Name: 조직화 학적인 얼룩과 겨울 휴면 중 달콤한 체리의 난소 Primordia에서 전 분을 계량 하기 이미지 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 학습하세요 달콤한 체리(Prunus avium L.)의 겨울 휴면 중 난소 원기에서 전분을 조직화학적 얼룩과 이미지 분석으로 정량화하는 방법을. 이 기법은 목본 식물의 생리 활동과 휴면 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 기꺼이 그들의 도움이 토론과 조언을 위한 마리아 Herrero와 Eliseo 리 바 감사합니다. 이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad에 의해 지원 되었다-유럽 지역 개발 기금, 유럽 연합 [부여 수 있다-2010-037992 E. f]; Instituto Nacional de Investigación y 기술과 Agraria y 섬유 [보조금 번호 RFP2015-00015-00 RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; 그리고 Gobierno de Aragón-유럽 사회 기금, 유럽 연합 [Grupo Consolidado A12 17R].

1. 휴면 결정과 식물 자료를 수집
<ol><li>예제 필드에 꽃 봉 오리. 휴면 연구 장기 실험 하 고 필요 성인 싹 수집 하 큰 만큼 나무와 나무의 개발 다음 봄 동안 손상 없이 모든 겨울을 쏘고. 특별 한 과수원 관리 훈련 시스템;에 따라 필요한 수 있습니다. 따라서, 가지 치기 과일 생산 목적 보다 덜 심각한 수 있습니다.<ol>
<li>새싹 틈의 발병까지가 시작에서 매주 수집 하 고 10 꽃 봉 오리를 무게.</li>
		<li>모자와 함께 10 mL 유리 튜브에 그들을 배치 하 여 꽃 봉 오리를 수정 하 고 샘플 4 ° c.에 24 h 이상 에탄올/아세트산 산 (3:1)의 통 솔루션에 흠뻑 젖어 그리고는 정착 액을 버리고 75% 에탄올, 넉넉한 샘플 포함 보장을 추가 합니다. 샘플 사용까지 4 ° C에서이 솔루션에 보존 될 수 있습니다. 참고: 꽃 봉 오리 안에 기포를 제거 하 고 부동에서 그들을 방지 하는 진공 침투를 사용할 수 있습니다. 이 조직에는 정착 액의 침투를 용이 하 게 하지만 조직의 구조를 손상 될 수 있습니다. 필요 하지 않은 경우 그것을 방지 하려고 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>필드에서 촬영 샘플.<ol>
<li>각 주, 버드 휴식의 발병까지가 시작에서 15-30 cm 길이 직경, 10 꽃 싹을 포함 된 5 m m의 3 개의 촬영을 가져가 라. 22 ± 1 ° C 12 h 빛 photoperiod에 성장 챔버에 물에 젖은 꽃 거품에 넣어.</li>
		<li>10 일 후에 성장 챔버, 선택 하 고 무게는 촬영에서 10 꽃 봉 오리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새싹 성장 평가 하 고 휴면 상태를 결정 합니다. 샘플링 기간 위치 조건에 조정 될 수 있다. 과수원 조건에서 (사라고사, 스페인, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W, 그리고 해발 220 m), 쏘고의 샘플링에서 11 월 30 일 2 월 말 또는 3 월 초까지 실시 되었다.<ol>
<li>주간 평가 꽃 봉 오리의 응답 챔버의 적당 한 성장 조건까지 budburst 봄,가 시작 부분에서 필드에서 고른 10 싹의 무게를 비교 하 여.</li>
		<li>차이가 없거나 그 차이 30% 미만, 새싹 재미 그들의 요구를 실현 하지가지고 고 endodormant22는 고려 하십시오. 차이가 있다면 30% 이상, 새싹 재미 그들의 요구를 충족 하 고 ecodormant22는 고려 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 식물 재료 준비 전 분 정량화에 대 한
<ol><li>각 샘플링에서 선택에 대해 6 개의 고정된 싹 날짜 (단계 1.1 참조). 재배, 따라 각 달콤한 체리 꽃 봉 오리에는 최대 5 개의 꽃 primordia를 포함 되어 있습니다.<ol>
<li>외부 버드 비늘을 제거 하 고 밖으로 건조에서 그것을 방지 하기 위해 75% 에탄올과는 시계 유리에 꽃 봉 오리를 놓습니다.</li>
		<li>꽃 봉 오리를 해 부하 고 정밀 집게의 도움과 입체 현미경 안과 메스 새싹 당 적어도 하나의 꽃 primordium 추출 합니다. 꽃 primordium 4 ° C에 75% 에탄올 10 mL 유리 튜브에 보존 될 수 있습니다 또는 다음 단계로 바로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제 3 부 틸 알코올 시리즈에서 샘플 탈수.<ol>
<li>75 %3 차 부 틸 알콜 아낌없이 샘플을 커버 하 고 1.5 h에 대 한 그들을 품 어 (미정)의 10 mL에 75% 에탄올 솔루션을 바꿉니다. 파스퇴르 피 펫 솔루션 삭제 하도록 유용할 수 있습니다.</li>
		<li>이후 순수 미정 실내 온도 (< 20 ° C)에서 crystalizes와 매우 휘발성 이며 독성 공기 추출, 30 ° C에서 건조 난로에 단계 2.2.1, 상승 농도 (85%, 95%, 및 100 %v / v, 및 순수한 미정 3 x)와 함께 TBA를 추가 반복 합니다. 미정 샘플 crystalizes, 그것은 조직 손상 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀18에 샘플을 포함 합니다.<ol>
<li>공기 추출 전날 60 ° C에서 건조 하는 난로 있는 파라핀 진주를 도입 하 여는 파라핀을 녹여. 파라핀 진주 또한, 열판에 녹아 수 있습니다 하지만 액체 파라핀 60 ° C에 그리고 조직 손상을 방지 하기 위해 높은 온도에 아닙니다 확인 하십시오.</li>
		<li>미정 미정과 파라핀 오일 (1:1)의 혼합으로 대체 하 고 60 ° c.에 건조 난로 내부 24 h에 대 한 품 어 그런 다음, 미정의 믹스를 대체 하 고 순수한 파라핀 오일 파라핀을 녹여 및 60 ° c.에 건조 난로 안에 적어도 6 h에 대 한 품 어 반복 2 x 적어도 4-6 d에 대 한 마지막 변경 품 어 고.</li>
		<li>열 표면에 작은 기본 금형에 각 샘플 배치 포함 카세트 속도 파라핀 왁 스에 포함 된. 차가운 표면 위에 그것을 배치 하 고 왁 스가 고형화 되 면 블록을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섹션 하 고 준비를 rehydrate.<ol>
<li>준비 하는 Haupt의 접착제: 30 ° C에 증류수 100 mL에 일반 녹 스 젤라틴의 1 g을 분해 다음, 2 세대의 페 놀 느슨한 (C6H5오)와 글리세롤의 15 mL를 추가 합니다. 브러시와 유리 슬라이드에 걸쳐 Haupt의 접착제 하 고 1% 포름알데히드 용액 한 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>섹션 각 파라핀와 톰에 10 µ m에서 차단 하 고 유리 슬라이드에 섹션을 배치 Haupt의 접착제로 덮여.</li>
		<li>건조;까지 단면도 유리 슬라이드를 35-40 ° C에서 열 표면에 놓으십시오 그런 다음 유리 슬라이드 슬라이드 랙 이동 합니다.</li>
		<li>Dewax 및 리하이드레이션 솔루션을 준비 합니다. 3 유리 얼룩 요리, Histoclear II:ethanol (1:1, v/v)로 또 하나, 에탄올 시리즈 Histoclear II의 200 mL를 배치 (100%, 70%, 40%, v/v), 그리고 최종 증 류 물 세척.</li>
		<li>3 세척, 각 5 분, Histoclear II 및 Histoclear II:ethanol (1:1, v/v)와 섹션 dewax 슬라이드 랙 보장 솔루션 완전히 슬라이드, 커버 유리 얼룩 요리를 내 놓고, 다음, 다음을 하나의 솔루션에서 슬라이드 랙 이동 합니다.</li>
		<li>2 민 세척의 다음 시리즈에 의해 섹션을 rehydrate: 에탄올 시리즈 (100%, 70%, 40%, v/v) 및 최종 증 류 물 세척. 마지막으로, 실내 온도에 유리 슬라이드 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섹션18얼룩.<ol>
<li>나에 게2기 얼룩을 준비: 요오드 화 칼륨 (KI), 요오드의 0.2 g 2 세대 분해 (나2) 100 mL의 증류수에. 신선한 방울 적용 나2기 5 분에 대 한 섹션을 통해, 다음, 얼룩의 과잉 압 지와 그것을 흡수 하 여 삭제 하 고. 신속 하 게 다음 단계를 진행 합니다.</li>
		<li>합성 설치 미디어의 작은 방울을 적용, 작은 커버 유리 상단에 놓고 하드를 누릅니다. 일단 장착 미디어 건조, 난소 전 분의 예비 평가 대 한 밝은 분야 현미경으로 관찰 합니다. 참고:이 단계는 비록 전 분와 배경 사이의 더 나은 대조를 얻은 없는 필수. 섹션 전 분 정량화 후 다른 얼룩 다시 사용할 경우, 커버 유리 위에 얼룩의 드롭 놓고 압 지와 그것을 흡수 하 여 과잉을 삭제 (2.5.1 참조). 다음, 전 분 정량화, 후 씻어는 밖으로2기는 증류수와 장소는 열 이상의 준비 건조까지 35-40 ° C에 표면 얼룩.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 녹말 함유량의 정량화
<ol><li>보정 광학 조건. 참고: 이미지 분석기 스테인드 녹말을 검출 하는 데 사용 검출 레벨은 직접 현미경;의 확대 및 조명 조건에 따라 따라서, 이러한 조건을 평가 하는 모든 준비에 대 한 수정. 조정 가능한 현미경 및 조명 조건에 여기 제안 된 적응.<ol>
<li>확대 및 밝기 제어 또는 빛의 강도 X 20에 조리개 다이어 프 램을 조정 합니다.</li>
		<li>필터 홀더에 필터가 되어 있는지 확인 하 고 현미경에서 밝은 필드 조건을 선택 합니다. (예를 들어, 40 X 달콤한 체리 난소 primordium) 적합 한 확대를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지 수집 조건을 제어 합니다. 조직을 통해 이미지 없이 스테인드 준비 카메라 설정을 조정 | 수집 | 사전 보기.<ol>
<li>50%, 1.0에서 이득에 밝기를 수정 x, 그리고 감마 1.00 및 0-명암 값 히스토그램 지표 100, 밝기 분포 히스토그램의 한계와.</li>
		<li>과도/노출 부족 기능을 활성화 하 고 노출 과도의 한계에 노출 시간을 조정 합니다.</li>
		<li>화이트 밸런스 기능 수정 및 균질 이미지를 만드는 완전 한 이미지를 어떤 색조와 음영 보정 없이 이미지의 모든 중립 착 색 구성 요소를 표시 하려면 전체 이미지에 적용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>투과율 (T) 값으로 얻을 수 있습니다 다른 광학 밀도 (OD)의 회색 레벨 (0, 검정, 255, 흰색)의 컨트롤 값을 가져올 이미지 분석 시스템 보정.<ol>
<li>제어, 간주 조직 없이 스테인드 준비의 이미지를 수집 하 고는 흑인과 백인 이미지를 통해 측정의 회색 수준을 측정 | 회색 측정 | 회색 보정 | 참조 값 = 0 | 측정 | 보정 | 확인. 이 100% 투과율;과 해당 따라서, 0 세에 따라 광학 밀도 = 2-티 로그</li>
		<li>4 빛의 양을 줄여 4N 필터와 동일한 준비의 이미지를 취득, 및 측정은 흑인과 백인 이미지를 통해 측정의 회색 수준 | 회색 측정 | 회색 보정 | 참조 값 0.6 = | 측정 | 보정 | 확인. 이 25% 투과율;과 해당 따라서, 외경에 따라 0.6의 광학 밀도 = 2-티 로그</li>
		<li>빛, 고려 검정 없이 동일한 준비의 이미지를 취득 하 고는 흑인과 백인 이미지를 통해 측정의 회색 레벨을 측정 | 회색 측정 | 회색 보정 | 참조 값 = 1 | 측정 | 보정 | 확인. 이 0% 투과율;과 해당 따라서, 외경에 따라 1의 광학 밀도 = 2-티 로그</li>
	</ol>
</li>
	<li>전 분을 감지 합니다.<ol>
<li>적어도 300 dpi (인치당 도트 수) 해상도와 TIFF 형식에서 측정 필드의 컬러 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>스테인드 지역에 해당 하는 이진 이미지를 만듭니다. 세 가지 색 임계값 설정 (값 0-사이 각 255) 바이너리 이미지 정확 하 게 반영 하는 관찰을 통해 이미지 묻은 전 분 알갱이 | 검색 | 빨강, 파랑 및 녹색의 임계값을 선택 | 확인. 다양 한 준비와 조직 최종 감지 수준을 조정 하에서 반복적으로 시각적 비교를 확인 합니다. 저장 하 고 모든 준비가이 수준을 사용 합니다.</li>
		<li>전 분을 계량. 이미지 분석 시스템으로 흑백 이미지에 원본 컬러 이미지를 변환 합니다. 이진 이미지는 흑백 이미지를 통해 이미지에 겹쳐 마스크로 사용 하 여 | 바이너리 편집. 모든 픽셀은 마스크 를 통해 측정에서의 광학 밀도의 합을 측정 | 회색 수준 | 확인 측정된 분야에 전 분 내용으로이 값을 고려 하십시오.</li>
		<li>반복 단계 3.4.1-꽃 primordia의 난소에서 녹말 함유량의 대표 값을 가져오는 난소 primordia의 3.4.3 4 장소.</li>
		<li>3.4.3 3.4.1-단계를 반복 하 고 각 수집 날짜의 다른 꽃에 3.4.5 단계.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우 디 사계절에 휴면 휴면 뒤에 생물 학적 과정 불분명 남아 있지만 과일 생산에서 명확한 의미와 변화 하는 기후에 있는 임업을 선물 한다. 휴면 연구는 다른 관점에서 접근 될 수 있다 하지만 겨울 휴면에 대 한 생물 학적 마커를 찾는 연구는 지난 년 동안을 강화 하고있다. 그러나 때 새싹 휴면 고장이 보여주는 명확한 지표를 찾을 대부분의 시도 실패3되었습니다. 분석 이미지, 조직화 학적인 기법18 결합 여기에서 설명한 방법론 특정 조직의 탄수화물 보유와 달콤한 체리 새싹에서 그것의 생리 적인 활동의 관계를 검토 하 매우 유용 했습니다. 휴면5 의 여러 단계와 다른 종 및 조직10,,1320에 적용할 수 있습니다.
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온화한 우 디 사계절 그들의 성장과 발전을 변조 하 여 계절에 적응. 그들은 봄, 여름 동안 개발 하는 동안 그들은 휴면 겨울1에 서가 동안 성장 하 고 중지 합니다. 휴면 낮은 겨울 온도에서 살아남을 수 있습니다, 재미는 적절 한 budburst 봄2에 대 한 전제 조건. 온대 과일 생산 및 임업에 휴면의 중요 한 의미를 확인 하 고 예측 하는 휴면 기간3다양 한 노력을 끌고있다. 과일 나무 종에 경험적 실험 조건 및 꽃의 데이터를 기반으로 하는 통계 예측 강제 촬영 전송 가지 현재 추정 하는 연구를 수 있는 휴면의 날짜를 결정 하는 각 품종에 대 한 요구 사항을 재미 그러나, 생물 학적 과정에 따라 휴면 상태를 확인 하는 방법 불분명3남아 있습니다.
달콤한 체리 (벚나무 avium L.), 등 온대 과일 나무에 꽃이 피는 일년에 한 번 발생 하 고 보름 정도 지속. 그러나, 꽃을 차별화 하 고 이전 여름4기간 동안 약 10 개월 이전에 개발 시작. 꽃 primordia 겨울 동안 휴면 새싹 안에 남아가 동안 성장 하 고 중지 합니다. 이 기간에 각 품종 축적 적절 한 꽃4에 대 한 특정 재미 요구 해야 합니다. 겨울 동안 싹에서 phenological 변화의 부족에도 불구 하 고 꽃 primordia 순수 활성화 휴면, 동안 되며 온도 재미의 축적 최근 전 분 축적의 동적으로 연결 하거나 감소 난소 primordium의 세포 내에서 휴면 결정5에 대 한 새로운 접근을 제공합니다. 그러나, 작은 크기와 난소 primordium의 위치는 특별 한 방법론을 필요합니다.
전 분 우 디 식물 종6주요 저장 탄수화물 이다. 따라서, 변경 전 분에서 꽃 조직, 그들의 개발7,8을 지원 하기 위해 탄수화물을 필요의 생리 적 활동에 관련 되어있다. 생식 과정에서 다른 키 이벤트 또한 녹말 함유량 다른 꽃 구조, 꽃 밥 감수 분열 등9, 스타일이 나 난 수정10통해 꽃가루 관의 성장에에서 있는 변이 관련 됩니다. 조직화 학적인 기법 휴면 중 꽃 primordia의 각 특정 조직에 녹말의 검출을 허용합니다. 그러나, 어려움은 조직, 재배, 또는 년 중 콘텐츠 시간 또는 비교 전 분 축적/감소의 패턴에 따라 허용 하는 전 분을 측정에 남아 있습니다. 이것은 작은 양의 분석 기법11에 사용할 수 있는 조직입니다. 대신, 이미지 분석 현미경12 에 연결 된 식물 조직13의 아주 작은 샘플에서 전 분의 정량화를 수 있습니다.
현미경 및 이미지 분석을 결합 하는 접근 계량 식물 조직, callose14,15, microtubes 등 다른 부품의 콘텐츠 또는 특정 하 여 염색 하는 영역의 크기를 측정 하 여16, 전 분을 사용합니다 얼룩. 전 분, 대 한 그것은 검출 될 수 있다 쉽게 요오드 화 칼륨 요오드를 사용 하 여 (나2기) 반응17. 이 메서드는 매우 구체적인; 내가2기 내에서 전 분 곡물의 구조는 intercalates 및 전 분18amylose 내용에 따라 어두운 파란색 또는 붉은 갈색 색상, 형태. 섹션 I로 얼룩진2기 얼룩이 보여 전 분 및 이미지 분석 시스템19애매 녹말 검출 및 후속 정량화를 허용 하는 배경 조직 사이의 적절 한 대조. 이 염료는 화학 량 론, 요오드의 축적은 매우17을 변화할 수 있는 전 분 분자의 길이에 비례 합니다. 따라서, 픽셀 수로 표현 된 스테인드 영역의 크기 수 있습니다 반영 하지 정확 하 게 전 분의 내용 때문에 비슷한 크기의 스테인드 영역 필드 사이 녹말 함유량에서 높은 차이 찾을 수 없습니다. 대신, 녹말 함유량 살구8,13 에 다른 조직에 보고 되는 현미경에서 얻은 흑백 이미지에 묻은 알갱이의 광학 밀도 측정 하 여 평가 될 수 있습니다. , 19,20, 아보카도10,그리고 올리브21.
여기, 우리가 설명 달콤한 체리에 봄가 난소 primordium 조직에 녹말 함유량의 정량화와 휴면 상태의 실험 결정을 결합 하는 방법 이해 및 예측을 위한 새로운 도구를 제공 하 고 생물 학적 메커니즘의 연구에 따라 휴면 휴면 연결.

<table><tbody><tr><td>정밀 스케일</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>입체 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>건조 스토브</td><td>Memmert</td><td>U15</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 임베딩 스테이션</td><td>Leica Microsystems</td><td>EG1140H</td><td></td></tr><tr><td>회전식 마이크로톰</td><td>Reichert-Jung</td><td>1130/Biocut</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>깃털</td><td>S35</td><td>스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>명시야 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Leica Microsystems</td><td>DC-300</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 시스템</td><td>Leica Microsystems</td><td>Quantiment Q550</td><td></td></tr></tbody></table>

조직화 학적인 얼룩과 겨울 휴면 중 달콤한 체리의 난소 primordia에서 전 분을 계량 하기 이미지 분석

Combining Histochemical Staining and Image Analysis to Quantify Starch in the Ovary Primordia of Sweet Cherry during Winter Dormancy

작은 구조에서 전 분에 변경 수정 하 열매를 맺은의 발병 수 분에서 생식 단계를 포함 하 여 여러 식물 발달 과정, 동안 주요 이벤트와 연결 되어 있습니다. 그러나, 꽃 감 별 법 동안에 전 분 유사 알려져 있지 않습니다 완전히, 꽃 primordia의 특히 작은 구조에서 녹말 함유량 측정의 어려움 때문에 주로. 여기, 우리는 다른 단계와 녹말 함유량에 있는 변화를 관련 된 수 있는 현미경에 부착 된 이미지 분석 시스템을 사용 하 여 달콤한 체리 (벚나무 avium L.)의 난소 primordia에서 전 분의 정량화 하는 방법 설명 봄가을 휴면. 이 위해 꽃 봉 오리의 휴면 상태 제어 조건에 겨울 시간에 다른 순간에 전송 하는 촬영의 새싹 성장 평가 하 여 결정 됩니다. 난소 primordia에서 전 분의 정량화에 대 한 꽃 봉 오리는 순차적으로 수집, 고정, 파라핀 왁 스에 포함 된, sectioned, 그리고 난 물2Kl (요오드 화 칼륨 요오드). 준비는 현미경 관찰 하 고 명확 하 게 배경에서 전 분을 구분 하는 이미지 분석기에 의해 분석. 전 분 콘텐츠 값 공부 프레임의 녹말 함유량의 추정으로 각 픽셀의 광학 밀도의 합계를 고려 하 고 묻은 전 분에 해당 하는 이미지의 광학 밀도 측정 하 여 얻을 수 있습니다.

휴면 연구 재미 요구 사항이 충족 되는 때 순간의 결정을 해야 합니다. 필드 조건 (그림 1A)에서 겨울 동안 phenological 변화의 부족에도 불구 하 고 벚꽃 복구할 수 없습니다 적당 한 조건에서 성장의 용량 낮은 온도에서 일정 기간을 통과할 때까지. 겨울 시간 동안 제어 조건 약 실 (그림 1B)에 촬영의 정기 전이 꽃 봉 오리의 휴면 상태의 평가 허용. 꽃 봉 오리 성장의 평가 버드 체중 증가 측정 하 여 이루어졌다. 반면, 휴면, 동안 변경 관찰 될 수 있었다 적당 한 조건 (그림 1C)의 10 일 후 일단 휴면 극복, 새싹 늘어났다 고 성장 챔버 (그림 1D)에 버스트. 이 분석의 결과 허용을 싹의 휴면 상태. 겨울 동안 발생 하는 다른 온도 ...

우리는 조직화 학적인 기술을 결합 하는 이미지 분석 시스템을 사용 하 여 겨울 휴면 중 달콤한 체리 (벚나무 avium L.)에서 난소 primordia에서 녹말 함유량을 계량 하는 방법론을 제시.

조직화 학적인 얼룩과 겨울 휴면 중 달콤한 체리의 난소 Primordia에서 전 분을 계량 하기 이미지 분석

Changes in starch in small structures are associated with key events during several plant developmental processes, including the reproductive phase from ...

이 방법은 꽃 봉오리가 제대로 꽃을 피우기 위해 겨울 동안 추위를 축적해야하는 이유와 같은 우디 식물의 휴면에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 꽃 원시의 매우 작은 샘플에서 전분의 정량화를 허용합니다. 이러한 접근법은 휴면 기간 동안 꽃 프라이모르의 생리적 활성을 검출하는 데 매우 유용하며 살구 나 매화와 같은 다른 나무 종에도 적용 될 수 있습니다.이 방법은 휴면 꽃 봉오리에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 과일의 발병에 수분에서 생식 단계와 같은 다른 과정에 적용 할 수 있습니다. 시작하려면 필드에서 5개의 슈팅을 수집합니다. 그런 다음 무게와 4섭씨에서 적어도 24 시간 동안 고정 용액10 밀리리터 유리 튜브에 꽃 봉오리 10 개.그 후 고정을 버리고 샘플을 덮을 수 있는 75%에탄올을 충분히 추가합니다. 길이 15~30cm, 직경 5mm, 꽃봉오리 10개씩 3개의 싹을 얻습니다. 그런 다음 물에 젖은 꽃집의 거품에 싹을 성장 챔버에 놓습니다.성장 챔버에서 10 일 후, 싹에서 꽃 봉오리를 제거하고 무게. 가을 초초부터 봄의 꽃봉오리버스트까지 매주 꽃봉오리의 성장을 평가합니다. 각 샘플에서 외부 새싹 스케일을 제거한 다음 각 새싹을 75%에탄올이 들어 있는 워치메이커 유리에 놓습니다.정밀 집게와 안과 메스를 사용하여 싹을 해부하고 각 싹에서 적어도 하나의 꽃 프리모디움을 얻습니다. 파라핀 왁스에 개별적으로 샘플을 포함하여 블록을 형성하고 회전 마이크로톤에 시료를 섹션화합니다. 샘플을 단면한 후 한 방울의 신선한 루골 요오드를 한 섹션에 발라주세요.5분 후, 얼룩진 종이로 과도한 얼룩을 제거합니다. 다음으로 합성 마운팅 미디어의 작은 방울을 적용, 샘플 위에 작은 커버 유리를 배치하고 열심히 눌러. 마운팅 미디어가 건조되면 밝은 필드 현미경으로 얼룩진 부분을 관찰하십시오.먼저 텍스트 프로토콜에 따라 조리개 다이어프램과 밝기 제어를 조정합니다. 그런 다음 필터 홀더에 필터가 없는지 확인하고 현미경에서 밝은 필드 상태를 선택하십시오. 그 후, 조직없이 염색 된 준비에 대한 카메라 설정을 조정합니다.50%에서 밝기를 수정한 다음 과다 노출/노출 부족 기능을 활성화하고 과다 노출 제한시 노출 시간을 조정합니다. 화이트 밸런스 기능과 차도 보정을 적용합니다. 조직없이 염색 된 준비의 결과 흑백 이미지의 회색 수준을 측정합니다.그런 다음 4N 필터를 적용하고 준비의 또 다른 흑백 이미지를 획득하고 회색 레벨을 측정합니다. 다음으로 빛없이 동일한 준비의 이미지를 획득하고 결과 이미지의 회색 수준을 측정하고 보정합니다. 그 후, 최소 300 dpi의 해상도와 TIFF 형식으로 샘플 섹션의 색상 이미지를 획득한다.스테인드 영역에 해당하는 이진 이미지를 만든 다음 이진 이미지가 스테인드 전분 과립을 정확하게 반영할 때까지 세 가지 색상 임계값을 설정합니다. 이 프로세스를 다른 준비 및 조직과 함께 반복하여 최종 검색 수준을 미세 조정합니다. 이미지 분석 시스템을 사용하여 마스크 아래의 모든 픽셀의 광학 밀도합계를 측정하여 현장의 전분 함량을 정량화합니다.본 프로토콜에서 꽃봉오리 의 성장과 휴면 상태는 적합한 조건에서 10일 후에 싹 무게증가를 측정하여 평가하였다. 휴면 기간 동안, 적절한 조건에서 10 일 후에 아무 변화도 관찰되지 않았습니다. 휴면이 극복되면, 싹이 부풀어 와서 성장 챔버에서 파열.난소 프리마디움내의 전분 함량은 각 미세토메드 섹션에서 이미지 분석을 통해 정량화되었다. 일관되게, 초겨울에 전분의 양은 40, 000 미만의 광학 밀도 값을 제시하고 최대 양은 연구의 두 년 동안 120, 000 과 140, 000 사이의 값에 도달했다. 휴면 상태인 경우, 전분의 최대 량은 두 년 동안 의기양양하게 일어났습니다.이미지 분석기에서 사용하는 검출 수준은 시스템의 교정에 직접적으로 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 여기에는 현미경의 광 상태, 얼룩 강도 및 배율을 포함합니다. 이 조건은 모든 준비를 위해 수정되어야 합니다.이미지 분석과 히스토케미컬 기술의 조합은 휴면의 다른 단계 동안 꽃 원시어의 탄수화물 예비를 검사하는 데 매우 유용하게 귀착되었다. 그것은 또한 다른 종 및 조직에 적용 될 수 있습니다. 이 방법의 사용에 의해 공개 된 난소 원시디아의 휴면 방출과 전분 축적 사이의 관계는 휴면 및 냉각 요구 사항의 생물학적 기초를 이해하는 건전한 기초를 제공합니다.미래의 노력은 나무의 휴면 상태를 쉽게 나타낼 수있는 신뢰할 수있는 생물학적 지표를 연구하는 데 초점을 맞추어야합니다. 한편, 휴면성을 따라 전분 변이의 패턴은 더 생리적 및 유전 적 연구를 프레임하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

식물 세포벽 구성은 조직 유형에 따라 다르며 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함할 수 있습니다. 세포 유형 수준에서 차이를 시각화하기 위해 다양한 염색 기술이 개발되었습니다. 이 논문은 일반적으로 사용되는 세포벽 염색 기술을 편집한 것입니다.

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

진딧물 배아에 대한 전체 마운트 면역 염색 프로토콜이 제시되며, 이 프로토콜에서는 배경 염색을 줄이고 조직 투과성을 증가시키기 위한 중요한 조건을 다룹니다. 이러한 조건은 진딧물의 배아 조직에서 단백질 발현을 효과적으로 검출하기 위해 특별히 개발되었습니다.

완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

우리는 살아있는 초파리 난소 조직에는 상피 줄기 세포 계보의 세포내 pH를 이미징에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 유전자 변형 파리 양적 형광 이미징 사용 하 여 바이오 센서는 pH 바이오 센서, mCherry::pHluorin, 이미지를 표현 생성 하 고 표준 곡선, 생성 한 형광 강도 값을 pH 값으로 변환 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

이 기술은 종자의 다른 지구에 있는 세포, 전분 과립 및 단백질 바디의 관측 그리고 분석을 위한 전체 종자 크기의 수지 단면도의 빠르고 간단한 준비를 허용합니다.

전체 종자 크기의 수지 섹션 및 응용 프로그램을 얻기위한 간단한 건조 단면 방법

사과 펄프 세포의 분리된 전형세포는 세포질 Ca2+ 농도를 검출하기 위해 칼슘 형광 시약으로 적재되었다.

애플 펄프에서 플루오-4/AM으로 세포질 Ca2+ 염색

여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.

전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

이 논문은 기공 발달을 제어하는 유전자를 특성화하기 위해 표피 껍질을 사용하지 않는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 톨루이딘 블루 O-염색 식물 표피를 사용하여 기공 표현형을 분석하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 기공 리간드를 식별하고 생물학적 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별

학습하세요 달콤한 체리(Prunus avium L.)의 겨울 휴면 중 난소 원기에서 전분을 조직화학적 얼룩과 이미지 분석으로 정량화하는 방법을. 이 기법은 목본 식물의 생리 활동과 휴면 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

조직화 학적인 얼룩과 겨울 휴면 중 달콤한 체리의 난소 Primordia에서 전 분을 계량 하기 이미지 분석

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