Name: Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 학습하세요 면역형광 공초점 현미경법을 이용한 HSV-1 감염 시 ICP0 단백질의 핵-세포질 이동 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 단백질 운반 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 금융 지원을 해 서울에 게 수 여 하는 NIH 보조금 (RO1AI118992) 감사 합니다. 우리는 기술 지원에 대 한 웨인 주립 대학에서 현미경, 이미징 & Cytometry 리소스 (MICR) 핵심 시설을 감사합니다.

1. 셀 시드 및 바이러스 감염
<ol><li>바이러스 감염 하기 전에 20-24 h, 5 x 104 인간 배아 폐 (헬) 섬유 아 세포 세포 또는 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 소 보충 4 잘 11 m m 정열된 슬라이드에 검사할 수 다른 셀의 씨앗 혈 청 (FBS))입니다. 5% 이산화탄소 (CO2) 37 ° C에 세포를 품 어. 참고: 각 잘 있어야 한다 70-80% 셀 confluency 감염의 시간에서.</li>
	<li>다음 날, 성장 매체를 제거 하 고 4-10 pfu/셀의 범위에 매체-199에 바이러스가 세포를 감염. 1 시간 37 ° c.에 대 한 바이러스에 감염 된 세포를 품 어 인큐베이션 기간 동안 슬라이드를 떨고 계속.</li>
	<li>1 h 부 화 후 중간-199를 제거 하 고 보충 성장 매체. 참고:이 단계에서 또는 바이러스 성 흡수 전에 다른 감염 단계 방해 하는 마약을 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>다양 한 길이의 감염 기간에 대 한 5% CO2 와 37 ° C에서 바이러스에 감염 된 세포를 품 어.</li>
</ol>2. 고정 및 Permeabilization
<ol><li>적절 한 감염 시 신속 하 게 3 회 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 감염 된 세포를 세척 하 고 200 μ 4 %paraformaldehyde 갓 PBS에서 준비의 추가. 셀 paraformaldehyde 셀에 각 잘 해결 하기 위해 상 온에서 8-10 분을 품 어.</li>
	<li>Paraformaldehyde 발음 하 고 3 번에 대 한 PBS의 200 μ와 우물을 씻어. 완전히 3rd 세척 후 PBS 발음.</li>
	<li>5-10 분에 대 한 세포를 permeabilize 잘 각에 0.2% 비 이온 계면 활성 제의 100 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>비 이온 계면 활성 제를 발음 하 고 3 번에 대 한 PBS의 200 μ와 우물을 씻어.</li>
</ol>3. immunofluorescent 얼룩
<ol><li>완전히 PBS 발음에 각 잘 차단 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 PBS에서 5% 말 혈 청)의 200 μ를 추가 하 고 1 시간을 위한 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 (토끼 안티 ICP0 polyclonal 항 체12)의 실험적 결정된 농도 블로킹 버퍼에 추가 하 고 기본 항 체 또는 4 ° C에서 2 시간에 대 한 실 온에서 하룻밤 사이 품 어.</li>
	<li>블로킹 버퍼 3 번 10 분 부 화를 씻어. 알 렉 사 594 활용 된 염소 항 토끼 이차 항 체 (1:400 차단 버퍼에 희석)를 추가 하 고 슬라이드 1 시간 실 온에서 품 어. 다음 10 분 간격 3 시간 차단 버퍼와 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>마지막으로 잔여 BSA와 말 혈 청을 제거 하는 PBS 한번 슬라이드 세척.</li>
	<li>4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 슬라이드 마운트 coverslip 투명 매니큐어를 사용 하 여 함께 인감을 함께 antifade 장착 매체의 한 방울을 추가 합니다.</li>
</ol>4. confocal 영상
<ol><li>Confocal 현미경으로 설정 파장 590-650 nm에서 알 렉 사 594 및 410-520 nm DAPI. 1024 x 1024에서 이미지 형식과 8 높은 해상도 이미지의 선 평균을 선택 합니다.</li>
	<li>4 잘 슬라이드 confocal 현미경 아래에 각 잘 분석. 그림 1 과 그림 2에서 같이 100 X 목표 아래 대표 셀 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>많은 수의 셀을 계산, 40 X 목표 아래 연속 필드의 이미지 걸릴. 참고: 5-10 이미지를를 각 감염의 각 시간 지점에서 200 개 이상의 감염 된 세포를 축적 필요 합니다.</li>
	<li>각 실험에 비교할 수 모든 샘플 필요에 대 한 지속적인 confocal 매개 변수와 함께 사진을 찍으십시오.</li>
</ol>5. 핵 및 세포질 분포 분석
<ol><li>오픈 프로젝트 confocal 응용 프로그램 소프트웨어와 함께입니다. 세포 ICP0의 핵 및 세포질 배급에 대 한 표로 될 필요가 이미지를 선택 합니다.</li>
	<li>상단 메뉴에서 "수량" 탭을 클릭 하 고 도구 메뉴에서 "ROIs 정렬"을 선택 합니다.</li>
	<li>상단 메뉴에서 "선 그리기"를 선택 하 여 분석할 셀에서 세로 선을 그립니다. 참고: 히스토그램 ICP0와 DAPI 라인 형광 강도 보여주는 표시 됩니다. 히스토그램, 블루 라인 DAPI 픽셀 나타내고 빨간색 라인 ICP0 픽셀을 나타내는 반면 핵의 경계를 표시.</li>
	<li>
배경 얼룩을 바탕으로, 각 실험에서 ICP0 subcellular 분포 분석 ICP0 강도 대 한 일정 한 임계값을 설정 합니다.
	<ol>
<li>에 exemplified 그림 2, 빨간 신호에 평균 하는 경우 핵 지역에서 임계값 미만 이지만 파란색 경계를 넘어 임계값 이상, 주로 세포질에 있는 빨간 신호를 분류.</li>
		<li>빨간 신호가 핵에 걸쳐 고 파란색 신호의 경계를 넘어 임계값 이상 경우 핵 및 세포질 지역화로 빨간 신호 그룹.</li>
		<li>만약 빨간 신호는 핵에서 임계값 이상 이지만 평균 아래 파란색 신호의 경계 밖에 서, 핵 지역화로 빨간 신호를 그룹화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다른 감염 시간과 시간 (그림 3)에 따라 ICP0 움직임을 설명 하기 위해 막대 그래프에 플롯에서 각 샘플에서 200 개 이상의 감염 된 세포를 평면.</li>
</ol>

<ol><li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhitley%2C+R+%22Human+Herpesviruses%3A+Biology%2C+Therapy%2C+and+Immunoprophylaxis%22">Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis</a>. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields%27+Virology%22">Fields' Virology</a>. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).</li>
<li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li>
<li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li>
<li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+location+of+PML%2C+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family%2C+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li>
<li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li>
<li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tale+of+Two+PMLs%3A+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li>
<li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+ICP0%3A+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li>
<li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li>
<li>Gu, H. <a target="_blank" href="https://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/fvl-2018-0038">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li>
<li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378(2016).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜은 HSV-1 ICP0의 핵-세포질 전 공부에 사용 되었습니다. ICP0는 HSV-1 감염 (그림 1) 동안 subcellular 밀매를 겪 습. 아마, ICP0 다른 위치에서 다른 기능을 수행 하기 위해 다양 한 셀 통로와 상호 작용 합니다. 미세 조정 인간의 호스트13투쟁에서의 여러 기능을 ICP0 수 있습니다. 그러나, ICP0 공간 일시적인 방식 다중 기능을 조정 하는 방법 안 되어 잘 공부 했다. 위에서 설명한 형광 현미경 검사 법 프로토콜, 우리 ICP0 핵-세포질 전 좌의 분자 기준 분석을 시작 했다. 지금, 우리 ICP0의 C-터미널 식별이 전 좌에 대 한 중요 한 필수 요소로 35 아미노산. C-말단의 부재, ICP0은 내 감염 (그림 3)에 걸쳐 핵 제 지. 우리는 또한 발견 하는 ICP0 E3 리가 종속 핵 보유 힘은 핵-하-세포질 지연 전 U2OS ...

포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1) 다양 한 포진 labialis, 생식 기 포진, 각 막 실질 염, 뇌염 등 심각한 herpetic 질병에 약한 원인. 일단 감염, 바이러스는 중추 신경에 평생 잠복 감염을 설정 합니다. 때때로, 바이러스 열 병, 스트레스, 면역 억제1, 재발 성 헤 르 페 스 감염에 지도 등 다양 한 이유로 다시 활성화 될 수 있습니다. 감염 된 세포 단백질 0 (ICP0)는 주요 바이러스 레 귤 레이 터 모두 용균성 및 잠재 HSV-1 감염에 대 한 중요 한 이다. 그것은 다운스트림 바이러스 유전자를 통해 counteracting 호스트 내장/타고 난 항 바이러스 방어2,3transactivates. ICP0는 E3 유비퀴틴 리가 활동을, 프로테아좀 종속 저하3에 대 한 몇 가지 셀 요소를 대상으로 하고있다. 그것은 또한 그들의 활동을 규제 하 고 이후에 호스트 항 바이러스 제한3오프셋 다양 한 셀 통로와 상호 작용 합니다. ICP0는 감염 진행3,,45다른 subcellular 구획에서 찾을 알려져 있다. 단백질은 잔류물 500 5066에 위치한 리/아르기닌 풍부한 핵 지 방화 신호 (NLS) 있다. 초기 HSV-1 감염에 드 노 보 합성 시 ICP0 핵으로 즉시 가져옵니다. 처음 감지 동적 핵에 구조 나 핵 도메인 10 (ND10)7. 유비퀴틴 E3 리가 활동 ICP0 ND10 주최자 단백질, promyelocytic 백혈병 (PML) 단백질 및 단백질 얼룩 덜 룩 한 100 kDa (Sp100)8,,910의 저하를 트리거합니다. 주최자 단백질의 손실 후에 ND10 핵 시체는 분산 하 고 ICP0 전체 핵4,11을 채우기 위해 확산.
흥미롭게도, 바이러스 성 DNA 복제의 개시 후 ICP0는 핵에서 사라집니다. 그것은 전적으로 HSV-1 감염4,12에 핵-세포질 전 좌의 발생을 제안 하는 세포질에서 발견 된다. DNA 복제의 요구는 HSV-1 ICP04,12의 세포질 전 촉진에 늦게 바이러스 성 protein(s)의 잠재적인 참여를 의미 합니다. 분명히 공간 일시적인 패션에 다양 한 세포질 통로에 그것의 상호 작용을 조절 하는 ICP0 힘을 실어주 고 ICP0 감염 시 다른 구획 사이에서 매매 하 고 따라서 좌표 벌금의 여러 기능 사이의 균형 조정 용균성 및 잠재 HSV-1 감염13. 더 나은 이해 ICP0 많은 용균성 감염에 걸쳐 ICP0 기능 도메인의 조정, 하 우리는 신중 하 게 동적 ICP0 전12의 분자 기초 해 부. 기계 연구 이전에 보고 된12를 실시, 우리 confocal 현미경 다른 감염 상태에서 ICP0 subcellular 지 방화를 시각화 하는 immunofluorescent 착 방법을 적용 했습니다. 우리는 또한 핵 및 세포질 배급 ICP0의 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하는 양적 프로토콜을 개발 했습니다. HSV-1에 감염 된 세포의 인구는 감염 단계에 걸쳐 표로 하 고 다른 생 화 확 적인 치료12에서 ICP0 운동의 동향을 분석 했다. 여기 우리는 상세한 프로토콜 감염 HSV-1에에서는 문서 ICP0 전 좌를 설명합니다. 이 메서드는 핵 및 세포질 전 라이브 이미징 기법으로 인해 적용 되지 않습니다 때 라이브 이미징 하는 대신 봉사 할 수 있는 다른 바이러스 또는 세포질 단백질에 대 한 공부를 하는 일반적인 방법으로 채택 될 수 있는 제안 방법, 신호 강도, 또는 단백질 풍부 라벨 같은 문제.

<table><tbody><tr><td>Cells and Viruses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td><td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td><td></td><td>HEL 세포는 10% FBS</td></tr><tr><td>HSV-1 바이러스 스톡(균주 F)</td>이 보충된 DMEM에서 성장했습니다<td>. Dr. Bernard Roizman Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199 (10x)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4- well 11 mm staggered slide</td><td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; 30-149H-BLACK</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드 용액(w/v) 메탄올 무함유</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher 시약</td><td>BP151-1C0</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 Abumin (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>호스 혈청</td><td>시그마</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td><td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>피셔 바이오레시약</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>차단 완충액 (1 % BSA 및 5 % 말 혈청이 함유 된 PBS)</td> <td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabiit Anti-ICP0 항체</td><td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PML (PG-M3) - 마우스 단일 클론 IgG</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>SC-966</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티 토끼 IgG</td><td>invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td><td>invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal 소프트웨어</td><td>Leica LAS X 어플리케이션 제품군</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 소프트웨어</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>주문 코드 51026282</td><td></td></tr></tbody></table>

immunofluorescent confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1)의 감염 된 세포 단백질 0 (ICP0) 링 타입 E3 유비퀴틴 리가 포함 하는 즉시 초기 단백질이입니다. 그것은 호스트 제한 요인 및 후속 바이러스 유전자 활성화 proteasomal 저하에 대 한 책임입니다. ICP0 정식 핵 지 방화 순서를 (NLS)에 포함 되어 있습니다. 그것은 합성 드 노 보 직후 핵을 입력 하 고 핵에 주로 그 반대로 호스트 방어 기능을 실행. 그러나, 나중에 감염, ICP0에서에서 발견 된다 전적으로 세포질, 핵-세포질 전 HSV-1 감염 시의 발생을 제안. 아마도 ICP0 전 다른 감염 단계에서의 subcellular 위치 그것의 기능을 조절 하는 ICP0 수 있습니다. 생물 학적 기능 및 규제 메커니즘 ICP0 핵-세포질 전 좌의 윤곽을 그리 다, 위해 우리는 HSV-1 감염 시 ICP0 매매 모니터링 하는 immunofluorescent 현미경 검사 법 방법 수정. 이 프로토콜 immunofluorescent 얼룩, confocal 현미경 이미징, 그리고 핵 및 세포질 배급 분석을 포함 한다. 이 프로토콜의 목표는 정상 상태 confocal 이미지가 용균성 감염에 걸쳐 ICP0 운동의 양적 문서로 시간 코스에 적응. 우리가 제안 하는이 방법은 양적 라이브 이미징 기술을 사용 하지 않고도 다른 바이러스 또는 세포질 단백질의 핵 및 세포질 지역화 분석에 일반화 될 수 있다.

분자 및 ICP0 HSV-1 감염 시 밀매의 생물 학적 기능을 이해 하기 우리는 다른 감염 단계에서 ICP0 subcellular 분포를 분석 하는 immunofluorescent 현미경 메서드를 사용 합니다. 그림 1 에서는 감염 진행으로 독특한 ICP0 지역화와 함께 대표적인 셀. ICP0의 핵-세포질 전 계량, 감염 된 세포를 세 그룹으로 분류 하 여 핵 상대적인 ICP0 분포 분석: 핵 지역화, 세포질 지역화, 그리고 핵 및 세포질 지역화 ( 그림 2)입니다. ICP0 감염 시 매매에 필요한 요소를 이해 하려면 다른 감염 단계에서 야생 유형 또는 돌연변이 HSV-1에 ICP0 움직임 추적 합니다. 그림 3 에 감염의 다른 시간 지점에서 ICP0의 subcellular 배포에 대 한 집계 결과의 예가 나와 ...

ICP0는 HSV-1 감염 중 핵-세포질 전을 겪 습. 이 이벤트의 분자 메커니즘은 알 수 없습니다. 여기는 HSV-1 감염, 양적 분석 ICP0 전 미래 기계 론 적인 연구에 대 한 기초를 낳는 ICP0 운동 척도를 도구로 confocal 현미경의 사용에 설명 합니다.

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

이 방법은 빛 화상 진찰을 사용할 수 없는 시스템에서 핵과 세포질 전좌에 관하여 단백질 인신 매매 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광 화상 진찰을 포함하지 않고 측두단백질 운동의 연구를 위한 일반적인 프로토콜로 적용될 수 있다는 것입니다. 바이러스 감염 전 20~24시간 전에 5배 10번~ 4개의 인간 배아 폐 또는 HEL 섬유 폭발 세포가 잘 4개의 우물에 11mm 비틀거리고 성장 배지가 37°C에서 이산화탄소를 5%로 하였다.배양 배지가 유출되는 것을 피하면서 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 슬라이드를 철저히 흔들어야 합니다. 다음 날, 슈퍼네이츠를 교체하여 70~80%의 수렴 문화를 199로, 셀당 410개의 플라크 형성 유닛을 포함하고, 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들어 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 수퍼네티를 신선한 성장 배지로 대체하고 적절한 실험 감염 기간 동안 인큐베이터로 세포를 반환한다.바이러스에 감염된 세포의 면역 형광 염색의 경우 PBS로 세포를 세 번 빠르게 씻으실 수 있습니다. 그 다음으로 PBS에서 4%의 파라포름알데히드의 200마이크로리터에서 8분에서 10분 배양이 이어졌습니다. 고정의 끝에서, 세척 당 PBS의 200 마이크로 리터로 세포를 세 번 세척하고, 5 ~ 10 분 동안 잘 100 마이크로 리터의 0.2 %의 비 이온 계면 활성제로 세포를 퍼메아빌화.입증된 대로 PBS에서 투과된 세포를 세 번 세척하고 실온에서 1시간 배양을 위해 각 웰에 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 2시간 실온 인큐베이션을 위해 각 웰에 관심 있는 1차 항체의 적절한 농도를 추가한다. 인큐베이션의 끝에서, 신선한 차단 버퍼에 3, 10 분 세척과 모든 언바운드 기본 항체를 제거하고, 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 배양에 대한 각 우물에 적절한 이차 항체를 추가합니다.인큐베이션이 끝나면, 입증된 대로 블로킹 버퍼에서 세포를 세 번 씻고, PBS에서 한 번 세척한 다음, DAPI로 보충된 안티페이드 장착 배지 1방울을 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 슬라이드 위에 덮개 슬립을 놓고 투명한 매니큐어로 커버 슬로프를 밀봉합니다. 커버 슬립을 장착하는 동안 부드러운 압력을 가하면 과도한 장착 매체가 제거되어 고품질 이미지를 획득하는 데 도움이 됩니다.표지된 감염된 세포의 공초점 이미징의 경우 적절한 이차 항체 및 DAPI 파장을 선택하고 이미지 포맷을 평균 8개의 라인으로 1, 024 x 1, 024 픽셀로 설정합니다. 그런 다음 100x 목표 아래 4웰 슬라이드에서 각 우물을 이미지합니다. 셀의 큰 숫자를 계산하기 위해, 40배 목표 하에서 동일한 웰의 연속 필드에서 5~10개의 이미지를 얻을 수 있습니다.ICP0의 핵 및 세포질 분포를 분석하려면 공초점 응용 소프트웨어에서 프로젝트를 열고 이미지를 선택합니다. 수량 탭을 열고 도구 메뉴에서 관심 영역 정렬을 선택합니다. 그리기 선을 선택하고 분석할 셀 전체에 세로선을 그립니다.히스토그램은 관심 있는 단백질과 DAPI 모두에 대한 선을 따라 형광 강도를 나타내는 것으로 나타납니다. 배경 염색에 기초하여, 각 실험에서 단백질의 세포 분포의 분석을 위해 관심 있는 단백질의 강도에 대한 일정한 임계값을 설정한다. 단백질 신호가 평균적으로 핵 영역에서 임계값 미만이지만 DAPI 경계를 넘어 임계값을 초과하는 경우 단백질 신호를 주로 세포질 내에 있는 것으로 분류한다.단백질 신호가 핵 전체의 임계값 을 초과하고 DAPI 신호의 경계를 넘어서면 단백질 신호를 핵 플러스 세포질 국소화로 그룹화한다. 단백질 신호가 핵의 임계값 이상인 경우, 평균적으로 DAPI 신호군의 경계 외부임계값 이하인 경우 단백질 신호는 핵 국소화로서 이다. 마지막으로, 각 샘플에서 200개 이상의 감염된 세포를 상이한 감염 시점에서 표로 꾸미고, 시간이 지남에 따라 관심 있는 단백질의 움직임을 설명하기 위해 바 그래프로 데이터를 플롯한다.입증 된 바와 같이,이 방법은 관심있는 단백질의 핵 세포질 전좌의 분석을 용이하게한다. 예를 들어, 감염된 세포 단백질 제로, 또는 ICP0 세포 세포 분포는 바이러스 감염이 진행됨에 따라 변화한다. 감염 시 ICP0 인신매매에 필요한 요소를 이해하기 위해 ICP0 운동은 다른 감염 단계에서 야생 유형 및 돌연변이 유형 헤르페스 심플렉스 바이러스 1-감염된 세포에서 추적될 수 있으며, 감염의 다른 시간 지점에서 ICP0의 하위 세포 분포의 평가를 허용합니다.바이러스가 세포에 동등한 접근을 가지고 있고 감염 진행이 바이러스 사이 및 내의 비교되도록 바이러스 제목에 따라 감염의 복합성을 정상화하기 위하여 단층 배양을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 발달 후에, 이 기술은 세포 인구 내의 관심 있는 단백질의 시간적 세포 소소화를 공부하여 단백질 운동을 탐구하는 생물학과 세포 바이러스학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

temporal-analysis-nuclear-to-cytoplasmic-translocation-herpes-simplex

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

프로토콜은 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 대기 시간과 재활 성화를 단순 공부하는 효율적이고 재현성 모델 시스템을 설명합니다. 분석은 동질적인 교감 신경 세포 배양을 고용하고 RNA 간섭 및 재조합 단백질의 표현을 포함한 다양한 도구를 사용하여 바이러스 신경 세포 상호 작용의 분자 해부을 허용합니다.

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

이 비디오는 단순 포진 바이러스-1 감염에서 감염된 세포 단백질 0, ICP0 이동을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. Post-de novo synthesis, ICP0는 핵으로 전위되었다가 나중에 감염이 진행되는 동안 세포질로 이동합니다. 면역형광 현미경 검사는 단백질의 세포 내 국소화를 밝히고 분석하여 감염 단계 전반에 걸친 단백질의 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.

감염된 세포의 바이러스 단백질 국소화를 위한 면역형광 기술

alphaherpes 바이러스 감염의 라이브 셀 이미징 직접 수송 및 간 스프레드의 동적 이벤트 분석을 할 수 있습니다. 여기, 우리는 차 신경의 감염시 바이러스 어셈블리의 시각화를 촉진하기 위해 형광 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 변종을 활용 방법론을 제시한다.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

피부는 인간 병원체인 단순 헤르페스 바이러스 1형(HSV-1)의 표적 조직 중 하나입니다. HSV-1의 조직 침입 경로를 조사하기 위해 피부의 가장 바깥쪽 층을 나타내는 쥐 표피 시트의 생체 외 감염 모델을 구축했습니다.

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

우리는 현탁액 또는 부착물에서 서정적으로 감염된 인간 세포 내의 다중 헤르페스 바이러스 RNA를 시각화하기 위해 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뉴클레오세포질을 생성하는 형광의 정량화를 포함하고 면역형광(IF)을 가진 숙주 및 바이러스 성 단백질의 동시 시각화를 위해 확장될 수 있다.

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

면역형광 염색 중 티라마이드 신호 증폭은 HSV-1 감염 후 ZBP1 유발 괴사 동안 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 민감한 검출을 가능하게 합니다.

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

학습하세요 면역형광 공초점 현미경법을 이용한 HSV-1 감염 시 ICP0 단백질의 핵-세포질 이동 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 단백질 운반 메커니즘 연구에 활용됩니다.

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

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