Name: 생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 생체 외 유하 조건에서 단핵구 아군집의 이동을 공초점 형광 현미경으로 분석하는 방법을. 이 기술은 백혈구 부착과 혈관내피 세포 횡단 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리 감사 박사 폴 Bradfield 원고 읽기 및 피드백. A. S.는 선생님 쥘 가시 자선 해외 신뢰 등록에서 재정 지원을 받은

인간의 재료 자원 봉사 기증자의 및 임상 연구에 스위스 윤리 위원회에 통지 해준 동의 함께 사용 되었다.
1. 격리와 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)
<ol><li>HUVEC 절연을 시작 하기 전에 코팅 솔루션의 5 mL는 T75 플라스 크 (0.1 mg/mL 콜라겐 G 및 인산 버퍼 pH 7.4에서 염 분 PBS에 0.2% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분을 추가 합니다.</li>
	<li>PBS 가진 코드를 청소, 살 균 압축으로 닦 고 살 균 20 cm 배양 접시에. 살 균가 위 코드의 끝을 잘라.</li>
	<li>하나의 큰 정 맥과 두 개의 작은 동맥을 식별 합니다. 부드럽게 코드 끝에 정 맥 사지에 그것에 연결 된 3 방향 자 지와 함께 한 캐 뉼 러를 삽입 합니다.</li>
	<li>코드 및 정 맥 연결 와이어의 길이와 단단히 조입니다.</li>
	<li>100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 250 ng/mL 코드의 혈관을 씻어 암포 B 포함 된 RPMI 매체의 20 mL로 두 번 코드 perfuse 이 프로세스 하얀 하 고 명확 하 게 코드의 모양을 만든다. 한쪽 끝에 주사기는 RPMI 수집 하 여 콜라 추가 하기 전에 정 맥을 비어 있습니다.</li>
	<li>1 mg/mL 콜라 형식의 12 mL와 함께 정 맥 perfuse 나 (0.22 μ m 필터).</li>
	<li>닫기 코드에서 자 지 그리고 12 분 동안 37 ° C에서 코드를 품 어.</li>
	<li>부드럽게 마사지 정 맥 루멘에서 내 피 세포를 분리 하려면 코드.</li>
	<li>받아 30 mL 50 mL 주사기 10% 태아 종 아리 혈 청에 포함 된 RPMI의 고 탯의 한쪽 끝을 연결 합니다.</li>
	<li>탯의 다른 쪽 끝에는 빈 50 mL 주사기를 연결</li>
	<li>자 지를 열고 상호로 다른 쪽 끝에서 수집 하는 동안 한쪽에서 정 맥을 perfuse. 참고: 수집 된 서 스 펜 션 내 피 세포를 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>5 분 동안 200 x g 에 세포 현 탁 액이 원심</li>
	<li><li><li></li><li><li><li><li><li></li><li><ol><li><li><li></li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li><li></li><li><li></li></ol><ol><li><li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li><li><li></li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li><li><li> </li><li><ol><li></li><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li></li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li> </li><li></li><li><li><li></ol></li><li></li><li><li><li><li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li> </li><li> </li><li><li></li><li><li><li><li><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58509/58509eq1.jpg"> </li><li><ol><li><li><li></ol></li><li></ol><ol><li></li><li><li> </li><li><li><li><li><li> </li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li><li></ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

여기, 우리가 어떻게 monocyte 모집단 염증이 내 피 단층을 통해 transmigrate의 연구를 자세히 설명 하는 방법 보고. 토론된 방법 단계 대조 현미경 검사 법, 또한 흐름3,,1119monocyte 모집을 공부 하는 데 사용 되는 대신 confocal 현미경 검사 법을 사용 합니다. 시간 경과 영상에 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여의 주요 장점 중 하나는 환생 및 monocytes의 강한 접착 사이 명확 하 게 구별할 수 있는 능력입니다. 단계 대조 현미경-기반 방법은 강력한도 하지만, 전문을 transmigrated 세포와 강하게 부착 세포를 혼합을 피하기 위해 필요 합니다. 이 경우에, 하나는 monocyte 모집 캐스케이드의이 두 가지 상태 간의 명확한 차이 만들기 위해 분석에 대 한 엄격한 기준을 설정 해야 합니다. 또한, 그것...

Monocytes의 병원 체, 손상 된 조직, 신생, 고 암1,2,3 포함 하 여 많은 질병의 병 태 생리학 정리 싸움을 위해 필수적 이다 타고 난 면역 phagocytic 구성 요소 구성 . Monocytes는 골 수 유래 세포 혈액에 순환 하지만 특정 분자 메커니즘을 통해 주변 조직에 염증의 사이트에 채용 될 수 있는 다른 유형의 모집단의 구성 이다. Monocytes, 백혈구에 관해서는 모집 캐스케이드 일반적으로 다른 단계 캡처, 압 연, 크롤링, 체포, transendothelial 마이그레이션 (환생) 및 혈관 벽 (지하실 멤브레인와 벽화를 통해 마이그레이션 등 연루 셀)4. 다음이 단계는 주로 ligands selectin 같은 백혈구에 풀, 당단백질 ligands, 발산, 세포 및 접합 접착 분자, 그리고 그들의 수용 체와 같은 내 피 luminal 표면에 염증 유발 분자를 포함 그리고 integrins입니다. 밀매 경로 중 하나는 내 피 세포 접합 (paracellular) 나 내 피 세포 체 (transcellular)를 통해 백혈구에 의해 내 피 장벽5를 사용할 수 있습니다. Monocytes transcellular 경로 통해 transmigrate를 역사적으로 문서화 되어, 하는 동안 그들의 철새 통로의 잠재적인 차이점 monocytes 균질 세포 인구 이라고 여겨진다 이상으로 제안 되었습니다. 그것은 이제 분명 monocyte 다양성 각 그들의 차이 공통점에 의해 정의 될 수 있습니다, 그들의 독특한 넘쳐 흐름에 관하여3,6폭포 되고있다. 따라서, monocyte 모집단 사이 차별 명확 하 게 하기 위해 시각화 하는 중요 한 고 형 채용 중이 다른 모집단의 각 동작을 처리.
인간 monocytes, 돼지, 쥐, 마우스 특정 관찰 기능 및 특정 철새 동작7,,89phenotypic 모집단으로 세분화 했다. 예를 들어 인간 monocytes는 CD16, Fc 감마 수용 체 III CD14, 세균성 lipopolysaccharide에 대 한 coreceptor의 그들의 표면 식에 따라 3 개의 하위 집합으로 나눌 수 있습니다. 인간 monocyte 모집단 클래식 CD14 포함+CD16-, CD14 중간+CD16+ 및 비 고전 CD14어둡게CD16+ 세포6,9. 클래식 CD14+CD16- monocytes는 주로 염증 성 표시 했다 반면 CD16 수영장+ monocytes 총칭 TIE2 표현과 proangiogenic 함수10선물을 발견 했다. 일관 되 게, 인간의 종양 괴 사 등 염증 성 cytokines와 내 피 성장 세포 자극 인자 (TNF) α 또는 인터 루 킨 (일리노이-1) 베타 (기존의 염증)은 고전 CD14의 완전 한 신규 모집을 실행 하는 충분 한+CD16 - monocytes입니다. 그러나, 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 TNFα (신생 요소 기반 염증)의 동시 작업은는 CD16의 환생을 자극 하는 데 필요한+ monocytes3의 proangiogenic 풀. 역사적으로, 정적 조건, 병렬 플레이트 흐름 챔버 및 µ-슬라이드 흐름 챔버 전통적인 Transwell 시스템 양적 분석 한 시간에서 시험관에11에 한 백혈구 인구의 모집 하는 데 사용 되었습니다. ,,1213. 이러한 프로토콜을 검증 하는 동안 여러 monocyte 모집단의 동시 분석을 허용 하는 더 강력한 방법 여겨질 것입니다 더 많은 통찰력. 이러한 방법론 여러 상호 작용 및 각 각각의 서로 다른 주파수를 담당 하 고 또한 각 monocyte 정의 하는 모집 계곡에 대 한 유사성과 특이성의 기계적 이해를 제공 해야 합니다. 하위 집합입니다.
여기, 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 동시에 공부 될 다른 monocyte 모집단의 철새 계곡 수 있는 흐름 아래 monocyte 모집의 시간 경과 영상에 따라 방법 제시. 이 방법은 hemodynamics 순환 후 모 세관 venules에 monocytes의 vivo에서 백혈구 신규 모집의 주요 위치 뿐 아니라 내 피 세포 염증, 모방 하는 특정 중요 한 기능을 통합 합니다. 제안 된 방법은 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 탯에서 고립의 잘 설립 된 프로토콜을 통해 생성 되는 사용 합니다. 이 임상 자원 또한 탯 줄 정 맥 으로부터 격리 될 수 있는 내 피 세포의 적당 한 수익률을 제공 하는 반면 생물 학적 부산물로 쉽게 사용할 수 있는 이점이 있다. 우리는 또한 사용 형광 염료와 면역 형광 monocyte 위치 (abluminal 대 luminal) 명확 하 게 정의에 confocal 현미경 검사 법 및 다른 세포질 구성 요소 구분을 시간이 지남에. 여기에 제시 된 프로토콜을 동시에 측정 monocyte 모집단의 환생 레벨 개발 되었습니다. 또한, 그것은 다른 biomarkers 및 라벨의 사용 하 여이 방법론 공부 다른 백혈구 모집단 및 채용 프로세스를 확장할 수 있습니다 주목 해야한다.

<table><tbody><tr><td>조직 배양 플라스크 75 cm2</td><td>TPP</td><td>90076</td><td>Routine culture of isolated HUVEC</td></tr><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes 15 mL</td><td>TPP</td><td>191015</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes 50 mL</td><td>TPP</td><td>191050</td><td></td></tr><tr><td>Collagen G</td><td>Biochrom</td><td>L 7213</td><td>세포 배양 코팅용 플라스크</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1393</td><td>세포 배양 플라스크</td></tr><tr><td>Dulbecco의 코팅용 s 인산염 완충 식염수(MgCl2 및 CaCl2)</td> <td>제외)Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(MgCl2 및 CaCl2)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체</td><td>시그마-알드리치</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>3방향 스톱콕</td><td>BIO-RAD</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 10,000 &mu;/mL 스트렙토마이신 10,000 &mu; g/mL fungizone 25 &mu;/mL</td><td>AMIMED</td><td>4-02F00-H</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 1</td><td>Worthington</td><td>LS004216</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td><td>GIBCO 22340020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 알부민 분획 V</td><td>ThermoFisher</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보조제, 150 mg</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3149RT</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>시그마-알드리치</td><td>H6909</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A 4544</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 이나트륨 염 이수화물 C10H14N2Na2O8 &middot; 2H2O</td><td>APPLICHEM</td><td>A2937.0500</td><td></td></tr><tr><td>CD144 (VE-Cadherin), 인간 재조합 클론: REA199, FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-100-713</td><td>AB_2655150</td></tr><tr><td>CD31-PE 항체, 인간 재조합 클론: REA730, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-807</td><td></td></tr><tr><td>AB_2657280 Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-107-016</td><td>AB_2653263</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Plus</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide I Luer</td><td>IBIDI</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td> <td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF &알파;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 VEGFA</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>NE-1000 프로그래밍 가능한 주사기 펌프</td><td>KF 기술</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-519</td><td></td></tr><tr><td>AB_2655051 Pan Monocyte Isolation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-106-762</td><td>AB_2655403</td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td><td>ThermoFisher</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>IBIDI</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>엘보 루어 커넥터</td><td>IBIDI</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>암 루어 잠금 커플러</td><td>IBIDI</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>루어 잠금 커넥터 암</td><td>IBIDI</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>인라인 루어 주입 포트</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ar1 컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 대물</td>렌즈 <td>Nikon</td><td>40x 0.6 CFI ELWD S 평면 Fluor WD:3.6-2.8mm 보정 0-2mm</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 흐름 아래 monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

타겟된 주변 조직에 혈액에서 monocytes의 모집 조직 부상, 종양 개발 및 자가 면역 질환 염증 과정에 중대 하다. 이것은 그들의 접착 및 transendothelial 마이그레이션 (환생) 뒤에 기본 영향을 받는 조직으로 활성화 된 내 피 세포의 표면에 luminal 무료 흐름에서 캡처의 과정을 통해 촉진 된다. 그러나, monocyte 모집단의 특혜와 맞는 채용을 지 원하는 메커니즘은 아직 완전히 이해. 따라서, 다른 monocyte 모집단 동시에 시각화 하 고 흐름에서 측정의 채용을 허용 하는 방법을 개발 했습니다. 시간 경과 confocal 영상에 따라이 메서드는 부착 및 transmigrated monocytes 사이 명확한 구별에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리는이 메서드를 사용 하 수 있습니다 프로 신생 및 비 신생 monocytes 체 외의 모집 캐스케이드를 동시에 공부 하는 방법을 설명 합니다. 또한,이 메서드는 최대 3 개의 monocyte 인구의 신규 모집의 다른 단계를 공부 하 확장할 수 있습니다.

HUVEC 활성화 TNFα에 의해 유도 된의 상태 확인
염증 성 cytokine TNFα의 생물 활동 일괄 처리 및 냉동 녹고 사이클의 반복에 따라 달라질 수 있습니다. 그것은 TNFα 치료와 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 것이 중요입니다. 이 풀, ICAM-1 및 VCAM-115,16,17의 염증 유도 confluent HUVEC의 일부 샘플 병렬로 얼룩 수행 수 있습니다. TNFα 치료는 염증 스트레스 내 피 세포에 의해 표시 형태 변경 후 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 쉽고 간단한 방법. 그림 3에서 보듯이 HUVEC unstimu...

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

이 방법을 들어 염증 및 면역학 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들면, 백혈구 접착및 트랜스 내피 이동의 분자 기계장치는 무엇입니까. 이 기술의 주요 장점은 내피 단층층에 트랜스마이그레이션과 모노사이클을 강력하게 추가하는 것 사이의 무제한 사용 차별을 허용한다는 것입니다.이 방법은 흐름상단핵세포의 모집에 대한 정보를 제공하지만, T세포, B세포 또는 이의 소집단의 유도체와 같은 조혈 시스템의 다른 세포에도 적응될 수 있다. 세척 후 인간 배빌레 정맥 내피 세포 또는 HUVEC에 37도 의 마이크로리터 37도 M199 배지를 37°C의 마이크로몰라 CMFDA로 보충하여 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 10분간 라벨을 부착합니다. 인큐베이션이 끝나면 150마이크로리터의 완전한 M199 배지로 세포를 세척하고 150마이크로리터의 신선한 완전 M199 배지에서 30분 간 배양한다.그런 다음 상체를 적절한 실험 보충제를 함유한 완전한 M199 배지의 150 마이크로리터로 대체하고 6시간 동안 슬라이드 챔버 배양을 인큐베이터로 반환한다. 인간 PAN 단화 분리의 경우, PBS에서 갓 수집된 혈액 샘플을 1 대 1 비율로 보충하고 20 ml의 혈액 용액을 밀도 그라데이션 배지에 조심스럽게 층으로 희석하여 원심분리에 의한 밀도 그라데이션 분리를 위한 밀도 그라데이션 배지를 사용한다. 중간 말초 혈액 단핵 세포 혈소판을 1 밀리머 EDTA로 보충한 PBS 40ml를 포함하는 새로운 50ml 튜브로 수집하고 계산 후 추가 PBS-EDTA를 사용하여 최종 볼륨을 50ml로 가져와 제조업체의 지시에 따라 PAN 단핵 분리 키트로 단핵구를 분리합니다.그리고 EDTA의 흔적을 제거하기 위해 0.5%의 소세럼 알부민 또는 BSA로 보충된 M199 배지에서 세포를 세 번 세척한다. 단세포 절연의 품질은 강력한 트랜스마이그레이션 및 접착 결과를 보장하는 데 매우 중요합니다. 따라서 격리에 대한 제조업체의 권장 사항을 엄격히 따르는 것이 중요합니다.0.5%BSA로 보충된 신선한 M199 배지에서 ml 농도 당 6개의 단백구에 6회 10회에서 펠릿을 재연하고, 모집 분석당 마이크로센트리슈지 튜브당 200 마이크로리터 알리쿼트1개로 세포를 나눕니다. 그런 다음 유량 챔버에 주입하기 전에 20 분 동안 37도 섭씨에 세포를 놓습니다. 분석을 위한 유체 시스템을 준비하려면 먼저 8cm 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브의 한쪽 끝에 수컷 루어 커넥터를 삽입하고 다른 쪽 끝을 인라인 루어 주입 세트에 연결합니다.그런 다음 루어 커넥터를 40cm 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브 조각의 한쪽 끝에 연결합니다. 다음으로, 20mm 주사기는 1m 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브의 한쪽 끝에 있고 다른 쪽 끝에 수컷 루어 커넥터를 삽입합니다. 그런 다음 두 남성 루어 커넥터를 암컷 루어 잠금 커플러에 삽입하고 실리콘 튜브의 자유 끝을 섭씨 37도 M199 배지의 저수지에 0.5%BSA로 보충합니다.플런저를 철회하여 튜브를 유동 버퍼로 채우고 주사기 펌프의 주사기를 고정합니다. 그런 다음 펌프를 인출 모드로 설정하고 유량을 지정합니다. 슬라이드 챔버를 연결하려면 여성 루어 잠금 커플러 주위에 실리콘 튜브를 고정하고 커플러에서 두 루어 커넥터 남성을 분리하여 슬라이드의 저장소에 연결할 수 있습니다.기포는 이미지 품질을 방해할 뿐만 아니라 세포에 모세관 깎아지른 듯한 스트레스를 유발하여 세포 사멸을 유발합니다. 기포를 피하기 위해 루어를 저수지에 삽입하기 전에 튜브의 올바른 클램핑을 확인하십시오. 그런 다음 클램프를 제거하여 연결이 누출되지 않는지 확인하고 슬라이드를 현미경 아래에 배치합니다.흐름 하에서 단세포 모집의 화상 진찰을 위해, 밀가루 컨쥬게이징 된 안티 CD16 항체의 5 마이크로 리터와 실온에서 10 분 배양에 대한 각 알리인용 단핵 염료를 추가하고 간단한 원심분리로 세포를 수집합니다. 플로우 버퍼의 250 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 주사기 펌프를 시작합니다. 슬라이드의 한 챔버에 하나의 단핵 현탁액 30 마이크로 리터를 추가하고 공초점 현미경에 40X 목표를 선택합니다.적절한 형광 레이저를 활성화하고 표지된 단세포로 챔버를 사용하여 공초점 현미경의 획득 매개 변수를 설정하고, 다중 위치 공초점 이미징을 위해 반센티미터 반경 반반 내에 3개의 시야필드를 선택하고, Z 스택을 10~12마이크로미터 범위로 설정하고 시간 경과 획득을 1분마다 실행한다. 3분간의 이미징 후 인라인 루어 주입 포트를 통해 200마이크로리터의 단핵구를 주입하고 세포 상호 작용을 이미징하기 시작합니다. 적어도 30분 후에는 이미징과 흐름을 중지하고 튜브를 고정하여 슬라이드에서 분리할 수 있습니다.자극된 HUVECs를 통해 세포의 환원 율을 결정하기 위해, 이미지 J를 열고 각 분야에서 부착 된 단핵구의 총 수를 계산하여 평방 밀리미터당 셀 수를 결정합니다. 그런 다음 핵 주위의 블랙홀 영역의 존재에 의해 확인된 내피 세포 아래 기저 평면에 존재하는 변환된 단핵구의 수를 계산한다. 자극 후 HUVECs의 활성화 상태를 확인하는 간단한 방법은 염증 성 스트레스하에서 신장을 시각화하는 것입니다.시간 경과 공초점 이미징은 표현형을 평가할 수 있는 정평 평면에서 단핵구를 시각화할 수 있습니다. 이동 을 겪고 있는 이동 세포는 세포 간 세포-세포-세포 접합으로 이동한 후 정문 평면에서 사라지고 기저 평면에 다시 나타납니다. 시간이 지남에 따라 단세포 모집의 수량은 단일 세포 접착이 트랜스 마이그레이션 다음에 있음을 확인합니다.CD16 양성 단핵구의 환원율은 내피 세포가 TNF 알파로만 자극될 때 낮지만 내피 세포가 TNF 알파 및 혈관 내피 성장 인자 또는 VEGFA로 자극될 때 증가한다. TNF 알파 및 TNF 알파 플러스 VEGFA를 통한 HUVEC 자극은 CD14 음의 T, B 및 NK 세포에 대한 준수의 증가를 유도하며, CD14 양성 단핵구와 비교한다. 또한, HUVEC 자극은 T, B 및 NK 세포가 TNF 알파 또는 TNF 알파 플러스 VEGFA 자극 조건 하에서 마이그레이션하지 않기 때문에 단세포 집단의 환전을 유도한다.최적의 단세포 채용 분석서를 수행하려면 실험을 미리 계획하고 같은 날에 수행하는 것이 중요합니다. 그리고 세포를 정화할 때 현미경이 37도에 있는지 확인하여 실험 중에 세포를 다른 온도로 옮기지 않도록하십시오. 이 절차를 배우기 위하여는, HUVEC 사이토카인및 chemokine 발현의 프로파일링 과 같은 모든 방법 뿐 아니라 화학요법 연구 결과는 특정 단세포 집단의 환원 및 접착을 유지하는 분자 기계장치에 관하여 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 중간엽 줄기세포(MSC)가 effector T 세포 증식에 미치는 면역조절 영향을 조사하기 위한 시험관 내 분석을 보여줍니다. 이 분석에는 MSC와 PBMC를 공동 배양하여 단핵구 집단이 면역조절 표현형을 획득하도록 유도하여 인터루킨-10(IL-10)의 분비를 유도하는 것이 포함됩니다. 활성화된 CD4+ T 세포를 배양한 후, 유도된 단핵구는 T 세포 증식을 효과적으로 억제합니다.

백혈구 증식에 대한 단핵구의 면역조절 효과를 평가하기 위한 체외 분석

이 비디오는 백혈구 동원에 대한 기질 세포의 영향을 조사하는 방법을 보여줍니다. 평행 플레이트 유동 챔버 모델에서, 전염증성 사이토카인은 내피 세포에 의한 접착 수용체의 발현을 유도하여 호중구 모집 및 이동을 촉진합니다. 기질 세포와 내피 세포 사이의 누화는 내피 세포로의 호중구 모집을 감소시킵니다.

백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

흐름에서 백혈구를 모집 염증이 혈관 내피 세포의 기능은 중간 엽 기질 세포에 의해 조절된다. 우리는 흐름 호중구 모집을 평가하고 간엽 기질 세포가 이러한 과정을 조절하는 것을 재생 역할을 조사하는데 사용될 수있다 일차 인간 세포를 통합 두 시험 관내 모델을 설명한다.

흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

단핵구는 활성화될 때 해당작용 대사에 의존하는 인간 선천성 면역 체계의 필수 구성 요소입니다. 우리는 신선한 전혈에서 총 단핵구 및 단핵구 하위 집단에 의한 포도당 수송체 발현 및 포도당 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석 프로토콜을 설명합니다.

간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

우리 인간의 내 피 monolayers에 걸쳐 monocytes에 의해 환생 및 거품 세포로 그들의 후속 성숙 측정 프로토콜을 설명 합니다. 이 혈액이 경향이 향상 시킬 수 있는 요인을 평가 하 고 다른 질병 조건 가진 사람에서 격리 하는 monocytes의 atherogenic 속성을 평가 하기 위해 다양 한 메서드를 제공 합니다.

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

여기 선물이 monocyte 하위 집합 전체 혈액 cytometry에 의해 특성화에 대 한 프로토콜. 이 하위 게이트 그들의 표현의 표면 마커를 평가 하는 방법을 설명 하 고 (염증 성) M1 및 M2 마커 (염증)의 식 평가의 예를 포함 됩니다.

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

여기에서 우리는 마우스 모형에 있는 혈액 단핵구의 화학전술 활동을 정량화하고, 혈액 단핵구에 영양, 약리학 및 유전 내정간섭의 효력을 평가하고 혈액 단핵구 파생된 대식세포특성화하기 위하여 프로토콜을 제시합니다 단핵구 화학 유도제 단백질-1 (MCP-1)을 사용하여 마우스 모델 - 로드 지하 막 유래 젤 플러그.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

배우세요 생체 외 유하 조건에서 단핵구 아군집의 이동을 공초점 형광 현미경으로 분석하는 방법을. 이 기술은 백혈구 부착과 혈관내피 세포 횡단 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

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