Name: 애벌레 Zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 배우세요 형광 표지 식품을 이용한 고처리량 장 통과 시간 측정법을 Danio rerio 유생에 적용하는 방법입니다. 이 기술은 위장 생물학 연구와 약물 효과 분석에 효율적인 도구를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Carpetbones.com의 사이먼 카사 르 설계 하 고 만든 기 교통 분석 결과의 생활에서 절차를 설명 하는 데 사용 하는 애니메이션된 그림.

여기 설명 된 모든 방법을 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) AbbVie.Abbvie의 밑에 운영 한다 국가 학회 건강 가이드의 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 대 한 협회에 의해 신임 된 시설에서 평가 및 인증 실험실 동물의 배려 (AAALAC). 아니 동물 건강 관심사는 이러한 연구에서 관찰 되었다.
1. 번 식 성인 Zebrafish 태아를 수집
<ol><li>집과 품종 성인 zebrafish 일반적인 농업을 사용 하 고 사례를 번 식. 예를 들어 Westerfield10를 참조 하십시오.</li>
	<li>탈수 용 해 하 여 배아 중간 준비 바다 소금 ( 재료의 표참조)에 이온 물 60 mg/l.의 농도에</li>
	<li>수집 성인 사육 챔버, 린스에서에서 계란을 수정 된 배아 매체와 고 14시 10분에 28 ± 1 ° C에서 10 cm 배양 접시 (접시 당 50 배아)에서 태아의 약 50 mL에 배아를 집 h 라이트: 어두운 주기.</li>
	<li>24 시간 및 각 접시 접시 당 50 배아 포함 되도록 배아 생존 보충 후 살아남은 비 배아를 제거 합니다.</li>
</ol>2. 염색 비 식품을 사용 하 여 피드를 애벌레 기차
<ol><li>4일 하루 후 수정 (4 dpf)에 각 페 트리 접시 가루 애벌레 물고기 음식의 2 mg에에서 애벌레 피드 ( 재료의 표참조) 뿌리는 물 위에 음식으로.</li>
	<li>애벌레를 허용 피드를 다음 깨끗 한 그들을 전송 3-4 h (음식) 페 트리 접시 포함 하는 약 50 mL 신선한 배아 매체.<ol>
<li>가능한 작은 음식으로 전송에 투입, 새로운 요리에 최종 전송 되기 전에 약 50 mL 신선한 배아 매체를 포함 하는 페 트리 접시에 각 유 충을 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수 유 및 5 dpf 및 6 dpf에 애벌레의 세 정을 반복 합니다.</li>
</ol>3. 6 dpf에 형광 음식과 피드 7 dpf에 애벌레를 준비
<ol><li>형광 라벨 (라 함 형광 음식, 필드 외 의 방법으로 포함 하는 음식을 준비합니다 3). 짧게, 믹스 300 µ L 형광의 이온 물 ( 재료의 표참조), 100 µ L 고 200 mg의 가루 10 cm 시계 유리에 애벌레 음식.</li>
	<li>시계 유리에 얇은 층으로 결과 붙여넣기를 확산. 대 한 어둠 속에서 실 온에서 건조 붙여넣기 허용 > 8 h.</li>
	<li>시계 유리에서 말린된 혼합물을 다쳤어요, 분말, 그리고 어둠 속에서 실내 온도에 저장에 호감. 형광입니다 이제 애벌레에 먹이를 준비.</li>
	<li>먹이 형광 애벌레를 같은 방식으로 이전 수 유, 일 7 dpf에는 제공 하는 2 mg 형광 음식 접시 당 (2.1-2.2.1 단계 참조). 참고: 음식을 잘게 지상 분말에 인지 확인 합니다. 문 지르고 엄지손가락과 집게손가락 사이 종이 무게에 형광 음식을 잘게 지상 식품 확보를 위한 유용한 방법입니다.</li>
</ol>4. 준비 시험 화합물의 집중된 투약 솔루션
<ol><li>각 테스트 대상 복용량 x 2 농도에 배아 중간에 화합물을 디졸브. 복용량 범위 테스트를 원하는 경우 원하는 복용에 대 한 적절 한 농도의 여러 집중된 투약 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>24 애벌레 치료 될 수 있도록 충분히 각 집중된 투약 솔루션을 준비 합니다. 각 유 충 100 필요 합니다 µ L 주입 솔루션 (최종 볼륨 잘 당 200 µ L), 그래서 아주 최소한 2.4 mL 복용량 솔루션은 각 치료 그룹;에 필요한 2.5 mL 적절 한 볼륨을 것입니다.</li>
	<li>용 매 (예: 디 메 틸 sulfoxide) 시험 화합물의 초기 solubilizing 사용 되었다, 적절 한 차량 제어 복용량 준비 (즉, 용 매 화합물 하지 않고 복합 치료로 동일한 양의). 그리고, 각 화합물 처리 그룹에 대해 수행 된 24 애벌레 치료에 충분 한 차량 솔루션 준비.</li>
</ol>5. 전송 애벌레 96 잘 접시와 치료 적용
<ol><li>후 2 시간에 대 한 형광 음식에 피드를 애벌레 허용 되었습니다, 전송 피 펫을 사용 하 여 이전 일에 수 유 후 이루어졌다 rinsing 접시에 그들을 이동.</li>
	<li>각 유 충은 씻어 서 후 100 µ L 태아 매체, 함께 그것을 철회 하 고 96 잘 폴리스 티 렌 원뿔 아래 다 잘 접시의 우물으로 이동 ( 재료의 표참조), 유 충으로 잘으로 전체 100 µ L 태아 매체 분배.</li>
	<li>애벌레의 필요한 번호 96 잘 접시에 전송 되었습니다, 일단 2 × 100 µ L 집중 투약 솔루션을 각 영역을 추가 합니다. 참고: 12 채널 멀티 채널 피 펫의 사용 용이 (12-에-한 번) 애벌레의 급속 한 먹이 지. 잘못 된 치료를 실수로 추가 하지 않도록에 가까운 트랙의 애벌레는 치료와 함께 복용 하 고 치료 사이 피 펫 팁을 변경 해야 합니다. 계속.</li>
</ol>6. 측정 초기 및 후속 형광 각 우물에서
<ol><li>추가한 후 복용량 솔루션 장소 96 잘 접시 플레이트 분 광 광도 계에 흥분 하 고 형광 라벨에서 배출 감지. 참고:는 노란색-녹색 라벨 사용된 (참조 테이블의 재료)에 대 한 적절 한 파장의 빛은 505에서 흥미로운 nm와 515에 감지 nm.</li>
	<li>접시를 동요 하지 않고 즉시 승계에 있는 5 시간 아래에서 96 잘 접시의 형광을 읽기. 우물에서 초기 형광으로 각 우물에서 5 읽기의 최소 값을 사용 합니다. 참고: 5 읽기 접시 읽을 때마다 찍은 이유는 애벌레 때때로 흥분 빛의 경로에서 수영을 그들의 창 자에서 음식에서 나온된 배설물의 unrepresentative 인 매우 큰 신호. 최소 5 읽기의 복용 취소 transited 음식에서 인위적으로 높은 측정을 사용 하지 않도록 도울 수 있다.</li>
	<li>96 잘 접시의 형광 (초기 읽기에 대해 수행 된)를 읽고 첫 번째 2 h 포스트 주입, 30 분 마다 3-4 시간 t, 주입 한 다음 번에 대 일 분 마다 5, 6, 7, 및 8 포스트 주입 시간 동안 매 시간 마다.<ol>
<li>하지 (96 잘 접시 진동)에 의해 방해를 받아 주의 읽기 사이 대변을 정착 하 고 28 ± 1 ° C 읽기 사이 애벌레를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>28 ± 1 ° C에서 밤에 애벌레를 품 어 고 애벌레 하루 전에 복용 했다 같은 시기 다음 아침 96 잘 접시에서 형광을 읽으십시오. 이 측정을 사용 하 여 24 시간 후 복용량 형광으로.</li>
</ol>7. 데이터 분석
참고: 여기 우리가 잘 당 축적을 계산 하 고 각 시간 지점에 대 한 그룹의 평균.
<ol><li>잘만 최소 5 읽기의 각 값을 사용 하 여 당 축적을 계산 하기 위해 각 시간 점의 값에서 초기 값을 뺍니다. 초기 값을 뿐만 아니라 (이 인해 각 잘 0의 초기 축적)에 대 한이 계산을 수행 합니다.<ol>
<li>24 시간 시점에서 잘에서 축적 미만 150 상대 형광 단위 이면 잘; 추가 분석에서 제외 이러한 낮은 값은 수 유를 하는 동안 가장 낮은 또는 애벌레에 의해 형광 음식의 아무 섭취 가능성이 되며 따라서 그 애벌레 없습니다 좋은 과목 환승 시간을 측정 하기 위한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 시간 지점에 대 한 공동 치료 애벌레로 그 평균의 표준 오차를 포함 하는 웰 스에 대 한 평균 축적을 계산 합니다.</li>
	<li>각 치료 그룹에 대해 x 축에 시간 대 y 축에는 평균 축적을 플롯 하 고 그 곡선 (AUCs)에서 영역을 비교. 참고: 트리 트 먼 트를 크게 느린 운송 시간을 가속 AUCs 크게 작거나 큰, 차량 취급 그룹 보다 각각 있을 것 이다.</li>
</ol>

<ol><li>Berghmans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+based+assays+for+the+assessment+of+cardiac%2C+visual%2C+and+gut+function+-+Potential+safety+screens+for+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+and+Motility%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21550442">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+endogenous+and+exogenous+nitric+oxide+on+gut+motility+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).</li>
<li>Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+enteric+and+vagal+innervation+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+gut%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut.</a> The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+A+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study.</a> Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).</li>
<li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca%27s+drug+pipeline%3A+A+five-dimensional+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR, USA. (2000).</li>
<li>Cassar, S., Huang, X., Cole, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+predicting+drug+effects+on+gut+transit+time+using+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacolical+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish.</a> Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).</li>
<li>McKim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+tiered+approach+to+in+vitro+predictive+toxicity+screening%3A+A+focus+on+assays+with+in+vivo+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).</li>
<li>Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+neuroactive+drugs+through+high-throughput+behavior-based+chemical+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 153(2014).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).</li>
</ol>

디자인, 연구 행위, 그리고이 연구에 대 한 재정 지원 AbbVie에 의해 제공 되었다. AbbVie는 데이터, 검토, 및 원고의 승인의 해석에 참가 했다. 미 카사 르, X. Huang, 그리고 토니 콜 AbbVie의 직원 공개 추가 충돌의 관심이 없다.

Zebrafish 애벌레 기 운송 시간, 여기, 측정 하기 위한 새로운 분 광 광도 법 방법은 포유류 기-기능에 대 한 치료 효과 예측할 수 있는 효율적인 분석 결과입니다. 분석 결과 낮은 감도, 그것은 첫 번째 계층 분석 실험 수 독성12에 따라 후보 치료의 껍질 벗기기 위해 적합 높은 긍정적인 predictivity가 있다. 이 방법은 쉽게 실행 하는, 높은 처리량, 있으며 처리 단계 형광 현미경 검사 법 보다 덜 동물을 사용 하 여.
이 방법에 내재 된 기술적 도전이 있다. 형광 음식을 먹이 및 개인 우물에 그들을 전송 하는 것은 처음에 도전 후 개별 애벌레를 잡기. 그러나, 연습, 숙련 된 기술자 15 분 미만에 96 잘 접시를 채울 수 있습니다. 만약 주어진된 시간 지점에서 접시는 실수로 동요와 배설물 문제 읽기 전에 우물의 바닥에서 불안, 축적 감소 표시 됩니다. 이것은 동요 하지 않고 신중 하 게,에서 plate(s)를 이동 하 여 피할 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 정상적인 움직임, 플레이트 분 광 광도 계 자동화 한 서랍을 포함 하 여 분석 결과 방해 하지 않았다. 독자는 히터 장착 플레이트 (즉, 접시 필요가 없습니다 측정 사이 인큐베이터에 반환), 분석 결과 근처 실험실 벤치 장애의 더 낮은 기회에 대 한 최적화 수 있지만 이것은 우리의 경험에서 필요 하 고.
초기 시도 방법에 먹이 일 전에 분석 결과에 포함 되지 않았다. 그 '연습' 수 유 없이 낮은 숫자 애벌레의 치료 응용 프로그램 전에 허용 되는 시간 동안 충분 한 형광 음식 소비. 그 시도에 치료 그룹 내에서 유사 했다, 하 고 더 많은 데이터를 시간이 지남에 낮은/아니오 신호를 축적으로 인해 사용할 수 없게 되었습니다. 심지어 연습 먹이, 일부 애벌레 형광 음식의 충분 한 양을 소모 하지 않는, 그 애벌레에서 데이터 제외 그룹 내에서 변이 감소와 치료 효과 파악 하는 능력을 증가. 큰 그룹 크기 (즉, 24 대 12) 시작 유용한 데이터 분석에 기여 하는 애벌레의 충분 한 숫자에 대 한 수 있습니다.
그러나 형광 현미경 검사 법 마지막 시간 지점에서 microplate 데이터 반영 아트로핀 그룹, 차량 그룹에 비해 낮은 최종 신호 음식 교통 아트로핀 치료 애벌레 (표시 되지 않음)에서 24 시간으로 거의 완료 했다 계시 한다. 반대로, 높은 최종 microplate 형광 차량 취급 애벌레 마지막 시간 지점 하기 전에 그들의 GI로 무효화 분명히 있다 하더라도 전송 시간을 가속 치료와 연관 되었다. 형광 음식을 먹이 하는 애벌레의 치료에 무작위로 할당을 바탕으로, 우리 가정 형광 음식의 동등한 소비 평균 치료 그룹 중. 대변에서 형광 애벌레 기 관에서 소요 된 시간을 감소, 이렇게 및 위에서 설명한 패턴에 따라, 또는 빠른 교통 배설물을 어떻게든 형광을 추가. 그러나 실제 원인은 알 하지 심문, 분석 결과 아직도 이다 측정 하 고 그룹 사이 교통 시간 비교.
작은 분자 화합물에서 독성 기 효과 감지에이 방법의 고용은 하나의 응용 프로그램 이다. 다른 가능한 응용 프로그램 (예를 들어, 과민성 대 장 증후군) 질환 모델링 등 소설 치료 발견 같은 질병, 또는 프로 활동적인 화합물을 발견. 또한, 유전자 변형 모델 결합,이 방법은 사용 될 수가 정상 기 교통, 교통 장애, 장의 신경 결핍 등에서 유전자의 역할. Zebrafish 애벌레 세포 배양의 추정 규모는 전체 유기 체 플랫폼을 제공 하지만 여러 조직과 제 브라에서 함께 작동 하는 무수 한 세포 유형 이후, 시스템 생물학 질문 요청 받을 수 있습니다 및이 사용 하 여 응답 모델입니다.
발전 기술 및 새로운 응용 프로그램으로, zebrafish 독성 테스트의 행위에 효율성 향상을 나갈 것입니다. 방법 및 분석을 처리 하는 애벌레 zebrafish 높은 처리량13,14에서 개선 하기 위해 계속 됩니다. 여기에 제시 된 새로운 방법은 더 강렬한 zebrafish 연구를 만들 수 있는 개선의 한 예입니다.

Zebrafish (Danio rerio) 척 추가 있는 생물학 모형 및 약물 독성 및 효능; 예측 하는 데 사용 됩니다. 이 분야에서 새로운 응용 프로그램 매년 등장. 포유류 모델 zebrafish의 이점이 그들의 통치, 작은 크기, 그리고 organogenesis 통해 투명도 포함 됩니다. Zebrafish 장기의 기능, 예를 들어, 심장, 눈, 위장 (GI)1,2에 복합 영향 평가로 약물 후보 급성 독성, 또한 예측 하는 데 사용 됩니다. Zebrafish 개발 및 생리학 많은 방법3 에 포유동물의 그들과 유사 하 고 인간의 질병과 관련 된 유전자의 80%는 제 브라 체4.
Zebrafish의 GI로 포유류 기 요로 비슷한 생리학 하지만 더 간단한 건축5. Zebrafish는 아무 위; 이전 장 전구는 식량 창 고 역할을 합니다. 제 브라 내장에서 유전자 발현5포유동물 많은 유사점이 있다. 포유류 처럼, zebrafish의 장의 신경 제어 창 자 운동 성, 그리고 장 innervation 다른 척추 동물6,7의 거울. 이러한 유사점을 바탕으로, 인간의 내장의 기능 장애는 zebrafish, 포유류 모델8에서 파생 하는 방법을 사용 하 여에서 연구 되었습니다.
약물의 임상 테스트 동안 GI 편협 일반적 이며 인간의 건강에 심각한 위협이 있습니다. 2005 년-2010 년 동안 주요 제약 회사에서 프로그램의 검토 공개 임상 연구 종료9의 9%에 대 한 주요 원인으로 기 안전. 전 임상 포유류 모델에서 기 독성에 대 한 테스트 시간, 화합물, 및 노동 비쌀 수 있다. 기 대 중 교통에 대 한 예측 높은 처리량 분석 결과 유연성 테스트, 독성 화합물을 제공 하 고 3Rs 영향을 제공할 수 있습니다. 이러한 분석 결과 제공 하 고 새로운 방법 여기에 설명 된 프로토콜에 의해 제공 됩니다. 이 높은 처리량 분석 결과 초기 신약 개발 후보, 우선순위 및 더 큰 종에 테스트 기 안전의 감소에 기여에 채택 될 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>야생형 제브라피쉬 번식 쌍</td><td>다양한 출처 - 예를 들어 ZIRC (Zebrafish International Resource Center)</td> <td>ZL-1</td><td>AB 계통의 성체 야생형 제브라 피쉬</td></tr><tr><td>1.7L 번식 탱크 - 비치 스타일 디자인</td><td>Tecniplast</td><td>1.7L SLOPED</td><td>번식 탱크</td></tr><tr><td>인스턴트 오션 바다 소금</td><td>Intant Ocean</td><td>SS15-10</td><td>탈수 바다 소금</td></tr><tr><td>첫 한입 애벌레 물고기 먹이</td><td>히카리</td><td>20095</td><td>분말 유충 생선 사료</td></tr><tr><td>: 황록색 (505/515) 형광구</td><td>Invitrogen</td><td>F8827</td><td>형광 라벨</td></tr><tr><td>V- 바닥 96 웰 폴리스티렌 마이크로 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249570</td><td>각 웰에 V 자형 바닥이있는 멀티 웰 마이크로 플레이트</td></tr><tr><td>: Atropine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0132</td><td></td></tr><tr><td>Amitriptyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8404</td><td></td></tr><tr><td>Tegaserod</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML1504</td><td></td></tr><tr><td>Metoclopramide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0763</td><td></td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M2e 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>Spectramax M2e</td><td>형광 여기 및 방출 감지가 가능한 다중 웰 플레이트 분광 광도계.</td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>분광 광도계 데이터 수집을 위한</td> <td>SoftMax Pro</td> 소프트웨어</tr></tbody></table>

애벌레 zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Zebrafish는 약 안전 테스트에 대 한 대체 모델 생물으로 사용 됩니다. Zebrafish의 위장 (GI)는 포유류의 유전, 신경, 그리고 약리 유사점이 있다. 약물의 임상 테스트 동안 GI 편협 일반적 이며 인간의 건강에 심각한 위협이 있습니다. 전 임상 포유류 모델에서 기 독성에 대 한 테스트 시간, 테스트 화합물, 및 노동 비쌀 수 있다. 여기에 제시 된 높은 처리량 방법 기 안전 문제를 예측 하기 위해 사용할 수 있습니다. 포유류 모델에 비해,이 메서드는 화합물의 낮은 수량을 사용 하는 동안 테스트 기 교통에 복합 효과의 더 편법 평가 대 한 수 있습니다. 이 방법에서는, 애벌레 zebrafish (7 일 게시물 수정) 형광 라벨을 포함 하는 음식을 먹이. 수 유, 후 각 애벌레 물고기는 96-원뿔-하단-잘 접시의 우물에 배치 하 고 테스트 화합물 (물에 녹는) 또는 차량으로 약을 복용. 직감 교통 발생, 대변, 우물의 바닥에 축적 하 고 속도는 이런 우물의 바닥에서 형광을 측정 하 여 모니터링 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 시간 동안 반복적으로. 주어진된 처리 그룹에서 애벌레에서 형광은 평균 하 고 이러한 값은 그래프로 표준 오류 함께 각 측정 시간에 대 한 저조한 식품의 평균 운송 시간이 지남에 나타내는 곡선. 소화 관 통과 시간에 미치는 영향 차량 대우 그룹의 각 치료 그룹에 대 한 곡선 아래의 영역을 비교 하 여 식별 됩니다. 이 방법은 알려진 임상 기 효과; 약물에 의해 유도 된 zebrafish 기 운송 시간에 변화 감지 그것은 하루 기 효과 대 한 치료의 수십이 사용할 수 있습니다. 따라서, 안전한 화합물 수 있습니다 신속 하 게 우선 순위가 포유류 테스트는 신속한 검색과 proffers 3Rs 발전.

(그림 1) 동일한 기능을 평가 하기 위한 낮은 처리량 방법입니다 형광 현미경 검사 법의 높은 처리량 교체로 병사 교통 평가 플레이트 기반 분 광 광도 법을 사용 하 여이 메서드를 사용할 수 있습니다. 그림 1에 데이터를 생성 하기 위해 동일 하 게 취급된 생선 기 교통 4 시간 지점에서 형광 현미경 검사 법 (대표 이미지 표시) 또는 분 광 광도 법을 사용 하 여 분석 되었다 0, 4, 8, 그리고 24 시간 후 주입; 그 실험에서 데이터의 비교 했다 높게 상관 된 결과 (데이터 r2 의 선형 회귀 0.95 =). 선형 회귀는 부정적인 기울기 유지 형광 신호를 측정 하는 현미경과 분 광 광도 법 측정 transited 신호.
인간에서는, 잘 설립 기 활동으로 서로 다른 메커니즘의 화합물의 효과에서 zebrafish 분 광 광도 법 분석 결과 (그림 2)를 사용 하 여 검색할 수 있습니다. 차량 취급 컨트롤에 비해, 아트로핀 (4.2 µ M) 및 심 실 (5 µ M) 감속 기 교통 tegaserod (3.3 µ M) 동안 고 metoclopramide (33 µ M) 전송 시간을 가속. 리스로 마이 신 (14 µ M), 전송 시간을 가속 것으로 예상 했다이 방법에 의해 측정 된 효과가 없습니다. 전에 제거 데이터로 애벌레 없이 또는 매우 낮은 신호 처리 그룹 크기 24 했다. 타입-1-오류 제어를 위한 Tukey의 솔직히 상당한 차이 사용 하 여 화합물 처리 고 차량 처리 그룹 사이 시간 포인트 당 평균 신호에 대 한 AUC 비교 되었다. 효과 중요 한 경우에만 고려 되었다 p ≤ 0.05. 위의 치료에 사용 하는 농도 최대 복용량을 용납, 이전 실험에서 결정 및 총 관찰 없이 관찰 부정적인 영향으로 가장 높은 복용량으로 정의 했다.
분 광 광도 법 분석 결과 화합물의 복용량-의존 효과 측정할 수 있습니다. 그림 3 아트로핀 zebrafish 애벌레 복용량 독립적으로 기 운송 속도가 보여주는 데이터를 제공 합니다. 아트로핀의 낮은 복용량, 테스트, 0.042 µ M 두 높은 농도 각 했다 상당한 영향, 0.42 µ M의 4.2 µ M 보다 효과 적은 데 더 큰 영향을 했다.
새로운 분석 결과 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 즉, 활성 및 비활성 대상 시스템에 각각 알려진 화합물을 테스트 하 여 평가 될 수 있다 (이 경우 대상 시스템은 포유류 기 교통). 분 광 광도 법 분석 결과 대 한 18 활성 (긍정적인) 컨트롤 및 6 비활성 (부정적인) 컨트롤 테스트 되었습니다. 이러한 실험을 바탕으로, 분 광 광도 법 분석 결과 높은 긍정적인 예측 값 (90.9%), 그러나 낮은 감도 (55.6%)와 부정적인 예측 값 (38.5%). 이 값은 표 1에 제공 된 데이터에서 파생 됩니다. 그들은 실제로, zebrafish 환승 시간은 치료에 의해 영향을, 경우 포유류 교통 영향을 받을 것입니다를 반영. 그러나, zebrafish 환승 시간에 영향을 주지 않습니다 경우에, 이것은 포유류 효과의 예측 하지입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig1.jpg"> 그림 1: 형광 음식 교통 플레이트 기반 분 광 광도 법에 의해 현미경 이미징 및 신호에 해당 이득에서 신호의 손실이 감지. (A) 기 운송 시간에 아트로핀 (4.2 µ M) 효과의 분석에서 대표적인 현미경 이미지. (B) 평균 신호 미세한 이미지에서 계량은 매우 (부정적인) 폴된 대변 (분 광 광도 법)에서 동일 하 게 대우에서 신호와 상관. 아트로핀 치료 물고기에서 데이터 빨간색에 있습니다. 이 그림에서 카사 르 외 허가로 복사 된 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig2.jpg"> 그림 2 : 치료 기 전송 속도 변경 하는 수 다 잘 플레이트에서 시간이 지남에 형광 신호를 축적 분석. 별표 (*)는 차량 취급 생선 보다 크게 다른 AUC를 나타냅니다. 오차 막대는 시간 포인트 당 처리 그룹에서 애벌레에 대 한 평균 신호의 표준 오차를 나타냅니다. 카사 르 외 허가이 수치를 다시 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58497/58497fig3.jpg"> 그림 3 : 시간이 지남에 배설물 축적의 형광 분 광 광도 법에 의해 반영 아트로핀 복용량 의존 zebrafish 직감 환승 시간이 느려집니다. 별표 (*)는 차량 취급 생선 보다 크게 다른 AUC를 나타냅니다. 오차 막대는 시간 포인트 당 처리 그룹에서 애벌레에 대 한 평균 신호의 표준 오차를 나타냅니다. 이 수치는 카사 르 외 허가 다시 사용 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58497/58497fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/58497/58497table1.jpg"> 표 1: 포유류와 물고기 24 화합물의 병사 활동. 이 테이블은 카사 르 외 허가 다시 사용 11.

이 프로토콜의 목표 높은 처리량 패션에 애벌레 zebrafish의 용기를 통해 붙일 레이블 음식의 통과 시간을 측정 하는 것입니다.

애벌레 Zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

이 방법은 유전자 발현이 어떻게 변화하거나 환경 적인 도전이 창자 기능을 바꾸는가와 같은 위장 생물학에 관한 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있었습니다. 이 기술의 주요 장점은 장 간 운송을 측정하는 기존의 방법보다 시간이 적게 걸리고 실행하는 것이 더 쉽다는 것입니다. 분석 당일, 애벌레는 형광 라벨이 들어 있는 음식을 먹이며, 그 음식을 먹으면 라벨이 장에 축적됩니다.먹이를 먹은 후, 그들은 헹구고, 먹지 않는 음식에서 분리되고 각 애벌레는 다중 우물 접시로 옮겨져 있습니다. 우물은 대변 물질이 무효화될 때 우물의 중앙에 떨어질 수 있도록 원물 바닥이 있습니다. 이제 기억, 여러 우물 플레이트에 많은 애벌레가 동시에 모니터링 할 수 있습니다 플레이트 분광계를 사용하여, 이는 무효 배설물의 양을 측정.그리고 시간이 지남에 따라 더 많은 것이 무효화됨에 따라 그에 따라 신호가 증가합니다. 이러한 방식으로 장내 이동을 측정하는 높은 처리량 방법이 있습니다. 수정 후 4일째에, 각 페트리 접시에 물 위에 가루 애벌레 생선 사료 2밀리그램을 뿌려 애벌레를 먹입니다.애벌레가 4시간 동안 먹이를 주도록 합니다. 먹이후 모든 애벌레를 신선한 배아 배지를 함유한 큰 헹구는 접시에 옮기는다. 50 밀리리터 세로지오테리언 파이펫을 사용하여 남은 음식을 가능한 한 많이 부드럽게 진공 청소하여 애벌레를 포획하지 않도록 주의하십시오.신선한 배아 배지의 50 밀리리터를 포함하는 새로운 페트리 접시에 애벌레를 전송합니다. 2일 동안 먹이주기, 헹기 및 이송 과정을 반복합니다. 6일째에 수정 후, 10센티미터 시계 유리에 200밀리그램의 말린 식품을 추가하여 형광 식품을 준비하기 시작합니다.300 마이크로리터의 형광 라벨과 100마이크로리터의 탈온화된 물을 넣고 짧게 섞어보습니다. 결과 페이스트를 시계 유리의 얇은 층으로 펴고 어둠 속에서 8시간 이상 실온에서 건조시키십시오. 그 후, 시계 유리에서 말린 혼합물을 긁어.분말에 분쇄하고 어둠 속에서 실온에 보관하십시오. 7일째수정 후, 페트리 접시에 2밀리그램을 물 위에 뿌려 유충에 형광 식품을 먹이세요. 애벌레가 2시간 동안 먹이를 주도록 합니다.한편, 배아 배지에서 각 시험 화합물을 용해하여 목표 용량의 2배 이상 인 농도로 농축 투약 용액을 준비하여 2.5 밀리리터이상의 최종 부피를 가진 다. 먹이 주기가 끝나면 이송 파이펫을 사용하여 큰 헹을 수있는 접시로 옮습니다. 이전에 더 엄격한 진공 청소기로 설명 된 모든 애벌레를 헹구는 다.최종 헹구기 동안 남은 형광 식품을 가능한 한 많이 제거하여 실수로 96웰 플레이트로 옮겨질 가능성을 줄이는 것이 중요합니다. 각 애벌레가 헹구면 파이펫을 사용하여 헹구는 접시에서 배아 배지 100 마이크로리터와 함께 피펫을 사용했습니다. 유충과 전체 100 마이크로리터를 96웰의 폴리스티렌, 원물 바닥, 멀티웰 플레이트의 우물로 분배합니다.모든 애벌레가 전달되면 준비된 투약 솔루션 100마이크로리터를 적절한 우물에 추가합니다. 모든 주입 솔루션이 추가된 후 플레이트를 분광포토미터에 적재합니다. 플레이트를 흔들지 않고 바닥에서 5번 연속적으로 형광을 측정합니다.각 우물에서 가장 낮은 판독값은 데이터 분석 중에 초기 형광으로 지정됩니다. 약 28도에서 접시를 배양하십시오. 측정 과정을 반복하고, 처음 2시간 동안 20분마다 형광을 읽고, 읽기 사이에 배양합니다.세 번째 와 네 번째 시간 후 투약에 대한 30 분마다 형광을 측정한 다음 시간당 측정을 5 ~ 8 시간 동안 합니다. 하룻밤 사이에 28도에서 유충을 배양하십시오. 다음 날, 24 시간 후 투약에서 형광을 읽으십시오.이 프로토콜은 플레이트 기반 분광광법을 사용하여 형광 현미경 검사법을 위한 고처리량 대체체로 GI 전송을 평가합니다. 이 두 가지 방법을 비교하는 대표적인 결과는 24시간 동안 동일하게 처리된 물고기를 분석하여 생성됩니다. 여기서 볼 수 있듯이, 현미경 검사법은 유지된 형광 신호를 측정하고 분광광관측제가 전송된 신호를 측정하기 때문에 부정적인 경사와 함께, 결과는 매우 상관관계가 있다.이질적인 메커니즘을 가진 화합물의 분석은 차량 처리 통제, 아트로핀 및 아미트립틸린 느린 GI 통과와 비교될 때 나타났습니다. 반면 테가세로드와 메토클로프라미드는 환승 시간을 가속화하는 것으로 보입니다. 포유류 의 반응에 따라 운송 시간을 가속화 할 것으로 예상된 에리스로 마이신은 대신 얼룩말 물고기 운송 시간에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.추가 분석은 atropine이 얼룩말 물고기 애벌레에서, 부양가족 복용량을 GI 전송을 느리게 한다는 것을 보여줍니다. 테스트 된 가장 낮은 복용량, 042 마이크로 몰러, 아무 의미 있는 효과 했다. 두 개의 더 높은 복용량은 각각 중요 한 영향을 볼 수 있는 동안.이 방법은 약물 이나 약물 후보에서 독성 GI 효과 감지 를 포함 하 여 많은 응용 프로그램, 질병 모델링, 과민성 대 장 증후군 등, 이러한 질병에 대 한 새로운 치료의 발견, 그리고 프로 운동 화합물의 발견.

high-throughput-measurement-of-gut-transit-time-using-larval-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

신진 대사 연구 용 활용을 받아왔다 강력한 척추 모델을 대표 Zebrafish. 여기를 측정 할 수있는 빠른 방법을...

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

본 연구에서는 표준 배아 미세주입 및 실체현미경 장비를 활용한 제브라피쉬 치어의 새로운 미세강제투여(microgavage) 방법을 제시합니다. 우리는 미세강제투여가 다양한 물질을 제브라피쉬 치어의 장관 내로 정밀하게 정량 투여하는 데 유용한 안전하고 효율적인 기술임을 입증합니다.

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

이 비디오는 제브라피시 유충의 회피 및 도둑 모타시스 분석을 설명합니다. 이 비디오는 시각적 혐오 자극에 반응하는 제브라피시 유충의 행동을 조사합니다.

제브라피시 회피 및 티그모타시스 분석: 혐오스러운 시각적 자극에 대한 반응으로 유충의 행동을 조사하는 고처리량 방법

이 기사는 유충의 이동을 모니터링하여 독성 화합물에 대한 제브라피쉬의 행동 반응을 설명합니다. 이 프로토콜은 환경 오염 물질에 대한 제브라피시 유충의 반응 예를 더 자세히 살펴봅니다.

Larval Locomotion Assay: 제브라피시 유충에서 화합물의 신경행동 독성을 연구하기 위한 고처리량 방법

우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

우리는 빛 시트 형광 현미경 검사법과 생체 내 제브라피시 심장을 연구하는 최적화 된 도구를 설명합니다. 특히, 우리는 밝은 심장 형질 전환선을 제안하고 발달과 심장 결함을 피하는 새로운 부드러운 임베드 및 고정 기술을 제시합니다. 심장 이미징에 적응된 가능한 데이터 수집 및 분석 파이프라인도 제공됩니다.

얼룩말 물고기 배아에서 빠른 심장 역학의 빛 시트 현미경 검사

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

배우세요 형광 표지 식품을 이용한 고처리량 장 통과 시간 측정법을 Danio rerio 유생에 적용하는 방법입니다. 이 기술은 위장 생물학 연구와 약물 효과 분석에 효율적인 도구를 제공합니다.

애벌레 Zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정

더 많은 동영상 탐색