Name: 여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 배우세요 설치류 두뇌 동시 크라이오섹셔닝 방법으로 면역조직화학 염색 변이성을 줄이고 연구 효율성을 높이세요. 이 기법은 여러 뇌를 하나의 블록에 결합하여 일관된 결과를 제공합니다.

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PCH 임무 지원 자금 지원이 원고에 보고 된 연구. 저자는 다니엘 그리피스 그림에 사용 되는 이미지를 복용 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

Megabrain 기술은 남성 성인 C57Bl6 마우스5, 청소년 Sprague-Dawley 쥐, 및 transcardially 다음 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 끼얹는다 했다 성인 Sprague-Dawley 쥐에서 hemisected 및 전체 두뇌를 사용 하 여 최적화 된 4% paraformaldehyde6으로. 유사한 결과 쥐와 쥐, 남녀 모두에서 그리고 다른 연령대의 다른 긴장에 수행할 수 있습니다. 이 원고에 대 한 데이터를 생성 하는 연구 청소년 Sprague-Dawley 쥐를 사용 하 고 아리조나 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 되었다 실험 동물 관리에 대 한 가이드 및 실험실 사용에 따라 치료를 받았다 동물7.
1입니다. Cryoprotection 끼얹는다 두뇌의
<ol><li>다음 성공적인 transcardial 관류6, 동물에서 전체 뇌6,8 을 수집 하 고 24 시간에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 25 mL 유리병에 배치 하 여 수정 후. 주의: Paraformaldehyde은 독성 조직 정착 제; 관심을가지고 처리 합니다. 농도 화학 증기 두건 안쪽 볼륨을 식별 하는 구체적으로 레이블이 지정 된 폐기물 컨테이너로 paraformaldehyde 전송 및 저장소 캐비닛 화학 안전 하거나 제대로 처분 될 때까지 화학 폐기물에 직원을 훈련 하는 다음.</li>
	<li>증기 두건에서 24 시간 경과한 후 주걱을 사용 하 여 4 %paraformaldehyde 머리를 제거 합니다. 뇌 (약 24 h) 유리병의 바닥에 싱크 될 때까지 1 x Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서 15% 자당 해결책의 약 20 mL의 유리병으로 두뇌를 전송 합니다.</li>
	<li>뇌 (약 24-48 h) 유리병의 바닥에 싱크 될 때까지, 1 x TBS에서 30% 자당 해결책의 약 20 mL의 유리병에 두뇌를 전송 합니다.</li>
</ol>2. 뇌 동결
<ol><li>드라이 아이스는 얼음 양동이에 침대에 500 mL 유리 비 커를 놓습니다. Isopentane (2 메 틸-부탄)의 300-400 mL 유리 비 커에 붓으십시오.</li>
	<li>-45 ° C와-50 ° C 사이 도달 isopentane의 온도가 밀접 하 게 모니터 하 고 그것을 유지 하는 절차를 통해 일정 한 온도계로이 온도 범위를 유지. 온도 판독 솔루션, 그리고 하단 또는 비 커의 측면을 감동 하는 동안 하지 중간에서 가져옵니다 확인 하십시오.</li>
	<li>벤치탑에 채우기 포함 형 일회용 (자료 목록 참조) 최적의 절삭 온도의 약 1/2 전체 (OCT; 참조 테이블의 자료) 화합물. OCT에서 아무 공기 방울 인지 확인 합니다. 어떤 기포 주걱 또는 바늘 제거 경우에.</li>
	<li>
주걱으로 30% 자당의 유리병에서 첫 번째 뇌를 제거 합니다. 이 시점에서, 하나는 두뇌 전체 또는 hemisect, 연구 설계에 따라 고정.
	<ol>
<li>Hemisected 두뇌 반구를 분리 하기 위하여 조직을 통해 깨끗 한 컷을 만들기 위해 새로운 면도날을 사용 합니다. 연구에 대 한 필요 하지 않은 경우이 단계에서 소 뇌 및 후 각 전구를 제거 합니다. 소 뇌 연구에 대 한 필요, 그것은 금형에서 똑바로 서에서 뇌를 돕기 위해 두뇌의 뒤 끝에 평면 영역을 잘라 좋습니다. 연구만 필요한 경우 지역화 된 지역에서 조직, 알려진된 좌표에 따라 뇌를 차단 하는 설치류 두뇌 매트릭스를 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두뇌 시스템 이름을 지정 하는 숫자를 제공 합니다. 그림 1과 같이 다이어그램을 그립니다. 첫 번째 뇌의 위치 2, 위치 1 두뇌 동결 된 방향의 빠른 식별에 도움을 빈 공간으로 두고 있는 Megabrain 형에 배치의 번호를 작성 합니다.</li>
	<li>위치 1에 배치 하는 두뇌를 데리 using 무딘 집게 또는 핀셋. 첫 번째 위쪽으로 향하게 잘라 면 뇌를 방향을 정하십시오. 그것은 의미 하지 독립적으로 때까지 그것의 위치를 조정 하는 핀셋을 사용 하 여 적절 한 위치에 OCT로 뇌에 낮은.</li>
	<li>2.3-2.5 위치 3-10에에서 동결을 나머지 두뇌/반구에 대 한 단계를 반복 합니다. 두뇌/반구 대칭 레이아웃에 배치 하지 마십시오.</li>
	<li>Megabrain 금형에서 모든 9 머리를 검토 합니다. 두뇌를 독립적으로 서는, 일단 바르고 올바르게 지향 oct ( 그림 2B에서 같이), 더 많은 10 월 금형에 (때까지 추가 두뇌 위에 덮여 있다). 다시, OCT에서 볼 수 없는 기포 인지 확인 합니다.</li>
	<li>집게는 집게 할 하지 될 부분에 빠져들 OCT (그림 3A) 보장 형의 모서리를 사용 합니다. Isopentane (-45 ° C-50 ° C ~)으로 금형을 낮은 주의 형 수준을 유지 하 되 되도록 바닥의 세 번째 금형 빠져들. 잡고 여기 표면 및 조직 (그림 3B)에서 상승 하는 OCT에서 모든 거품을 허용 하도록.</li>
	<li>30 후 s, 낮은 isopentane는 Megabrain를 떠나 집게에서 방출에 전체 금형 빠져들 적어도 3 분 (그림 3C). 그래서 두뇌 유지 직 립 하 고 동일한 금형 수준 유지 되도록 (그림 3D).</li>
	<li>3 분 후 사용 10 월 냉동, 포함 된 몰드를 제거 하는 집게는 isopentane에서 두뇌 (그림 3E)를 포함합니다.</li>
	<li>즉시, 금형 및 그 내용을 알루미늄 호 일에 포장 및 동물 숫자 또는 Megabrain 식별 레이블. 직물을 녹고 방지 하려면 가능한 한 아껴 언된 Megabrain을 터치 합니다.</li>
	<li>이 Megabrain 이제는-20 ° C 냉동 고로 전송 하 고 24 h의 최소 저장 수 있습니다. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고는 Megabrain cryosectioning 수행 될 때까지 냉동 저장 될 수 있다.</li>
</ol>3. 준비 하 고 있는 Megabrain는 Cryostat에 단면에 대 한
<ol><li>-19 ° c는 cryostat의 캐비닛 온도 설정 계속 하기 전에이 온도 도달할 다는 것을 확인 하십시오. 단면, 전체 캐비닛 온도-18 ℃와-20 ° C 사이 유지 하는 것을 확인합니다</li>
	<li>-20 ° C 냉동 고에서는 Megabrain를가지고 고는 cryostat에 배치. 또한,는 cryostat에 적절 한 크기 차원 및 두 개의 얇은 끝된 페인트 용의 척을 놓습니다. Cryostat는 cryostat의 온도에 서 적어도 15 분 동안에 Megabrain와는 척을 남겨 주세요.</li>
	<li>Megabrain 식별 번호와 슬라이드 번호 슬라이드를 레이블을 적절 하 게. 이러한 슬라이드 슬라이드 따뜻한 (35-45 ° C)에 누워.</li>
	<li>알루미늄 호 일에서 Megabrain 풀 면도날을 사용 하 여 수직 형 (그림 4A)에서 10 월의 블록의 쉬운 제거를 허용 하도록 금형의 모서리를 잘라.</li>
	<li>10 월의 얇은 층 (대략 3 밀리미터 두꺼운)는 척에 분배.</li>
	<li>신속 하 게, 손가락 및 OCT 사이의 최소한의 접촉으로 원하는 방향에 척에는 Megabrain를 놓습니다. 셉 해빙을 최소화 하기 위해이 단계에 대 한 사용할 수 있습니다. 섹션, 두고는 Megabrain를 시작 하기 전에 완전히 동결 OCT 있도록 15-20 분 동안 cryostat에서 척을 탑재.</li>
	<li>일단 10 월의 기본 레이어, 냉동는 Megabrain의 측의 주위에 10 월 2 m m 두꺼운 레이어를 적용 하 고 물림 쇠에 측면에서 실행이. 안전 물림 쇠를 Megabrain 수 있습니다. 다시, 계속 하기 전에 동결 OCT 있도록 15-20 분 동안 cryostat에 탑재 Megabrain 척을 둡니다.</li>
	<li>면도날을 사용 하 여 모든 초과 10 월 척 (그림 4B)의 하단 또는 측면에서 제거.</li>
</ol>4입니다. Cryosectioning는 Megabrain
<ol><li>시작 하기 전에, 최소한 20 mL 1 x PBS를 포함 하는 비 커 액세스할 수 인지 확인 합니다.</li>
	<li>척, Megabrain, cryostat (그림 4B)에 척 머리에 탑재 위치.</li>
	<li>원하는 두께에서 잘라 cryostat을 설정 합니다. 현재 방법론은 10 µ m 50 µ m 섹션에 대해 최적화 되었습니다.</li>
	<li>트림 OCT 및 조직 조직 컬렉션 (그림 4C)에 대 한 원하는 뇌 영역에 도달 하는 데 필요한.</li>
	<li>때 조직 수집, 안티 롤 접시까지 단계에 달려있다 낮은 고 cryostat 단일 섹션을 준비. 천천히 들어 sectioned Megabrain 안티 롤 플레이트에 연결 되어 있지와 무대 그림 4D가 되지 않습니다 조심 안티 롤 접시에서).</li>
	<li>부드럽게 페인트 용을 사용 하 여 (그림 5A) cryostat 무대에 평평 거짓말까지 Megabrain 섹션을 풀 다. (필요한 경우, 개최 OCT 롤링을 방지 하기 위해 페인트 용을 사용 하 여 평면).</li>
	<li>따뜻한 슬라이드에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드, 슬라이드에 충실 하려면 섹션을 허용 하는 무대에서 Megabrain 섹션, 레이블 면 가져가.</li>
	<li>신속 하 게 슬라이드에 각 조직 섹션을 1 x PBS의 한 방울을 적용 하 고이 닦 았을 그들이 평면 때까지 건조를 허용 하지 않습니다 (단계 4.9 참조).</li>
	<li>1 x PBS에 잘 끝된 붓을 사용 하 여 조직에 어떤 거품 밖으로 솔 질 하 고 그래서 (그림 5B) 슬라이드에 평평 거짓말 조직 전개. 알아서 하지 뇌 섹션의 위치를 변경 하 고 따라서 다른 조직 섹션에 상대적 위치를 잃게. 눈물을 피하기 위해 주의 조직을 조작 합니다. 계속 슬라이드의 가장자리 떨어져 뇌 섹션 주변 공간은 coverslip 및 일부 얼룩 프로토콜에 PAP 펜 응용 프로그램에 필요한.</li>
	<li>따뜻한 고 건조 45 분 커버 조직에 정착에서 먼지를 방지 하기 위해 필요에 따라 슬라이드 뒤에 슬라이드를 놓습니다. 일단 건조, 추가 사용까지-80 ° c에 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 공개 있다.

그것은 고려 되어야 한다이 절차 동안에 그는 Megabrain와 그 주변 온도 지속적으로 모니터링 해야 녹고 고 다시 조직의 동결을 방지 하기 위해. 뇌만 제거할 수 있습니다-20 ° C 냉동 고에서 최대를 3 번으로 때마다 그것을 건드리지 cryostat 따뜻한 변동 온도, 조직에에서 녹아서 왼쪽과 refreezes, 텍스처 및 비정상적인 조직의 무결성10같은 젤리를 일으키는. 따라서, 그것은 Megabrain를 모두 한 번에 잘라 최적입니다.
조직 고정 및 cryoprotection을 얼음 결정 형성을 최소화, 줄이고 외부 미생물 성장, 효소 반응, 조직의 무결성10을 보존 함으로써 중지이 프로토콜의 핵심 부분입니다. 두뇌 자당과 cryoprotected 하지 않습니다, 다음 조직 내의 물 과정에서 동결 조직 분쇄기 고 구멍 형태에 있는 얼음 결정 형성할 수 있다. TBS에서 자당의 직렬 희...

여기, 우리 소설 방법, 우리는 전화 Megabrain, cryosection 여러 설치류 다운스트림 immunohistochemical 절차에 대 한 동시에 두뇌 개발에 대 한 프로토콜을 제시. Megabrain는 여러 동물에서 조직을 포함 하는 단일 슬라이드의 생산 수 있습니다. 이 기술은 9 성인 쥐 반구, 또는 5 성인 전체 두뇌에서 코로나 섹션을 동시에 최적화 되었습니다. 따라서, 기술은 가장 큰 immunohistochemical 연구 또는 동물의 대규모 코 호트에서 슬라이드 탑재 뇌 조직에서 수행 하는 다른 분석에 적용 됩니다.
Immunohistochemistry 이해 하 고 그들의 표현과 특정 조직1,2,3세포 변화 특성 관심사의 단백질에 대하여 지시 하는 특정 항 체의 사용을 포함. Immunohistochemistry의 사용은 뇌4의 세포 및 분자 이해에 은닉, 다른 과학 분야 중 신경 과학 연구에서 널리 퍼지다. 많은 동물 및 뇌 섹션을 포함 하는 대규모 연구 자원 및 시간 집중 될 수 있습니다. 따라서, 개발 된 Megabrain의 다각적인 근거 있다: 시간을 줄이기 위해 cryosectioning, 장착, 그리고 결과적으로 더 적은 시 약을 사용 하는 동안 조직, 얼룩을 보냈다. 또한, 프로세스를 간소화 하 고 얼룩 같은 여러 두뇌의 수 라운드 배치, immunohistochemistry3의 한계를 얼룩 사이 가변성의 일부를 완화 하는 데 도움이. 또한,는 Megabrain 단면 단면 개별 냉동된 설치류 두뇌에 시간 절약 대안 이다 하며 동물이 나 심지어 치료 그룹 사이 조직의 빠른 비교를 위해 현미경 검사 법 기술로

<table><tbody><tr><td>앤드윈 사이언티픽 티슈-텍 CRYO-OCT 컴파운드 (12개입)</td><td>피셔 사이언</td>티픽 <td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>써모 사이언티픽 샨돈 필-어-웨이 일회용 임베딩 몰</td>드 <td>피셔 사이언티</td>픽 <td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>피셔브랜드 고정밀 스트레이트 브로드 스트롱 포인트 핀셋/집게</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>피셔브랜드 20 mL HDPE 신틸레이션 바이알 포함 폴리프로필렌 캡</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>자당, 폴리 병 2.5kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2-212</td><td>15% 및 30% 자당 농도를 모두 구성해야 합니다.</td></tr><tr><td>2-메틸부탄 (인증), 피셔 케미컬</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>PYREX 톨-폼 비커</td><td>피셔 사이언</td>티픽 <td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>피셔브랜드 범용 액체-인-글라스 부분 침수 온도계 (-50 to +50 &deg; C)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>피셔브랜드&nbsp; Scoopula 주걱</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>STANLEY 면도날</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Edge-Rite 마이크로톰 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (1" 서리) - 흰색</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>사용 전에 1X로 희석하십시오</td></tr>. <tr><td>15개의 세밀한 페인트 브러시</td><td>아마존</td><td>B079J12ZRV</td><td></td></tr><tr><td>PAP 펜</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>척 그림 4에 나와 있는 이 제품은 실험실 기술자에 의해 맞춤 제작되었지만, 다른 회사에서 상업적으로 주문할 수 있는 유사한 크기도 가능합니다.</td><td>전자 현미경 과학</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

여러 설치류 두뇌의 동시 cryosectioning

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

조직학 및 immunohistochemistry 현미경 해부학 시각화 및 지역화 생물 조직 내의 단백질 분석의 일상적인 방법이 있습니다. 신경 과학, 뿐만 아니라 다른 과학 분야의 과다,이 기술은 사용 됩니다. Immunohistochemistry는 슬라이드 마운트 조직 또는 부동성 섹션에서 수행할 수 있습니다. 샘플 슬라이드 마운트 준비 시간 집중적인 과정 이다. 다음 프로토콜 기법, Megabrain에 대 한 단일 냉동된 블록으로 여러 두뇌를 결합 하 여 최대 90%까지에 의해 cryosection 및 마운트 뇌 조직에 걸린 시간 감소. 또한,이 기술은 큰 조직화 학적인 학문에서 라운드를 얼룩 사이 본 다양성 감소. 현재 기술에 맞게 최적화 된 설치류 뇌 조직을 사용 하 여 다운스트림 immunohistochemical 분석; 그러나, cryosectioning 사용 하는 다른 과학 분야에 적용할 수 있습니다.

이 절차에 긍정적인 최종 결과 거품 또는 동결 된 방향에서 눈물 없이 슬라이드에 있는 조직. 조직 섹션 OCT에서 뇌와 그림 1에서 시연으로 좋은 표기법의 좋은 배치로 인 떨어져 고 쉽게 식별 분포 균등 하 게 됩니다. 뇌 조직의 비슷한 나이의 동물에서 수집 된 고 조직 OCT에 맞춘 제대로 된 슬라이드에서 수집 하는 섹션 동물 사이 뇌 영역의 비교 수 있도록 비슷한 코로나 비행기를 나타내야 합니다. 조직은 고정, 최소한 동결 유물으로는 H &amp; E 얼룩9cryoprotection 품질 평가 하기 위해 밖으로 수행할 수 있습니다. 그림 6에 표시 된 얼룩과 같이 Immunohistochemistry 밖으로 수행할 수 있습니다.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within...

여기, 선물이 동결 하 고 처리 한 두뇌를 절약해 주는 대신 여러 동물에서 뇌 조직 섹션 프로토콜. 이 immunohistochemistry 동안 얼룩 가변성을 감소 시키고 감소 시간 cryosectioning 및 이미징.

여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

이 시간 절약 방법은 해부학과 국소 단백질 및 조직의 시각화를 최적화하기 위해 신경 과학 연구에서 면역 조직 화학 적 절차의 라운드 사이의 가변성을 감소시킵니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 뇌를 하나의 냉동 블록으로 결합하여 저온 절에 걸리는 시간을 줄이고 뇌 조직을 탑재한다는 것입니다. 이 기술은 설치류 두뇌의 관상 동맥 단면도에 최적화되어 있는 동안, 그것은 좌활또는 횡방향 단면도 또는 근육 또는 간과 같은 조직의 다른 모형에 적응할 수 있습니다.성공적인 환갑 관류에 따라 PBS에서 25 밀리리터 바이알에서 동물의 뇌를 24 시간 동안 수정하십시오. 그 후, 무딘 기울어진 집게를 사용하여 파라포름알데히드에서 뇌를 제거하십시오. TBS에서 약 20 밀리리터30%의 자당 용액으로 뇌를 유리병으로 옮는다.그들은 유리병의 바닥에 가라 앉을 때까지 뇌와 해결책을 유지합니다. 다음으로, 얼음 양동이에 드라이 아이스 침대에 500 밀리리터 유리 비커를 놓습니다. 그런 다음 300~400밀리리터의 이스펜타네를 비커에 붓습니다.음수 45도에서 음수 50°C 사이의 isopentane을 유지합니다. 벤치 탑에, 최적의 절삭 온도 또는 OCT 화합물로 전체 약 절반 으로 전체 일회용 포함 금형을 채웁니다. 바늘을 사용하여 금형에서 기포를 제거하십시오.무딘 기울어진 집게를 사용하여 자당 용액에서 첫 번째 뇌를 제거하십시오. 그런 다음 반구를 분리하기 전에 새 면도날을 사용하여 소뇌 및 후각 전구를 제거합니다. 다음으로, 뇌에게 숫자 명명 시스템을 제공합니다.무딘 집게를 사용하여, 위치 2에 배치 할 뇌를 데리러, 먼저 위쪽으로 향하고 절단 할 측면과 방향을 지정합니다. 10 월에 뇌를 낮추고 독립적으로 서 때까지 위치를 조정 하는 핀셋을 사용 하 여. 이 기술의 주요 수정은 위치 1의 빈 공간입니다.이 공간은 메가 브레인 방향을 쉽게 식별할 수 있도록 지정되어 각 뇌와 관련된 동물을 식별합니다. 모든 뇌가 금형에 배치 된 후, 뇌의 상단을 커버하기에 충분한 OCT를 추가 한 다음 바늘을 사용하여 기포를 제거하십시오. 포셉이 10월에 부분적으로 침수되지 않도록 포셉으로 금형 의 모서리를 잡으십시오.그런 다음 금형의 하단 3분의 1이 침수되도록 금형을 isopentane으로 낮춥시다. 30초 후에 전체 금형을 isopentane으로 낮추고 집게에서 놓습니다. 3분 후, 집게를 사용하여 이스펜타네에서 금형을 제거합니다.즉시 금형과 그 내용물들을 알루미늄 호일로 감싸서 적절하게 라벨을 붙입니다. 메가브레인을 최소 24시간 동안 음수 섭씨 20도의 냉동고로 옮춥니까. 첫째, 저온 캐비닛의 온도를 섭씨 19도로 설정합니다.냉동고에서 메가 브레인을 제거하고 냉동고에 놓습니다. 그런 다음 척과 얇은 기울어진 페인트 브러시 두 개를 저온스트에 놓습니다. 그 후 슬라이드에 메가브레인 식별 번호와 슬라이드 번호로 레이블을 지정하고 슬라이드 워머에 슬라이드를 배치합니다.다음으로, 거대 두뇌를 풀고 면도날을 사용하여 금형의 모서리를 잘라냅니다. 10월의 얇은 층을 척에 분배합니다. 그런 다음 빠르게 척에 메가 브레인을 배치합니다.OCT가 완전히 동결 된 후, 메가 브레인의 측면에 10 월의 2 밀리미터 층을 적용하고 척에 측면을 실행 할 수 있습니다. 면도날을 사용하여 척의 측면과 바닥에서 초과 10월을 제거합니다. 첫째, 척이 크머리헤드에 메가브레인장착을 장착한 척을 저온스트의 척 머리에 놓습니다.그런 다음 냉동고스트를 원하는 두께로 설정합니다. 조직 수집을 위해 원하는 뇌 영역에 도달하기 위해 필요에 따라 OCT 및 조직을 다듬습니다. 그런 다음 무대에 놓을 때까지 롤 방지 판을 낮추고 극저온 핸들을 돌려 단일 섹션을 수행합니다.티슈 섹션이 닿지 않도록 주의하면서 롤 방지 판을 천천히 들어 올립니다. 페인트 브러시를 부드럽게 사용하여 평평하게 놓일 때까지 티슈 섹션을 풀수 있습니다. 필요한 경우 페인트 브러시를 사용하여 OCT 플랫을 유지하여 롤링을 방지합니다.그런 다음 슬라이드 워머에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드 레이블 측면을 메가브레인 섹션 위로 마우스를 가져가서 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 신속하게 조직 섹션에 PBS의 한 방울을 적용합니다. PBS에 담근 미세한 팁 페인트 브러시를 사용하여 조직 섹션의 거품을 털어 내고 조직을 펼치므로 슬라이드에 평평하게 놓여 있습니다.마지막으로 슬라이드 워머에 슬라이드를 45분 동안 건조시키고 슬라이드를 섭씨 80도에 저장합니다. 이 프로토콜에서, 9개의 동물에게서 두뇌 조직은 동시에 준비되고 저온분해되었습니다. 냉동 절제 후, H&E 염색은 극저온 보호 품질을 평가하기 위해 수행 될 수있다.이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1개 또는 마이크로글리아의 이바1 염색의 대표적인 결과는 단일 메가브레인에 대한 각 연구 뇌 간의 일관된 염색을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 균열 또는 해동을 방지하고 비정상적인 조직 무결성으로 이어지는 조직의 동결을 방지하기 위해 메가 브레인을 동결하면서 지속적으로 온도를 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 염색 하는 동안 그룹 간의 차이를 만들 수 있습니다 및 이미징 및 분석 하는 동안 편견과 주관성을 줄일 수 있기 때문에 별도 메가 브레인에서 다른 치료 그룹을 분리 하는 것이 좋습니다.paraformaldehyde와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 PBE착용 및 후드 작업과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.

simultaneous-cryosectioning-of-multiple-rodent-brains

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 뇌의 특정 영역별 RNA 발현 프로파일링을 위해서는 정밀하고 재현 가능한 조직 수집 전략이 필요합니다. 본 문서에서는 관상면 뇌 절단과 조직 코어러(corer) 보조 미세 절제술을 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 결과 샘플에서 얻은 총 RNA의 수율과 품질은 상술한 방법의 유용성을 입증합니다.

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

우리는 중간 entorhinal 피질 (멕)의 지느러미-복부 축을 유지 뇌 조각의 준비와 electrophysiological 레코딩을위한 절차를 설명합니다. 위치의 신경 인코딩 멕 내에서 지느러미-복부 조직을 따르기 때문에,이 절차는 탐색 및 메모리에 중요한 세포 메커니즘 조사를 용이하게합니다.

설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

이 동영상은 다운스트림 분석을 위해 동결된 마우스 뇌 조직 절편을 준비하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

다운스트림 분석을 위한 마우스 뇌 처리

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

연속 크라이 섹션은 단일 마우스 골격근에서 인접 영역을 이용한 유전자 발현 측정 학적 어플리케이션 및 RNA의 농축을 가능하게 수집된다. 직접 애플리케이션에서 비교 풀링 저온부 및 측정 30mg을 - 고품질 RNA를 (20)로부터 얻어진다.

유전자 발현 및 조직 학적 분석을위한 단일 마우스 골격근의 연속 지역의 냉동 절편

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

이 절차는 저렴하고 일반적으로 사용할 수있는 도구를 사용하여 고품질의 단백질과 RNA를 얻기 위해 이산 냉동 뇌 영역의 수집을 설명합니다.

다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음

우리는 마우스 뇌 제거 및 신선한 뇌 조직에서 분리 된 영역의 해부를위한 실습, 단계별, 신속한 프로토콜을 제시합니다. 분자 분석을위한 뇌 영역을 얻는 것은 많은 신경 과학 실험실에서 일상화되었습니다. 이러한 뇌 영역은 시스템 레벨 분석을 위한 고품질 전사체 데이터를 얻기 위해 즉시 동결된다.

마우스 뇌를 기능적으로나 해부학적으로 다른 영역으로 미세 해부

본 프로토콜은 통합 조직 보존 시스템을 갖춘 최소 침습적 접근법을 통해 설치류에서 뇌종양의 표준화 된 절제술을 설명합니다. 이 기술은 설치류 및 기타 동물 모델의 치료 표준을 정확하게 반영하는 데 의미가 있습니다.

높은 생존력 조직 수집을 위한 설치류의 최소 침습 뇌종양 절제술 시행

본 프로토콜은 염료 및 동결 절편을 사용하여 바이러스 추적을 수행하기 전에 입체탁 주입 좌표의 검증 단계를 신속하게 처리하기 위한 실용적인 전략을 설명합니다.

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

현대 신경과학은 실험실 설치류와 인간을 포함한 여러 종 간의 차이를 탐구해야 합니다. 하지만 큰 뇌를 가진 포유류가 관련될 때는 기술적 어려움이 발생합니다. 이 접근법은 매우 다양한 포유류 내 신경 집단의 종간 변이를 다루며, 진화적 패턴을 밝히기 위해 지도화할 수 있는 유사한 결과를 도출합니다.

서로 다른 포유류 뇌에서의 정량적 세포 계수 연구를 위한 비교적 접근법

배우세요 설치류 두뇌 동시 크라이오섹셔닝 방법으로 면역조직화학 염색 변이성을 줄이고 연구 효율성을 높이세요. 이 기법은 여러 뇌를 하나의 블록에 결합하여 일관된 결과를 제공합니다.

여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning

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