절연, 고정, 및 마우스 아드레날린의 면역 형광 이미징

면역 형광은 부신 조네이션, 세포 정체성 및 기능에 대한 부신 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이되는 기본 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 부신 조직의 형태를 유지하면서 여러 단백질의 연구를 허용한다는 것입니다. 뮤린 부신을 제거하려면 주변 지방 조직 주위를 자르고 얼음에 신선한 PBS가 들어있는 24 멀티웰 플레이트의 한 웰에 선선을 놓습니다.

해부 현미경으로 페트리 접시 또는 유리 지지체에 동맥을 옮기고 25 게이지 바늘을 사용하여 인접한 지방 조직을 제거하십시오. 모든 지방이 제거되면 2 시간 동안 흔들면서 섭씨 4도에서 4 %의 파라 포름 알데히드에서 조직을 수정하십시오. 인큐베이션이 끝나면 세면에 신선한 PBS를 1~2밀리리터로 섭씨 4도에서 15분간 씻어 내며 동맥을 헹구습니다.

마지막 세척 후, 잠복당 2 시간 동안 흔들로 섭씨 4도에서 두 개의 순차적 에탄올 몰입으로 동맥을 탈수합니다. 처리를 위한 부신 조직을 준비하려면, 거즈에 선을 감싸고 조직 포함 카세트에 부신을 감싸. 그런 다음 카세트를 처리 할 때까지 섭씨 4도에 70 %의 에탄올로 채워진 항아리에 놓습니다.

조직을 처리하려면 테이블에 표시된 대로 처리를 위해 카세트를 조직 프로세서에 삽입합니다. 프로그램이 끝나면 카세트를 녹인 65도 파라핀으로 채워진 임베딩 스테이션으로 옮기고 거즈를 풀기 위해 한 쌍의 집게를 사용합니다. 부신을 임베딩 몰드의 중앙에 있는 적절한 위치에 적정한 위치에 부드럽게 옮기고 녹은 파라핀을 동맥에 붓습니다.

그런 다음 포함 금형을 냉각 트레이로 조심스럽게 이동하여 파라핀의 경화를 용이하게 합니다. 로터리 마이크로톤으로 단면하기 전에 일련의 현미경 슬라이드에 라벨을 부착하고 슬라이드를 섭씨 37도 슬라이드워머에 놓습니다. 약 450마이크로리터의 오토클레이드 타입 1개의 초순수물을 각 슬라이드에 분배하고 마이크로톤의 절삭 두께를 5마이크로미터로 설정합니다.

임베디드 조직을 절삭 블록에 적재하고 샘플이 마이크로톤 블레이드의 가장자리와 얼굴 수준에 도달 할 때까지 파라핀 블록을 낮춥니까. 안정된 리듬으로 핸드 휠을 회전시키고 초기 트리밍을 수행하여 파라핀을 제거하고 부신 조직을 노출시합니다. 이어서, 집신의 끝을 통해 5마이크로미터 섹션을 획득하여 각 부분을 수집할 때 미리 표지된 슬라이드 중 하나에 물방울로 옮기한다.

현미경 검사법에 의해 섹션에 조직의 존재를 확인 한 후, 약 2 시간 동안 뜨거운 접시에 슬라이드를 건조하고 더 이상 물이 보이지 않는 때까지 섭씨 37도에서 슬라이드 트레이에 적어도 하룻밤 구울. 건조하면 슬라이드를 실온의 슬라이드 상자에 보관하십시오. 면역 불피성 항원 회수의 경우, 슬라이드를 5분 100% 자일렌 몰입체 2개로 분리한 다음 내림차순 에탄올 및 수질 침수 계열에서 재수화를 수행합니다.

물에 잠김한 후 슬라이드를 금속 슬라이드 홀더로 옮기고 홀더를 끓이는 0.01 대구식 구연산구를 뜨거운 접시에 10분 동안 끓입니다. 인큐베이션이 끝나면 뜨거운 플레이트에서 비커를 제거하고 20 분 동안 식히게하여 모든 부신 섹션이 여전히 버퍼로 덮여 있음을주의하십시오. 비커를 식히면 슬라이드를 코플린 항아리에 넣고 부드러운 흔들림으로 신선한 PBS에서 10분 동안 세 번 의 세워징을 합니다.

마지막 세척 후, 각 슬라이드의 표면을 조직 섹션을 손상시키지 않고 조심스럽게 닦고 소수성 마커를 사용하여 각 섹션 주위에 원을 만듭니다. 슬라이드를 가습 챔버에 놓고 실온에서 1시간 동안 각 섹션에 최소 50마이크로리터의 블로킹 솔루션을 신속하게 추가합니다. 차단 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 신선한 PBS에서 세 번 씻고 세척당 5분 동안 흔들리고 슬라이드를 챔버로 되돌려 보도록 합니다.

다음으로, 섭씨 4도에서 하룻밤 배양을 위해 각 섹션에 관심있는 1 차 적인 항체 칵테일을 추가하십시오. 다음 날 아침, 세척당 신선한 PBS로 15분 세척3개의 세척으로 샘플을 세척하고 빛으로부터 1시간 동안 적절한 이차 항체 용액으로 슬라이드에 라벨을 부착합니다. 인큐베이션이 끝나면 빛으로부터 보호되는 로커에 15분 동안 세 개의 세척으로 샘플을 세척하여 마지막 세척 후 빛으로부터 보호되는 실온에서 7분 동안 DAPI로 섹션의 핵을 표시합니다.

3개의 5분 PBS 세차재 후, 샘플당 하나의 커버 글래스 표면을 따라 면역 형광에 적합한 마운팅 에이전트 60 마이크로리터를 추가하고 각 슬라이드 티슈 섹션 쪽을 커버 글래스에 가볍게 눌러 거품을 피하십시오. 그런 다음 각 슬라이드를 어두운 용기에 평평하게 놓아 실온에서 이미징을 24시간 이상 치료합니다. 지방 제거 과정에서 탈수증이 조직 구조를 손상시킬 수 있으므로 부신이 건조시키지 않는 것이 중요합니다.

주변 지방 조직의 성공적인 제거에 따라, 부신은 여분의 눈에 보이는 지방없이 쉽게 감지 할 수 있어야합니다. 입증된 부신 부분의 면역 염색은 부신 세포의 핵 스테로이드성 인자 1개 염색, 수질 세포의 티로신 하이드록실라제 염색, 외부 캡슐의 비스테로이드성 세포의 핵 염색, 및 보조 음과 함께 염색하는 것을 보여준다. 이 절차를 시도할 때 마우스 부신이 작고 위치가 다소 가변적이라는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 해부 동안 이 지역을 명확하게 보는 것이 중요합니다. 이러한 절차는 생체 내 부신의 연구를 위한 기본적인 기술입니다. 이에 이어, 면역염색의 추가 방법은 특정 과학적 필요를 충족시키기 위하여 수행될 수 있습니다.

개발 후, 면역 염색은 생물 의학 분야의 연구원들이 많은 분야와 분야에서 유용한 도구인 현장 단백질 발현을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.