NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화
2019년 11월 27일
여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
여기에서 우리는 NETS 및 면역 불경심 심상을 정량화하기 위한 완전 자동화된 접근 방식인 NETQUANT를 제시합니다. 이렇게 하면 연구원이 여러 사용자와 조건에 의해 생성된 데이터에서 유사한 이미지 분석을 만드는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 장점은 사용의 용이성, 단일 셀 데이터 분석, NET 형성을 평가하는 여러 기준 및 여러 이미지의 편견없는 분석입니다.
분석 소프트웨어를 설치하고 엽니다. 최신 버전은 제노도 GitHub 아카이브 또는 Nordonfelt Lab 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 설정 탭에서 원본 메뉴에서 경로 경로 경로를 클릭하여 분석을 위한 원본 폴더를 선택합니다.
분석할 이미지 시퀀스를 포함하는 폴더를 선택합니다. 다시 대상 메뉴에서 get 경로 옵션을 클릭하고 이미지 분석 다음 데이터를 저장하기 위한 대상 폴더를 선택합니다. 다음으로, 별도의 채널 이미지를 사용하는 경우, DNA 채널이 핵 DNA 얼룩에 대응할 수 있도록 채널 폴더의 이름을 지정하고, NET 채널은 이미지에서 호중구 엘라스타제 얼룩을 묘사한다.
또한 컨트롤 이미지 파일을 포함하는 폴더의 이름을 컨트롤로 지정합니다. 그런 다음 로드 이미지 정보 버튼을 클릭하고 이미지 메타데이터를 소프트웨어에 로드합니다. 그런 다음 채널 순서 하위 메뉴에서 이미지에 포함된 올바른 채널 순서를 선택합니다.
이렇게 하면 우발적인 불일치를 방지할 수 있습니다. 이제 준비 된 데이터 버튼을 클릭하여 원시 데이터에서 기본 이미지 속성을 얻고 이미지를 변환합니다. 그런 다음 변환된 이미지가 샘플 유형 하위 메뉴에 나타납니다.
샘플 유형 메뉴를 클릭하고 하위 메뉴에서 이미지를 선택하고 디스플레이 이미지 데이터를 클릭하여 DNA 및 호중구 세포 외 트랩 또는 NET 채널로 분할된 이미지를 각각 표시합니다. 세포를 각각의 채널로 분할하려면 분할 방법 탭을 선택하고 DNA 및 NET 채널 모두에 대한 메서드 하위 메뉴에서 메서드를 선택합니다. 분할의 기본 방법은 적응으로 설정되며 권장되는 설정입니다.
다른 옵션은 글로벌 에지 및 chanverse를 포함한 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 밀접하게 배치 된 세포 또는 NET를 구별하는 데 도움이되는 분수령 옵션도 포함되어 있습니다. 또한 세분화 탭에서 세그먼트 제어 샘플 옵션을 클릭합니다.
그런 다음 샘플 유형 하위 메뉴에서 PMA를 선택하고 배치 옵션을 클릭하여 데이터 집합에 포함된 모든 이미지의 세분화를 시작합니다. 다음으로, 샘플 유형 메뉴에서 이미지를 선택하고 디스플레이 이미지 데이터 버튼을 클릭하여 DNA 및 NET 마스크가 생성된 후 세분화에 대한 바이너리 이미지 마스크를 시각화하고 검증합니다. 이제 분석 탭에서 결정 임계값 버튼을 클릭하여 제어 샘플을 분석합니다.
그런 다음, 오른쪽에, PMA로 샘플 유형을 변경하고 자극 된 샘플의 분석을 완료하기 위해 세포 속성 얻기 버튼을 클릭합니다. 다음으로, 샘플 유형 하위 메뉴에서 이미지를 선택하고 디스플레이 이미지 데이터 버튼을 클릭하여 오버레이 및 셀 수 및 NET 형성 셀을 이미지에 표시합니다. 먼저 샘플 유형 하위 메뉴에서 샘플을 선택합니다.
개별 이미지는 분석을 위해 샘플 유형 하위 메뉴에서 선택하거나 배치 옵션을 선택하여 이미지의 전체 배치를 분석할 수 있습니다. 선택한 경우 분석 NETs 버튼을 클릭하여 분석을 완료합니다. NET 기준을 수동으로 조정하여 지정된 샘플에 대해 최적의 결과를 얻을 수 있습니다.
식별된 NET를 원본 이미지와 비교하여 식별 품질을 평가합니다. 이 단계가 완료되면 데이터 집합의 모든 이미지에 NET 기준을 적용할 수 있습니다. NET 기준에 대한 모든 변경 사항은 모든 제어 샘플에도 동시에 적용됩니다.
이미지 수, 이미지당 셀 수 및 이미지당 NET의 백분율이 표시되는 셀 데이터 하위 메뉴의 데이터 요약을 검사합니다. 출력 탭을 입력하여 결과 출력을 선택하고 봅니다. 출력 의 형태를 선택하고 출력 결과 버튼을 클릭하여 제어 및 PMA 처리 샘플 분석에서 생성된 다양한 데이터 출력을 탐색하고 비교합니다.
다음으로 결과 데이터 테이블 CSV 파일을 실행하여 단일 셀 데이터를 탐색하고 결과 PDF 파일을 클릭하여 샘플에서 NET 영역 분포 및 DNA 대 NET 비율을 시각화합니다. 빨간색 선은 그래프의 임계값을 나타냅니다. 마지막으로 결과를 클릭하여 분포 파일을 이동하여 DNA의 순 영역 과 모양을 결정합니다.
여기서, 제어 호중구의 15개의 심상 및 PMA 자극호성 호중구의 15개의 심상이 10분 이내에 분석되었다. 세포의 총 수는 계산되었고, 호중구 세포 외 트랩을 가진 세포의 백분율은 이 문서에서 설명된 자동화된 정량화 방법을 사용하여 결정되었다. 이러한 결과는 PMA 자극호중구가 더 큰 면적, 핵 변형의 증가, 대조군 샘플보다 더 높은 DNA 대 순 비율을 가지고 있음을 보여줍니다.
3D 그래프로 결합하면 PMA 자극 샘플은 제어 샘플보다 조임 그룹화 영역을 표시하는 경향이 있습니다. 절차를 시도하는 동안 워크플로우가 여러 기부자를 사용하여 테스트되었지만 사용자가 개별 데이터 집합에 따라 소프트웨어 매개 변수를 적절하게 결정하는 것이 좋습니다.
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개요
본 논문은 면역형광 이미지에서 호중구 세포외 트랩(NETs)을 정량화하기 위해 설계된 완전 자동화 소프트웨어인 NETQUANT를 소개합니다. 이 도구는 다양한 연구 조건에서 일관된 이미지 분석을 용이하게 하는 것을 목적으로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 면역학
- 이미지 분석
배경
- 호중구 세포외 트랩(NETs)은 면역 반응에서 중요한 역할을 합니다.
- NETs를 정량화하는 것은 다양한 질병에서의 기능과 영향을 이해하는 데 필수적입니다.
- 기존의 NET 정량화 방법은 사용자나 조건에 따라 일관성이 없을 수 있습니다.
- NETQUANT는 자동화를 통해 이 과정을 표준화하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- NETs 정량화를 위한 사용자 친화적인 소프트웨어를 소개합니다.
- 연구자가 여러 이미지에 대해 편향 없는 분석을 수행할 수 있도록 합니다.
- 단일 세포 데이터 분석 및 NET 형성 평가를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- Zenodo GitHub 아카이브 또는 Nordonfelt Lab 웹사이트에서 NETQUANT 소프트웨어 설치.
- 소프트웨어 인터페이스를 통한 분석 대상 소스 폴더 선택.
- NET 형성을 평가하기 위한 다중 기준 활용.
- 정량화를 위한 면역형광 이미지의 자동 처리.
주요 결과
- NETQUANT는 NET 정량을 위한 효율적인 접근 방식을 제공합니다.
- 이 소프트웨어를 통해 다양한 실험 조건 전반에 걸쳐 일관된 분석이 가능합니다.
- 연구자는 여러 이미지로부터 편향되지 않은 결과를 얻을 수 있습니다.
- 단일 세포 데이터 분석은 NET 형성의 이해를 높여줍니다.
결론
- NETQUANT는 NET를 연구하는 연구자들에게 가치 있는 도구입니다.
- 이 소프트웨어는 면역형광 연구에서 이미지 분석의 신뢰도를 향상시킵니다.
- 향후 연구에서는 NET 관련 현상을 더욱 정확하게 평가하기 위해 이 도구를 활용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NETs)의 자동 이미지 기반 정량 분석은 NET 형성의 객관적이고 고속 분석을 가능하게 함으로써 면역학 및 염증 연구의 결정적인 병목 현상을 해결합니다. 이러한 기능은 호중구 매개 경로, 염증성 질환 및 숙주 방어 기전에 초점을 맞춘 신약 개발 프로그램에서 타겟 검증과 기전적 리스크 감소를 지원합니다. 단일 세포 해상도 데이터와 NET 식별을 위한 표준화된 기준을 제공함으로써, NETQUANT는 전임상 모델의 예측 신뢰도를 높이고 면역학, 이미징 및 데이터 과학 팀 간의 교차 기능적 협업을 촉진합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 질환 모델에서 NETosis 경로 및 호중구 기능과 관련된 치료 가설의 조사를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 표면적 증가, DNA:NET 마커 단백질 비율, 핵 변형과 같은 생물학적으로 유의미한 파라미터를 제공하여 단일 세포 해상도로 NET 형성을 정의합니다.
- 예측적 가치: PMA와 같은 자극에 반응한 NET 형성을 정량화함으로써 기능적 표적 검증을 지원하며, 호중구 세포외 트랩 방출에 미치는 화합물의 효과를 평가할 수 있게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 면역형광 이미지로부터 표준화된 정량적 결과물을 생성함으로써, 후속 워크플로우를 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 재현성: 자동화된 임계값 결정 및 일괄 처리를 통해 여러 사용자 및 조건에 걸쳐 편향 없는 분석을 제공함으로써, 수동 및 반자동 방식의 주요 한계점을 해결합니다.
- 확장성: 실험 데이터 세트의 이미지 시퀀스를 10분 이내에 처리하는 사용자 친화적인 GUI 기반의 무료 앱을 통해, 스크리닝 준비 및 플랫폼 재사용을 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련성: 자가면역 질환, 암 전이 및 혈전성 질환과 관련된 과정인 NET 형성을 정량화함으로써 중개 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 전임상 연속성: 대조군과 자극군 샘플 간의 비교를 가능하게 하는 정량적 종속 변수 측정값(예: NET 형성 세포 백분율, NET 면적 분포)을 제공하여 위험 조정 기반의 추진 결정에 기여합니다.
- 기전적 위험 완화: DNA 형태 대비 NET 면적의 다변량 분석을 통한 예측적 위험 완화 가치에 집중하여, 면역 조절 화합물 스크리닝 시 작용 기전을 명확히 하는 데 도움을 줍니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
NETQUANT는 초기 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴 및 전임상 단계에 이르는 신약 개발 연속 과정에 적합하며, 특히 NETosis가 관련 병리 기전인 면역학 및 염증 중심 프로그램에서 유용합니다.
- 발견 생물학: 유전적 또는 약리학적 섭동에 반응하는 NET 형성의 자동 정량화를 가능하게 함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 면역형광 이미지의 자동 처리, 정량적 결과 도출, 배치 분석 기능을 통해 실험 조건 전반의 재현성을 보장하며 분석법의 준비 상태를 설명합니다.
- 분석: 이미지당 세포 수, 이미지당 NET 백분율, NET 면적 분포, DNA 대 NET 비율과 같은 측정 항목을 강조하여 연구팀이 조건을 비교하고 화합물 효과를 평가하는 데 도움을 줍니다.
- 중개 연구: 패혈증, 루푸스, 암 관련 혈전증과 연관된 NET 형성의 질환 관련 시스템 분석을 통해 이 방법론을 전임상 연속성과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 여러 사이트와 프로젝트 전반의 표준화를 지원하는 무료 소프트웨어를 제공하여, 이 방법을 일회성 기술이 아닌 재사용 가능한 역량으로 구성합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 예측 신뢰도 향상, 표적 검증, NETosis 경로의 기전적 모호성 감소.
- 운영적 가치: 사용자 및 사이트 간 이미지 기반 NET 정량화의 표준화, 재현성 및 확장성 확보.
- 전략적 가치: 염증 중심 약물 개발 프로그램에서 더 나은 go/no-go 결정, 자본 효율성 증대 및 후기 단계의 생물학적 리스크 감소.
- 포트폴리오 영향: 전임상 모델의 정량적 NET 형성 데이터를 기반으로 한 리스크 조정 우선순위 설정 및 추진 결정.
실행 시 고려 사항
- 면역형광 현미경 검사 및 이미지 분석 원리에 관한 전문적인 과학적 지식이 필요합니다.
- 형광 현미경 및 호환 가능한 이미지 파일 형식을 포함한 기기 및 분석 인프라가 필요합니다.
- 대조군 및 자극 샘플 전반에 걸친 채널 명명, 세그멘테이션 방법 및 NET 기준 적용을 위한 팀 간 표준화 요구사항이 필요합니다.
- 인간 대 생쥐 호중구와 같은 모델 시스템 및 PMA 이외의 다양한 자극 조건에 따른 적응 고려사항이 필요합니다.
- 소스 자료에 기반한 실제적인 제한 사항: 사용자는 개별 데이터 세트에 따라 소프트웨어 매개변수를 적절하게 결정해야 하며, 워크플로 검증을 위해 특정 세포 유형이나 염색 프로토콜에 맞는 최적화가 필요할 수 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Analysis and Quantification of Neutrophil Extracellular Traps (NETs)
2:19
Segmentation of Cells in the DNA Channel and the NET Channel
3:41
Single-cell Analysis of Identifiable Properties
4:19
Comparison of Cell Properties to Identify NET-forming Cells
5:23
Result Outputs Demeanor
6:16
Results: Analysis of NET Formation
7:07
Conclusion
