루프-중재 등온 증폭 (램프) 분석 결과 Bemisia tabaci 의 빠른 식별

이 방법은 베미시아 타바치, 전 세계 많은 국가에서 야채와 장식 작물의 생산에 영향을 미치는 침략곤충 해충의 식별을위한 빠르고 신뢰할 수있는 진단 도구를 제공합니다. 이 방법은 항구나 공항 과 같은 플랜트 수입 제품의 진입 지점에서 직접 현장에서 직접 수행할 수 있으며, 이로 인해 거래 네트워크를 따라 베미시아 타바치의 분산을 줄일 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 먼저 가위를 사용하여 8튜브 LAMP 스트립을 2개의 4튜브 LAMP 스트립으로 자릅니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜 중 하나를 그림에 설명한 계획에 따라 튜브에 레이블을 지정합니다. 그 후, 80 반응에 대한 충분한 B.tabaci LAMP 반응 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음 마스터 믹스의 22.5 마이크로리터를 4관 램프 스트립의 각 튜브에 분배합니다.

원심분리기를 펄스하고 얼음 위에 놓습니다. 빠르게 소용돌이와 펄스 원심 분리기 B.tabaci 램프 PAC. 그런 다음 각 4튜브 LAMP 스트립에 PAC로 표시된 튜브에 2.5 마이크로리터를 추가합니다.

다음으로 뚜껑을 닫고 즉시 사용할 수 있는 B.tabaci LAMP 키트 유닛을 섭씨 영하 20도에 보관합니다. DNA 추출을 시작하려면 멸균 이쑤시개를 사용하여 곤충 표본을 DNA 추출 용액 30마이크로리터로 0.5밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 이송합니다. 그런 다음 300 rpm으로 설정된 ThermoMixer에서 섭씨 95도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.

샘플을 간략하게 소용돌이 및 펄스 원심분리합니다. 즉시 사용할 수 있는 B.tabaci LAMP 키트 중 하나를 해동합니다. 그런 다음 키트를 빠르게 소용돌이쳐 원심 분리합니다.

S-one 및 S-2 튜브에 2.5 마이크로리터의 샘플 DNA 추출물을 추가합니다. 그런 다음 NAC 튜브에 순수 알칼리성 DNA 추출 용액의 2.5 마이크로리터를 추가합니다. 키트를 소용돌이 및 펄스 원심분리 한 후 LAMP 분석 장치에 키트를 삽입하고 60 분 동안 섭씨 65도에서 이더스 말 DNA 증폭 분석을 수행합니다.

같은 실행에서, 먼저 섭씨 98도에 키트를 가열하고 섭씨 75도까지 냉각하여 DNA 증폭 제품의 용융 온도 분석을 수행합니다. 자동화된 LAMP 유효성 검사 응용 프로그램을 사용하여 LAMP 판독을 검증합니다. 먼저 보고서 생성 버튼을 클릭하기 전에 대상 종과 테스트된 샘플 수를 정의합니다.

마지막으로 판독을 유효성 검사 응용 프로그램의 적절한 입력 필드로 전송합니다. 데이터를 입력한 직후 유효성 검사 결과가 표시됩니다. 이 프로토콜에서, 일반 스위스 수입 제어 과정에서 가로채는 B.tabaci 곤충 표본은 LAMP 분석기를 통해 분석되었다.

총 80개의 표본분석에서 75개의 표본이 진정한 긍정으로 정확하게 확인되었으며, 2개의 표본은 진정한 네거티브로 정확하게 확인되었다. 그러나 세 개의 표본은 거짓 네거티브였으며 B.tabaci가 아닌 것으로 잘못 식별되었습니다. 취리히 공항의 공장 건강 검사관에 의해 현장에서 조사된 결과, 그 결과, 그 결과, 현장에서 조사되었다.

대표적인 결과에서, 샘플 1과 2는 약 82°C의 예상 어닐링 온도에서 약 30분 후에 DNA 증폭을 통해 B.tabaci로 정확하게 확인되었다. 개발 후, 이 방법은 베미시아 타바치의 빠르고 수행하기 쉬운 현장 식별을위한 길을 열었습니다. 이 프로토콜은 실험실 교육이 제한된 식물 건강 검사관에 의해 수행 될 수있는 방식으로 설계되었습니다.

식물 수입 제품에 대한 스위스 진입 지점에서 방법의 성공적인 현장 검증 후, 방법은 다른 식물 병원균뿐만 아니라, 필요한 경우, 다른 인간 또는 수의학 병원체에 적응 할 수있다.