Name: 개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 형광 표지와 타임랩스 이미징을 이용하여 발달 중인 병아리 시각 중뇌에서 접선 이동하는 세포의 행동을 관찰하는 방법을. 이 기술은 개별 및 집단 세포 이동을 장기간 추적하여 신경 발달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 수에 의해 지원 되었다 Y.W.에 15 K 06740

1입니다. 비켜에 Electroporation
<ol><li>높은 농도에 형광 라벨에 대 한 식 플라스 미드 DNA를 준비 합니다. 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 음이온 교환 열을 사용 하 여 알칼리 성 세포의 용 해 방법으로 200ml의 세균성 문화에서 DNA를 분리. 각 4 µ g / µ L의 최종 농도에 pCAGGS-mCherryNuc pCAGGS-EGFP 믹스. 참고: 내 무료 플라스 미드 DNA 정화 electroporation에 대 한 선호 있을 수 있습니다.</li>
	<li>가로 70% 상대 습도에서 38 ° C에 비옥한 계란을 품 어.</li>
	<li>2.5 일 후 18 게이지 바늘 20 mL 주사기를 사용 하 여 계란의 지적된 측면에서 배 젖 (달걀 흰 자 위)의 5 mL을 제거 하 고 테이프와 바늘 구멍을 봉인.</li>
	<li>곡선가 위 직경에서 2cm 구멍을 열고 stereomicroscope (햄버거와 해밀턴9의 단계 17) 아래 태아의 발달 단계를 확인 하는 달걀 껍질의 상단을 잘라. 다시 테이프로 구멍을 봉인. 참고:이 단계는 E2.5 E3.0 동안 언제 든 지 수행할 수 있습니다. 1.3 및 1.4 단계 상위 셸에 성장 배아와 혈관의 꽉 첨부 파일을 피하기 위해 계란에서 태아의 수준 낮은.</li>
	<li>E5.5까지 부 화를 계속 합니다.</li>
	<li>Electroporation, 전에 언급 한 플라스 미드 DNA의 착 색 된 빠른 그린 (25 mg/mL)의 0.5 µ L 10 mL 버퍼링 압력가 인산 염의 염 분 (PBS) 페니실린 (100 단위/mL)와 스 (100 μ g/mL), 및 micropipettes에서 만든 10 µ L를 준비 유리 모 세관 튜브 micropipette 프로세서를 사용 하 여입니다. 주입에 대 한 DNA의 양에 따라 적절 한 크기를 만들기 위해 micropipette의 원심 끝을 잘라.</li>
	<li>가 위로 다시 구멍 직경에서 2.5 c m 스테레오 현미경 안정적으로 달걀을 설정 하 밀봉된 최고 껍질을 잘라. 달걀으로 PBS의 몇 방울을 추가 합니다. 두 개의 미세 집게를 사용 하 여 출혈 없이 태아를 덮고 allantoic 멤브레인을 벗기다. 태아의 머리에서 있는 amnion를 제거 합니다.</li>
	<li>microspatula와 머리를 선회 하는 동안 주사 0.1-1 μ는 micropipette를 사용 하 여 왼쪽된 눈 tectum의 심 실 구멍으로 색된 DNA의 흡입 관에 연결 된. 참고: DNA 주입 양의 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 집중된 DNA 솔루션 싱크 하 고 심 실 벽을 따라 연결 해야 합니다.</li>
	<li>광섬유 tectumis의 대상 영역 (그림 1단계 1) 사이 배치 되도록 forcep 형 전극 (3 m m 평방 전극 7 mm 거리)의 한 쌍을 놓습니다. 참고: DNA는 양극 쪽으로 electroporated.</li>
	<li>30 V의 사전 펄스, 1 ms 5 ms 간격 및 V 6의 4 개의 연속적인 펄스, 펄스 발생기를 사용 하 여 10 ms 간격 5 ms를 부과 합니다. 참고: 전자 상태 크기와 전극의 거리에 따라 달라 집니다. 효율적인 transfection를 달성 하기 위해 충분히 강한 해야 하지만 충분히 겸손 하 게 대상 조직의 정상적인 발전을 보장 해야 합니다.</li>
	<li>테이프로 구멍을 밀봉 하 고 부 화를 계속 합니다. 플라스틱 접시에는 치 간 브러시로 배 젖 제거를 PBS 전극을 담근 다. 1.7-1.11 각 계란에 대 한 반복 합니다.</li>
</ol>2. 플랫-마운트 문화에 셀 삽입
<ol><li>플랫-마운트 문화 전에 1 일 코팅된 셀 문화 삽입 준비. 10 cm 세포 배양 접시에 압력가 증류수에 셀 문화 삽입 일부 플 로트. 8 µ g/mL laminin의 80 µ g/mL 폴 리-L-리 신 커버를 삽입 하 고 37 ° C에서 셀 문화 CO2 배양 기에서 떠다니는 삽입을 떠나 하룻밤을 솔루션을 로드 합니다. 참고: 다음 날, 코팅된 삽입 저장 될 수 있다 4 ° c.에</li>
	<li>E7.0에서 문화의 날, 삽입에서 laminin-폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 유리 하단 접시에 (그림 12 단계) 문화 매체 (60% 감소 된 혈 청 매체, 20 %F12, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 10의 1.1 mL 가득 삽입 장소 % 여 자가 혈 청, 50 단위/mL 페니실린, 50 μ g/mL 스). 37 ° c.에 셀 문화 공동2 인큐베이터에 접시를 유지 참고: 매체는 변화 없이 3 일 동안 문화 기간 동안 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>문화 설치를 준비 합니다. 40% O2 , 5% CO2 (가스 컨트롤러) 38 ° C (온도 컨트롤러)에서 가스 흐름을 거꾸로 confocal 현미경에 습기가 챔버 단위를 설정 합니다.</li>
	<li>가 위로 태아의 머리를 잘라. 차가운 행 크 스 균형 소금물 (HBSS) 6 cm 세포 문화 접시에서에 있는 집게와 함께 밖으로 머리를 꼬집어.</li>
	<li>Electroporated 광섬유 tectum 두 미세 집게를 사용 하 여 격리 합니다. 플라스틱 스 포 이트와 tectum 차가운 HBSS 가득 다른 접시에 전송 합니다. 절단에 대 한 접시로 검은 실리콘 기반 concaved 유리 접시를 사용 합니다.</li>
	<li>형광 실체 현미경 아래 라벨의 위치를 확인 하십시오. Tectal 조직 지역을 포위 하는 라벨 microsurgical 칼으로 잘라. 있는지 확인 조직의 방향 tectum (앞쪽-후부, 복 부 등)에서.</li>
	<li>플라스틱 스 포 이트로 레이블이 지정 된 조직 삽입 전송 피아 측 삽입에 연결 되어 있도록. 원하는 방향으로 tectal 조직을 제거 초과 HBSS (그림 12 단계).</li>
	<li>2.4-2.7 같은 다른 조직 준비 하기 위하여 삽입을 반복 합니다. 거꾸로 confocal 현미경 (그림 13 단계)에서 prewarmed 약 실에 있는 접시를 놓습니다.</li>
</ol>3. 시간 경과 영상
<ol><li>형광 라벨을 확인 하 고 거꾸로 confocal 현미경 현미경 분야 초점. 레이저 confocal 장치를 시작 하 고 샘플링 confocal 스캔 방향 및 필드에 X와 y 축을 따라 조직의 위치를 조정 하려면 보십시오. 사용 하 여 10 배 또는 침수 기름 없이 20 X 렌즈.</li>
	<li>스캔 크기를 선택 합니다 (예를 들어, 512 x 512 dpi). 간격 및 z 축 따라 confocal 스캔의 전체 범위를 결정 합니다. 100 µ m 범위에 대 한 5 또는 10 µ m 간격을 가져가 라. Confocal 영상 및 전체 기간 (예: 10 분 간격 이상 48 h) 이미징의 시간 간격을 결정 합니다. 참고: 레이저 phototoxicity을 피하기 위해, 높은 스캔 크기는 긴 z 범위에 대 한 짧은 z 간격 또는 긴 이미징 기간 동안 짧은 시간 간격에 검색 금지 합니다. 예를 들어 높은 스캔 크기 (예: 1024 x 1024 dpi)를 적용할 때 z 축 따라 검사의 수를 감소.</li>
	<li>Confocal 실행의 매개 변수에서 설명된 3.2 프로그램 및 이미징 시작 설정 합니다.</li>
	<li>이미징, 후 모든 시간 지점에서 미세 초점 조정 z 스택 이미지를 제공 하는 다른 z 축에서 confocal 이미지를 결합.</li>
	<li>다른 시간 지점에서 z-스택 이미지를 추가 하 고 시간 경과 영화 AVI 형태로 구성.</li>
</ol>

<ol><li>Marín, O., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+the+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell migration in the forebrain.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).</li>
<li>Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%3A+Observations+based+on+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging.</a> Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).</li>
<li>Martini, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136, 41-50 (2009).</li>
<li>Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cortical+interneuron+migration+by+neurotrophins+and+PI3-kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling.</a> Development. 129, 3147-3160 (2002).</li>
<li>Watanabe, Y., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+cell+migration+during+layer+formation+of+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum.</a> Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).</li>
<li>Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRP1-mediated+Sema3A+signals+coordinate+laminar+formation+in+the+developing+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum.</a> Development. 141, 3572-3582 (2014).</li>
<li>Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersing+movement+of+neuronal+tangential+migration+in+superficial+layers+of+the+developing+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum.</a> Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Cordelières, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+tracking+and+analysis+in+phase-contrast+videos+%28iTrack4U%29%3A+development+of+Java+software+based+on+combined+mean-shift+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes.</a> PLOS One. 8, e81266(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

위에서 설명한 프로토콜 표면 레이어6,8셀 마이그레이션 감지 최적화 되어 있습니다. 그것은 이동 electroporation (E4.5에 E5.5)의 타이밍 및 문화의 발병 및 이미징 (E6.0에 E7.0) 그냥 중간 계층 마이그레이션 스트림영화 ( 5)6,7, 탐지를 위해 적용 가능한.
제시 하는 절차는 셀 라벨 electroporation 비켜에서평면 산 문화 및 시간 경과 confocal 영상 (그림 1)에 의해 구성 됩니다. 우선, 그것은 필수 문화 조건 vivo에서로 일반적으로 성장 하 고 건강 한 조직을 유지 최적화 ...

세포 이동의 연구 라이브 이미징의 발전 기법으로 진행 되었습니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화 접시 또는 vivo에서 레이블이 지정 된 셀의 시간적 움직임을 기록할 수 있습니다. 신경 개발 연구에서 세포를 마이그레이션하거나 elongating axons의 형태학 변화 되었습니다 분석 했습니다 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여. 효과적인 이미징에 대 한 형광 셀 라벨 및 조직 준비, 실험 및 분석의 목적에 따라 적당 한 방법을 적용 하는 필수적 이다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션1,2,3등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하 일반적으로 사용 되었습니다. 조각 문화 시스템은 접선 셀 마이그레이션4,5, 검색에 사용 하지만 셀 슬라이스 섹션에 수직을 분산 하는 경우에 방향 분석에 적합 하지 않습니다.
광섬유 tectum는 배아 개발 하는 동안 레이디얼 및 접선 셀 마이그레이션에 의해 형성 된 다층 구조의 구성 됩니다. Tectal 계층 형성 된 심 실 영역에서 postmitotic 신경 선구자 세포의 방사형 마이그레이션에 주로 의존 하 고 층에서 그들의 최종 목적지는 심 실 지역6에 그들의 출생 날짜와 상관 관계가. 접선 이동에 관해서는 우리는 이전 마이그레이션 개발 병아리 광섬유 tectum에 중간과 표면 층에서 두 개의 스트림을 보고. E6-E8 중 중간 층에서 긴 주요 프로세스와 얇은 후행 프로세스 양극 세포 dorso ventrally7실행 tectal 원심 성 축 삭의 축 삭 fasciculus 따라 dorsally 또는 ventrally 마이그레이션합니다. 이 axophilic 마이그레이션 후 셀 깊은 층에 있는 다 극 신경 세포로 분화. E7-E14 중 표면 층에서 마이그레이션 셀 가로로 여러 방향8로 분기 주요 프로세스 및 분산형 개혁에 의해 분산. 마이그레이션, 분산 후 후자의 셀 결국 다양 한 형태학의 피상적인 뉴런으로 분화. 두 경우 모두, 평면 산 문화 pial 표면에 병렬 셀 운동 관찰 효율적입니다.
여기, 선물이 접선 셀 마이그레이션 개발 병아리 광섬유 tectum7,8에서 시각화 하 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해 한 마이그레이션 셀 이동 및 마이그레이션 방향 감지가 있습니다. 이 방법의 목표는 장기와 수평 평면에 있는 셀의 그룹의 집단 행동에 두 개별 셀 동작의 탐지를 촉진.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus EF</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740422.5</td><td>내독소 프리 플라스미드 DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>20ml 주사기</td><td>TERUMO</td><td>SS-20ESZ</td><td></td></tr><tr><td>18 게이지 바늘</td><td>TERUMO</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>Wako</td><td>061-00031</td><td></td></tr><tr><td>100x 페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Narishige</td><td>G-1</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인서트</td><td>Millipore</td><td>Millicell CM-ORG</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td></td><td>SIGMA L2020</td><td>배양 인서트</td></tr><tr><td>코팅 폴리-L-라이신</td><td>펩타이드 연구소</td><td>3075</td><td>배양 코팅 인서트</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>Matsunami</td><td>D11130H</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>12483</td><td>배양</td></tr><tr><td>배지 병아리 혈청</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>10xHBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>microsurgical knife</td><td>Surgical Specialties Collaboration</td><td>72-1501</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>curved scissors</td><td>AS ONE</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 프로세서</td>, <td>SUTTER INSTRUMENT</td><td>P97/IVF</td><td></td></tr><tr><td>겸자형 전극</td>, <td>BEX</td><td>LF646P3x3</td><td></td></tr>, <tr><td>펄스 발생기</td>, <td>BEX</td><td>CUY21EX</td><td>electroporator,</td></tr><tr><td>형광 입체 현미경</td>, <td>Leica</td><td>MZ16F</td><td></td></tr><tr><td>, 도립 형광 현미경</td>, <td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>가스 컨트롤러</td><td>Tokken</td><td>MIGM/OL-2</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Tokai Hit</td><td>MI-IBC</td><td></td></tr><tr><td>레이저 컨포칼 유닛</td><td>올림푸스</td><td>FV300</td><td></td></tr></tbody></table>

개발 병아리 광섬유 tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

시간 경과 영상 마이그레이션 셀 동작을 분석 하는 강력한 방법입니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화에 레이블이 지정 된 세포의 움직임을 기록할 수 있습니다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하에 주로 사용 됩니다. 그러나, 슬라이스 문화 방법 접선 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 수직 셀 마이그레이션 분석 하에서 제한 된 정보를 얻을 수 있습니다. 여기, 우리는 시각화 개발 병아리 광섬유 tectum에 접선 셀 마이그레이션 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜을 제시. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서 문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해의 조합 수평 평면에 마이그레이션 세포 운동의 감지 수 있습니다. 또한, 우리의 방법은 개별 셀 동작 및 장기적으로 세포의 그룹의 집단 행동의 탐지를 촉진 한다. 이 방법은 잠재적으로 형광 표시 된 마이크로-구조, axonal 신장 비 신경 조직의 신경 조직 또는 세포 치환 등의 순차적 변화를 감지에 적용할 수 있습니다.

그림 2 녹음의 개시 후 경과 시간 (0, 9, 18, 27 h)에서 플랫-마운트 문화에 시각화 된 표면 접선 마이그레이션을 보여준다. 영화 1 28 h 50 분 동안 10 분 간격의 시간 경과 영화입니다. 프레임은 레이블 없는 공간 (그림 3A) 프레임의 레이블된 왼쪽 모서리에서 마이그레이션 세포에 초점을 맞추고 선택 됩니다. 마이그레이션 세포 (GFP, 영화 1위 왼쪽된 패널)의 질량 움직임 및 그들의 핵 (mCherry 엔 유씨, 오른쪽 상단 패널) 병합 된 영화 (하단 패널, 영화 1) 관찰 될 수 있다. 셀 이동 방향은 모든 방향 (영화 <s...

형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

이 방법은 신경 세포 이동의 기계장치와 같은 발달 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장기적으로 개인 및 집단 세포 이동을 감지할 수 있다는 것입니다. 알칼리성 리시스 방법에 의해 세균 배양 200밀리리터를 분리한 후, 각각의 최종 농도가 마이크로리터당 4마이크로그램인 두 플라스미드를 혼합한다.비옥한 닭고기 알을 상대 습도 70%에서 섭씨 38도에서 수평으로 배양합니다. 2일 반 후에는 18게이지 바늘이 달린 20밀리리터 주사기를 사용하여 달걀의 뾰족한 면에서 5밀리리터의 알부민을 제거하십시오. 테이프로 구멍을 밀봉합니다.다음으로 곡선 가위를 사용하여 달걀 껍질의 상단을 자르고 직경 2센티미터의 구멍을 엽니다. 스테레오 현미경에서, 배아의 발달 단계를 확인. 테이프로 이 더 큰 구멍을 밀봉합니다.E5.5까지 섭씨 38도, 상대 습도 70%로 인큐베이션을 계속합니다. 전기화 전에, 빠른 녹색의 0.5 마이크로 리터로 착색 언급 된 플라스미드 DNA의 10 마이크로 리터를 준비합니다. 또한 페니실린 밀리리터당 100유닛을 함유한 오토클레이브 PBS 10밀리리터와 연쇄상 구균의 밀리리터당 100마이크로그램을 준비합니다.마이크로피펫 프로세서를 사용하여 유리 모세관 튜브로 만든 마이크로 피펫을 준비합니다. 주입될 DNA의 양을 위해 마이크로피펫의 탈실 팁을 적절한 모공 크기로 자른다. 가위를 사용하여 밀봉 된 상단 껍질을 잘라 직경2 센티미터 반의 구멍을 다시 열고 스테레오 현미경 아래에 달걀을 비설시놓습니다.준비된 PBS 용액 몇 방울을 계란에 보관하십시오. 두 개의 미세 한 집게를 사용 하 여, 배아를 덮고 있는 알란토믹 멤브레인을 벗겨, 출혈을 일으키지 않도록 주의. 그런 다음 배아의 머리에서 양수절단을 제거합니다.현미경으로 머리를 돌리는 동안 흡입 튜브에 연결된 마이크로 파이프를 사용하여 왼쪽 광학 텍텀의 심실 구멍에 착색 된 DNA의 0.1과 마이크로 리터를 주입하십시오. 시공간의 대상 영역에 한 쌍의 집게 형 전극을 놓습니다. 펄스 생성기를 사용하여 5밀리초 간격으로 1밀리초 동안 30볼트의 프리 펄스를 충전하고, 10밀리초 간격으로 5밀리초 동안 6볼트의 후속 펄스를 충전합니다.이 모든 후, 테이프로 구멍을 밀봉하고 섭씨 38도및 상대 습도 70 %에서 인큐베이팅을 계속합니다. 전극을 PBS로 채워진 플라스틱 접시에 담그고 치과 간 브러시를 사용하여 알부민을 제거합니다. 각 계란에 대한 전기 기화에 초기 껍질 절단에서 과정을 반복합니다.플랫 마운트 배양 하루 전에 10센티미터 세포 배양 접시에 증류수에 오토클레이브를 추가하여 코딩된 세포 배양 삽입을 준비하기 시작했습니다. 물에 일부 세포 배양 삽입을 플로트. 밀리리터 라미닌 당 8 마이크로 그램을 포함하는 용액에서, 그리고 밀리리터 폴리 L 당 80 마이크로 그램, 삽입을 커버해야합니다.세포 배양 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. E7.0에서 문화의 날에, 삽입에서 라미닌 및 폴리 l-리신 용액을 제거. 그런 다음 인서트를 배양 배지의 1.1 밀리리터로 채워진 유리 바닥 접시로 옮는다.37°C의 세포 배양 이산화탄소 인큐베이터로 접시를 옮기. 40%의 산소와 5%의 이산화탄소, 그리고 섭씨 38도의 온도로 역구된 공초점 현미경에 습한 챔버 유닛을 설정합니다. 삽입에 조직 견본을 준비하는 것을 시작하려면, 얼음 감기 HBSS를 포함하는 6 센티미터 세포 배양 접시로 배아 머리를 꼬집어 집게를 이용하십시오.두 개의 미세 한 집게를 사용하여 전기 화 된 광학 텍텀을 분리하십시오. 그런 다음 플라스틱 드롭퍼를 사용하여 검은 색 실리콘을 기반으로 얼음처럼 차가운 HBSS로 채워진 오목한 유리 접시로 옮춥습니다. 형광 입체 현미경에서 라벨의 위치를 확인합니다.마이크로 외과 칼을 사용하여, 텍텀에 있는 조직의 방향을 주의하는 동안 라벨을 둘러싼 tectal 조직을 잘라냅니다. 그런 다음 플라스틱 드롭퍼를 사용하여 표지된 조직을 인서치로 전송하여 핀 측이 삽입에 부착되도록 합니다. 텍탈 조직을 원하는 방향으로 놓고 과도한 HBSS를 제거합니다.동일한 삽입을 위한 다른 조직 샘플에 대한 조직 준비 과정을 반복한다. 그런 다음 반전된 공초점 현미경의 미리 형성된 챔버에 접시를 놓습니다. 반전된 공초점 현미경을 사용하여 형광 라벨링을 확인하고 현미경 필드에 초점을 맞춥니다.레이저 공초점 장치를 시작합니다. 현장에서 x 및 y 축을 따라 조직의 방향과 위치를 조정하기 위해 공초점 스캔을 샘플링합니다. 다음으로 스캔 크기를 선택합니다.z축을 따라 공초점 스캔의 간격 과 총 범위를 결정합니다. 100 마이크로미터 범위에 대해 5 또는 10 마이크로미터의 간격을 취하십시오. 공초점 이미징의 시간 간격과 전체 이미징 지속 시간을 선택합니다.공초점 실행 프로그램의 매개 변수를 설정한 후 이미징을 시작합니다. 이미징이 완료되면 다른 C 축의 공초점 이미지를 결합하여 매 지점에서 최종 초점 조정을 통해 z 스택 이미지를 생성합니다. 그런 다음 서로 다른 시간에 Z 스택 이미지를 추가하여 시간 경과 동영상을 생성합니다.이 연구에서는, 세포 이동은 오보의 전기화, 평평한 마운트 세포 배양 및 시간 경과 공초점 이미징을 통해 피상층에서 검출됩니다. 접선 이동 세포와 광학 텍텀의 피상적 층에서 핵은 여기서 제로 시간, 9시간, 18시간 및 기록 개시 후 27시간 후에 볼 수 있다. 28 시간 50 분 기간 동안 10 분 간격의 시간 경과 영화는, 이주 세포와 그들의 핵의 질량 움직임을 보여줍니다.병합된 동영상은 마이그레이션 셀의 질량 이동을 명확하게 보여줍니다. 세포 이동의 방향성은 표지된 중앙에서 모든 방향으로 분산 세포에 초점을 맞추어 검사될 수 있다. 핵 무브먼트의 선명한 이미지는 입자 추적 플러그인을 사용하여 핵 마이그레이션을 자동으로 추적할 수 있게 해줍니다.접선 이동의 궤적 궤적의 시간적 변화는 시각화될 수 있으며 분산 마이그레이션이 전방향임을 증명할 수 있습니다. 배율이 높은 이미지는 5분 간격으로 촬영할 수 있습니다. 선행 과정, 후행 공정 및 핵의 순차적 형태학적 변화를 통해 개별 세포 거동을 조사한다.이 절차에 따라 조명 작업의 레이블을 수행할 수 있습니다. Aksum 지침의 메커니즘과 같은 추가 질문에 답하기 위해.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

출처: Williams, A. L., et al. 실시간 발달을 시각화하기 위한 다광자 타임랩스 이미징: 제브라피시 배아에서 이동하는 신경 능선 세포의 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 제브라피시 배아의 신경능선 세포의 이동을 고해상도로 실시간으로 시각화하기 위한 다광자 타임 랩스 이미징 프로토콜을 보여줍니다.

다광자 타임랩스 이미징을 사용한 제브라피시 배아의 신경능선세포 이동 시각화

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

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레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

병아리 섬모 신경질 (CG)는 부교감 신경계의 일부입니다. 병아리 CG 뉴런의 신경 배양신경 근육 상호 작용의 연구에서 효과적인 세포 모델 것으로 나타났다. 우리는 병아리 배아에서 CG 뉴런의 해부, 해리 및 체외 문화에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

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이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

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여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

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