미칠 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

이 비디오는 닭 배아에서 종양을 함유한 융모막막의 분리를 보여줍니다. 수확된 CAM은 추가 다운스트림 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.

Chick Chorioallantoic Membrane Harvest: 닭 달걀에서 종양 이식 함유 Chorioallantoic Membrane을 분리하는 방법

수정 가능한 닭고기 달걀은 높은 수율의 바이러스를 증명하는 편리하고 비용 효율적인 시스템을 제공하기 때문에 많은 양의 인간 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 데 널리 사용됩니다.

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여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

조류 배아 발달 후기 단계에서 난황낭 막의 지질 활용 메커니즘을 연구하기 위해 1차 일본 메추라기 배아 내배엽 상피 세포 배양 시스템을 구축했습니다.

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여기서, 우리는 포자조이트 또는 2세대 메로조이트에 의한 닭에이메리아 기생충의 안정적인 형질변환을 달성할 수 있는 방법을 제공했다. 이종 항원 유전자를 발현하는 유전자 변형 에이메리안 기생충은 백신 전달 차량으로 사용될 수 있었다.

닭 에이메리아 기생충의 핵 과 생체 내 전파

여기에서 우리는 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산, 정제 및 정량화를 위한 상세한 절차를 제공한다. 이 프로토콜은 지속적으로 &gt; 6 × 10,9 플라크 형성 단위 / mL를 산출하여 생체 내 동물 연구에 적합한 바이러스 양을 제공합니다. 생체내 안전성을 보장하기 위한 추가의 품질 관리 분석법이 기재되어 있다.

Allantoic Fluid로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산

이 논문에서는 닭 GSDME(chGSDME-NT) 및 요오드화 프로피듐(PI)의 N 말단 단편에 대한 항체로 이중 염색 후 유세포 분석을 사용하여 발열 세포를 식별하는 방법에 대해 설명합니다.

유세포분석(Flow Cytometry)에 의한 Pyroptosis의 검사

이 프로토콜은 감염된 오리에서 기억 T 세포를 분리하여 시험 관 내에서 조류 T 세포를 배양하는 방법을 설명하며, 이를 통해 고도로 정제된 특정 오리 T 세포를 생성할 수 있습니다. 또한 오리 T 세포에서 IFN-γ 분비를 정확하게 측정하기 위해 세포 내 사이토카인 염색(ICS) 방법이 확립되었습니다.

체외(In Vitro ) H5N1 특이적 덕 T 세포 배양 및 세포 내 사이토카인 염색 방법을 사용한 면역 반응 검출

이 방법은 닭 배아를 박테리아 병원균 L. monocytogenes를 생존 가능하지만 배양할 수 없는(VBNC) 상태에서 되살리고 박테리아 휴면 메커니즘에 대한 이해에 잠재적으로 더 사용할 수 있는 간단하고 비용 효율적인 생체 내 모델로 보여줍니다.

생존 가능하지만 배양할 수 없는 병원체를 되살리기 위한 생체 내 모델로서의 닭 배아

배우세요 닭 원발 법스 세포 배양 및 IBDV 감염 모델을 통해 조류 바이러스학 연구를 수행하는 방법을. 이 기술은 면역억제 바이러스와 B 세포 상호작용을 연구하며 동물 실험의 3R 원칙을 지원합니다.

Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

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