Name: 핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 학습하세요 NMR 분광법과 MST를 이용한 구형 및 섬유형 단백질 상호작용 측정 방법입니다. 안정 동위원소 표기 단백질을 활용하여 결합 친화도와 원자 수준 상호작용을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 NSERC RGPIN-2018-04994, 캠퍼스 앨버타 혁신 프로그램 (RCP-12-002 C) 및 앨버타 프리온 연구소에 의해 지원 되었습니다 앨버타 혁신적인 바이오 솔루션 (201600018), 미주리 및 게놈 캐나다와 캐나다 재단 수 여 / 혁신 부여 대사체학 혁신 센터 (TMIC)와 NANUC에 게 수 여 합니다.

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저자는 충돌의 관심을 공개.

2D 15N 해결 NMR 실험 중 가장 널리 사용 되는 상호 작용 하는 두 분자를 표시 하는 방법. 그것은 두 파트너의 신호 솔루션 상태에서 적정 실험을 통해 지속적으로 모니터링할 수 있는 가장 풍부한 정보 방법 이다. 비록 큰 단지의 경우 일반적으로 질적, 메서드 또한 사용할 수 있습니다 유리한 경우에 바인딩 선호도 측정 하기 위해 고해상도 스펙트럼에 NMR 신호를 추적할 수 있는. 할당을 편리 하 게 만들 수 있는 같은 크기, 20 kDa 아래 많은 단백질의 경우 바인딩 사이트도 매핑할 수 있습니다. MST 등 보완 분석 솔루션, 상호 작용에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하 고 레이블이 없는 상태에서 더 적은 단백질을 필요로. 돌연변이 바인딩 데이터의 비교는 상호 작용 NMR 라인 확대에 의해 입증 정품 되도록 컨트롤 하지 유물, 예를 들어 집계 또는 점도 변화를 제공 하는 데 유용.
단백질 표정
식 프로세스를 능률화 노동 집약적인 단백질 생산의 양을 줄일 수 있습니다. 이 최적화 프로세스의 일부 단백질의 재조합 표현에 대 한 대장균 의 적절 한 긴장의 식별을 포함 한다. 스트레인 설정 사용에서 벡터의 성격을 포함 한 요소에 따라 달라 집니다 그리고, 좀 더 구체적으로, 재조합 단백질의 궁극적인 안정성 표현7. 위험 내 인 성 대장균 에 의해 분리 단백질의 저하의 프로 테아 제 효소의 사용에 의해 감소 될 수 있다 부족 대장균 BL21 긴장 등. 드문 codons를 포함 하는 유전자, BL21-CodonPlus (DE3) RIPL 같은 스트레인 선호 수 있습니다. 이 긴장은 아르기닌, 이소류신, 프롤린, 및 신에 대 한 드문 codon tRNAs의 추가 생 복사본 BL21 스트레인의 효소 결핍 자연을 결합 한 제품. 또는, 드문 codons overexpression를 손상 시킬 수 있는 상업적인 소스에서 하는 코 돈 최적화 구조를 주문 하 여 피할 수 있습니다. 많은 변종 대장균 의 재조합 유전자 발현에 대 한 사용할 수 있습니다, 그리고 각 식7동안 특정 한 문제를의 우회에 대 한 최적화 합니다. 이 연구의 경우 표준 효소 결핍 스트레인 BL21(DE3) 후속 정화 및 분석에 대 한 수용 성 단백질의 충분 한 수량을 생산.
단백질 정화
주어진된 단백질에 대 한 정화 프로토콜은 종종 각 단백질 안정과 녹는 온도, 소금 농도, pH 등 다른 조건 하에서 유지 하는 의미에서 고유 합니다. 친화성 크로마토그래피를 통해 정화의 전반적인 효과 또한 정화 과정에서 다양 한 단계에서 이미 종 방출의 농도에 민감합니다. 이 작품에서 아이맥에 대 한 중요 한 버퍼 조건-PRD, 전자에 대 한 pH와 이미 농도 VimRod에 대 한 했다. 7.5의 pH 초기 차입 아이맥 열에서 다음 E-PRD의 강수량을 피하기 위해 필요 했다. VimRod의 아이맥 정화 열 세척 단계에서 이미 30에서 50 m m의 농도 증가 최종 차입 분수의 순수성에 있는 상당한 개선을 발견 됐다. 차입 단계에 이미 250에서 350 m m의 농도 증가 또한 발견 됐다 최종 차입의 수율을 향상 시킵니다. 초기 시도 이미 250 m m를 사용 하 여 단백질을 elute 이끌어 냈다 VimRod의 불완전 한 차입 열 (데이터 표시 되지 않음)의 최종 1 M 이미 스트립에 의해 밝혀. 350 m m는 차입에 대 한 이미 농도 증가 모든 단백질은 열에 바인딩된 복구 하기에 충분 했다. 버퍼 exchange를 동시에 수행 하는 동안 단백질 정화에 대 한 연마 단계 역할을 하므로 S 이중 목적을 검색할 수 있습니다. 버퍼 교환 His6 태그 단백질을 elute 데 이미 제거 이후 후속 바인딩 분석을 위한 중요 한 단계입니다. 그것은 또한 소금 농도 등 특정 다운스트림 기술 또는 분석 실험의 효능에 영향을 미칠 수 있는 pH 조건을 변경할 수 있는 기회 역할을 합니다. 단백질 열 변화 (점) 요구에 대 한 안정적인 단백질 그들을 위해 특히 다운스트림 분석 실험에 대 한 최적의 버퍼를 식별 하는 데 수 시간 실내 온도8,9에서 장기간.
바인딩 분석
갓 준비 단백질은 냉동된 단백질 결과 비교으로 사용할 수 있습니다 또한 비록 정확한 바인딩 분석 실험, 중요 합니다. Filamentous 단백질 vimentin multimerize 소금 및 pH 의존 패션, 같은 따라서 솔루션 최적화 될 필요가 및 초10,11, 동적 빛 비 산 같은 방법으로 추정 oligomeric 상태 조건 12 또는 분석 ultracentrifugation13,,1415. NMR 분광학은 리간드 원자 해상도 작은 단백질의 상호 작용을 측정 하기 위한 적합 합니다. 그러나, 큰 분자와 상호 작용 하는 단백질, 느린 연속 ensues, 그리고 비록 그것이 반드시 바인딩을 확인할 수 신호의 손실 발생 때 허용 요구 하는 것 또한 할당의 적어도 사이트 바인딩의 백본 공명입니다. 이 시나리오에서는 NMR 실험 상호 작용 사이트의 식별을 허용 하지 않습니다. 따라서 사이트 감독 mutagenesis 바인딩에 대 한 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하기 위해 적용 됩니다. 따라서 이러한 돌연변이 신호 손실을 전시 하지 않습니다. 이 프로토콜에서 위치 1914에서 대체 된 돌연변이 형태 VimRod의 존재에 피크 농도 유지 하 고 따라서 전자-PRD 및 VimRod의 상호 작용의 확인 합니다. 백본 및 sidechain 공명의 할당 것 추가할 값이 방법 특히 무료 전자-PRD의 구조 엑스레이 결정학4에 의해 해결 되었습니다. NMR의 미래 응용 프로그램 더 큰 분자 사이 복잡 한 상호 작용의 묘사 포함 그리고 매우 높은 분야 자석 및 13등 다른 관찰 그룹의 사용을 누릴 것입니다 C 표시와 기자로 trifluoro 메 틸 그룹.
MST는 바인딩 상호 작용16공부에 대 한 이점이 있다. 바인딩 파트너는 솔루션에서 자유롭고 하지 고정입니다. 샘플의 품질의 분석 소프트웨어 품질 관리 집계의 보고, 모 세관 또는 부족 한 형광 라벨 부착 대상 분자의 흡착에 내장 되어있습니다. 대상의 작은 금액은 일반적으로 사용 하는, 레이블이 지정 된 대상의 농도 일반적으로 10-20 μ 볼륨/반응에 20-50 nM 사이. 이 프로토콜 특징을 약한 바인딩 상호 작용을 허용 하는 titrations에서 달성 될 수 있다 ligand의 농도 극대화 하기 위해 매우 작은 반응 볼륨 (10 μ)을 사용 합니다. 이 정확한 pipetting 및 아직도 철저 하 게 혼합 하는 동안 거품을 도입 방지로 이동 되 고 치료를 필요로 합니다. 적절 한 혼합 하는 것이 직렬 희석의 설정에 따라 정확 하 고 일관 된 형광 측정에 대 한 중요 합니다. MST 실험에서 트윈 20 양의 표준 거품을 만들고 혼합 향상의 경향이 낮은 0.05% ~ 0.015%에서에서 감소 되었다.
레드-트리 스-NTA 염료는 그의 어떤 단백질을 붙일, 쉽고 빠르고 편리한 방법을 제공 합니다 태그. 라벨은 효과적으로 30 분만에 완전 한 이며 매우 빡 빡 아무 염료 제거 절차는 필요. 아니 수정 ligand 바인딩 속성을 변경할 수 있는 단백질에 있는 아미노산 잔류물에 만들어집니다. 경고를 붙일만 단백질 His6 태그에 있어야 한다 이다. 이 ligand 단백질, E-PRD, 그리고 태그와 uncleaved E-두 번째 아이맥 열 단계 PRD의 제거에서 태그의 분열을 필요합니다. Ligand 단백질은 그의의 사용 하지 않고 준비 하는 한다 만약에 가능 하다 면, 태그. 또는 단백질 covalently 아민 리 진 잔류물 또는 thiol 시스테인 잔류물에 커플링 커플링을 통해 fluorophore로 표시 될 수 있습니다. 그러나, 해야 합니다 주의 정전기 또는 극 지 바인딩 상호 작용 lysine 또는 시스테인 잔류물에 영향을 미칠 수는 fluorophore의 공유 첨부 파일부터 이러한 시스템을 사용 하는 경우. VimRod 및 E-PRD MST에 의해 사이 친 화력 바인딩 정량화 소금 농도에 유난히 민감한 했다. 이 문제는 처음 분석 결과 버퍼의 동일한 배치에 대상 및 리간드를 dialyzing에 의해 완화 되었다. 그럼에도 불구 하 고, VimRod의 복잡 한 동작으로 인해 150 m m NaCl의 MST 분석을 수행할 때 채도 MST 바인딩 곡선의 달성 하지 수 없습니다. 안정적이 고 완전 한 데이터 얻은 일단 NaCl의 농도 KD의 정확한 계산을 허용 하는 10mm 낮아졌다. 따라서, 주의 최적화 솔루션 조건 및 보완 분석 실험과의 비교는 강력한 결과 얻을 수 것이 좋습니다. 또한, MST 주어진된 상호 작용에 대 한 소금 의존도 계량, 효소 반응 속도 론17에 단백질 상호 작용, 모니터 단백질 폴딩, 및 검색의 화학 량 론 속성을 계량을 사용할 수 있습니다.

단백질 사이 상호 작용 분자 기계 세포 내에서 순서를 형성을 수 있습니다. 개별 상호 작용은 종종 약한 하지만 일반적으로 협력 하 고 동적으로 규제 될 수 있는 multivalent 복합물에 기여. 민감한 분석 원자 해상도 같은 복잡 한 상호 작용에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하는 메커니즘을 추론 하 고 마약 같은 분자 같은 개입 디자인 필요 하다. NMR 분광학 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 얻기 위해 효율적인 방법 이며 또한 약하게1을 포함 하는 ligands에 대 한 빠른 검사에 사용 됩니다. NMR 방법은 사용 하는 단백질을 관찰 또는 ligand 관찰로 분류할 수 있습니다. 이 원고는 안정 동위 원소 라는 비교적 작은 (보통 아래 20 kDa) 단백질의 스펙트럼을 획득 하 고 레이블 없는 ligand 적정 전 접근 방식을 사용 합니다. 이 레이블이 잔류물 유리한 경우를 상호 작용에 관련 된 수 있습니다. 일단 복잡 한 형태 변경으로 화학 변화에 자신을 매니 페스트 상호 작용 잔류물의 화학 환경 및 그들의 NMR 신호 모양에 변화가 있다. 이러한 변경의 정도 상호 작용에서이 그룹의 관련의 학위와 상관 한다. 화학 변화 물결 (Csp)는 일련의 부재는 ligand의 변화량의 존재에서 수집 하는 단백질의 NMR 스펙트럼을 비교 하 여 측정할 수 있습니다. 큰 ligands, 복잡 한 상호 작용에 대 한 상호 작용을 추론할 피크 모양 또는 강도에 변화를 측정할 수 있습니다.
Ligand 상호 작용 검출을 위해 사용 하는 가장 일반적인 2D 실험은 15N heteronuclear 단일 양자 상관 (HSQC) 실험2. 15N, 일반적으로 15N-풍부한 미디어에서에서 자란 대장균 세균성 문화에서 선호도 태그 버전으로 그들을 표현 하 여 달성 한 단백질 붙일 균일 하 게 해야 합니다. 바인딩 때 명백한 적정 동안 수집 HSQC 스펙트럼 겹쳐 있다 복잡 한 형성에 관련 된 잔류물의 하위 집합에 대 한 피크 변경 공개. 상호 작용은 자유롭고 ligand 포화 상태 신호 한 인구 평균 피크로 축소 빠른 교류 정권에서 발생할 수 있습니다. 또는, 느린 교류 미국, 경우 두 신호 그들의 상대적인 양을 나타내는 전체와 함께 관찰 된다. NMR lineshape 분석은 어떤 경우에 바인딩 친 화력 예측을 사용할 수 있는, MST 같은 방법 또한 편리한 입증 하 고 진짜 상호 작용의 교차 유효성 검사를 제공 합니다.
제공 되는 예제의 desmosomes에서 발견 하는 두 단백질입니다. 그들은 중재 골격 및 세포 표면 사이의 접합 및 세포 접착 기계와 피부의 무결성을 유지 하기 위해 중간 필 라 멘 트 사이 multivalent 상호 작용을 중재 심장 조직과의 견딜 힘을 전단. 질병은 desmoplakin 등 vimentin desmosomal 단백질 돌연변이 또는 셀 접합의 불안정에 지도 하는 신경에 의해 손상 되 고 그러므로 그들의 상호 작용의 중요3때 발생할 수 있습니다. 동안 상호 작용 MST에 의해 양이 정해질 수 있다 ligand 바인딩 desmosomal 단백질에 의해 구조적으로 NMR 분광학, 특징 될 수 있습니다. 방법은 여기 plakin 반복 (PRDs) 종종 기본 홈을 제공 하는 직렬 식 집합으로 존재 하는 도메인과 vimentin, 그것의 나선형에서 제공 하는 산 성 표면을 통해 서 상호 작용 하는 중간 필 라 멘 트 사이 상호 작용 하 사용 되었다 번들4. 이 단지 그들은 조직을 통하여 발광 하는 접착제의 네트워크 형성, 인접 한 셀에 연결 하는 desmosomes 세포 골격의 중간 필 라 멘 트에 대 한 앵커 세포 막에서 형성 된다.

<table><tbody><tr><td>Monolith NT.115, 제어 및 분석 소프트웨어 포함</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-G008</td><td>현미경 열영동용 기기</td></tr><tr><td>His-Tag 라벨링 키트 RED-Tris-NTA</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-L008</td><td>RED-tris-NTA 염료 MST</td></tr><tr><td>표준 모세관</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-K022</td><td>모세관 MST</td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>IMAC 컬럼</td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA 수지, 100mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td>IMAC 수지</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>SEC 컬럼</td></tr><tr><td>TEV 프로테아제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4455</td><td>E-PRD</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td>단백질 발현을 위한 세포</td></tr><tr><td>cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일 정제 EDTA-Free</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td>IMAC</td></tr><tr><td>TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td>단백질 정제용 환원제</td></tr><tr><td>시약(HEPES, NaCl 등)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>다양한</td><td>배지 및 완충액 제조</td></tr><tr><td>염화암모늄 (15N, 99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td> NMR D2O, 중수소산화물(D, 99.8%)에 대한 <td>NLM-467</td><td>동위원소 라벨링</td></tr><tr><td></td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2259</td><td>NMR 시료 준비</td></tr><tr><td>DSS, 나트륨 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-8206</td><td>참조 NMR</td></tr><tr><td>정밀 5mm NMR 튜브, 7인치 길이의</td><td>SJM/Deuterotubes</td><td>BOROECO-5-7</td><td>NMR 튜브</td></tr><tr><td>NMR 분광계(14.1 Tesla)</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR 데이터</td></tr><tr><td>수집 TCI 5mm z-PFG 극저온 프로브</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR 데이터</td></tr> 획득<tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker TopSpin 4.0.1</td><td>NMR 데이터 MO의</td><td>Bruker</td><td></td> 처리</tr><tr><td>. </td><td>Monlith NT.115 MO에 포함된</td><td>NanoTemper 제어 기술</td><td></td></tr><tr><td>. </td><td>Monlith NT.115에 포함 된</td> 친화도 분석 <td>NanoTemper 기술</td><td></td></tr></tbody></table>

핵 자기 공명 분광학 (nmr)와 미 thermophoresis (mst) 구형 및 filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous 단백질 vimentin 같은 조직 구조 비 계 사이트 plakin를 포함 하는 단백질을 제공 하 여 세포 내에서 반복을 제공 합니다. 여기, 감지 하 고 이러한 상호 작용을 측정 하는 프로토콜은 envoplakin의 구형 plakin 반복 도메인 vimentin의 헬리컬 코일을 사용 하 여 설명 합니다. 단백질 vimentin (또는 유사한 filamentous 단백질) 바인딩 여부 결정 및 상호 작용의 선호도의 측정 기준을 제공 합니다. 관심의 구형 단백질 15N으로 표시 하 고 솔루션에서 vimentin 단백질으로 적정. 2 차원 NMR 스펙트럼 피크 모양 또는 화학 변화, 변화를 관찰 하 여 상호 작용을 검출 하 고 소금 수준, vimentin 제 사기 구조 영향을 포함 하는 솔루션 조건의 효과 명료 하 게 취득 된다. 관심사의 단백질 filamentous ligand 바인딩, 바인딩 상호 작용 순화 된 단백질을 사용 하 여 MST에 의해 정량입니다. 접근 관심의 단백질 필 라 멘 트, 바인딩 여부 결정 및 변경, 돌연변이 등 솔루션 조건, 상호 작용에 미치는 영향을 평가 하기 위한 간단한 방법입니다.

E-PRD 도메인 (pProEX-HTC로 복제 하는 잔류물 1822-2014) 인간 envoplakin 유전자와 VimRod 도메인 (99-249 pET21a로 복제 잔류물)의 인간의 vimentin의4 His6 태그로 표현 되었고 정화. 그림 6 과 그림 7 VimRod의 순수성의 수준을 보여주는 (18.8 kDa) 및 E-PRD (21.8 kDa) 단백질 정화의이 방법에서 얻은. His6 E-PRD 구문에서 태그는 필수적 MST 실험에 대 한 VimRod 단백질 His6 태그 바인딩 염료를 사용 하 여 표시 됩니다 및 모든 E-PRD의 His6 태그를 유지 수 있습니다 염료의 바인딩에 대 한 경쟁의 제거. TEV protease와 태그의 분열 후 두 번째 아이맥 열 TEV protease, 쪼개진된 태그 및 어떤 uncleaved His6-E-PRD 남아 제거 합니다. 정화의 최종 연마 단계는 크기 배제 크로마토그래피 이다. 불구 하 고 두 단백질 비슷한 크기의,는 VimRod E-PRD 차입 피크 가운데 72 mL이이 크기의 단백질 단위체 것 이라고 예상 하는 어디에 하는 동안 51 mL에 열에서 elutes. VimRod의 크기에서 명백한 증가 때문에 가능성이 높습니다는 filamentous 긴 막대와 그것의 특성 모양의 단백질으로 분석 ultracentrifuge 실험 시연 VimRod 단위체4했다. 단백질의 낮은 수율 M9 보다 최소한의 미디어에서 생산 되는 셀의 낮은 금액으로 인해 풍부한 국물에서 성장 하는 문화에서 얻을 수 있습니다. TB에 M9 준비에 대 한 더 큰 시 동기 문화의 초기 성장 15N NMR 실험에 필요한 라벨의 범위를 유지 하면서 셀 수율의 개선 수 있습니다.
15N-1H HSQCs VimRod (그림 8A-8 D)의 유무에서 야생 유형 및 E-PRD의 R1914E 돌연변이 대 한 인수 했다. 그림 8A 에 E-PRD의 스펙트럼 잘 해결된 봉우리, 제대로 접힌된 단백질의 지표의 예상된 번호를 보여 줍니다. VimRod (그림 8B)의 존재는 스펙트럼 광범위 한 라인 확장 하 고 해당 E-PRD와 VimRod 간의 바인딩을 하 피크 실종 보여줍니다. 이 바인딩은 그림 8C 8d와비교 하 여 입증 R1914E의 돌연변이 의해 손실 됩니다. 작은 변화는이 돌연변이 전자-PRD와 VimRod 간의 바인딩의 부족을 나타내는 R1914E 돌연변이 VimRod의 추가 따라 스펙트럼에서 관찰 됩니다. VimRod의 존재/부재에 E-PRD 피크 농도 비교 되었고 그림 8E, 피크 E-PRD 복잡 한 확대의 범위를 나타냅니다에 상대적인 피크 농도로 꾸몄다. E-PRD (표시 되지 않음)의 R1914E 돌연변이 야생 타입 (그림 8E)에 대 한 약 20%에 비해 VimRod의 존재에 20% 또는 더 높은 피크 농도에서 봉우리의 약 97%를 유지. 손실 함수 점 돌연변이, 중간 효과 또한 데 추가 돌연변이와이 대표는 공부4되었습니다 데.
확인 하 고 VimRod 및 E-PRD MST 분석 대상으로 형광 레드-트리 스-NTA 염료와 함께 표시 하는 His6-VimRod를 사용 하 여 바인딩을 quantitate 39.1에 1.28 m m에서 E-PRD ligand의 농도 감소와 혼합 nM 수행 했다. 세 가지 바인딩 titrations 실행 되었다 그리고 결과 평균 하 고 그림 9에 나와 있습니다. 데이터 1-사이트 ligand 바인딩의 표준 모델에 맞게 됐다 고 25.7 ± 2.1 μ M의 KD 를 주었다. 표면 플라스몬 공명에 의해 VimRod와 E-PRD 간의 바인딩 평가 19.1 ± 1.3 μ M4의 비슷한 KD 값을 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> 그림 1: NMR 실험의 설정의 화면 캡처. 표시 창 HSQC 데이터 집합을 수집 하는 표준 실험을 설정 하는 데 사용 됩니다. 실험 매개 변수는 읽습니다 실험에 인접 한. 표시 하는 ZGPR 실험 표준 및 솔벤트 종속 양성자 매개 변수를 로드 하는 초기 실험으로 선택 됩니다. 제목 창 기록 유지 목적에 대 한 실험 정보를 입력 하는 데 사용 됩니다. HSQC 스펙트럼 수집 ZGPR 실험 SFHMQC3GPPH로 대체 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> 그림 2: NMR 실험 매개 변수 조정. 표시 창 NMR 펄스 시퀀스에 대 한 기본 매개 변수를 입력 하기 위한 신호를 최적화 하기 위해 사용 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> 그림 3: NMR 데이터 처리. 2 차원 NMR 스펙트럼의 각 처리에 사용 하는 매개 변수는 일반적으로 조정 하는 그를 나타내는 화살표와 함께 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> 그림 4: NMR 피크 따기에 대 한 매개 변수. 처리 NMR 스펙트럼에서 NMR 봉우리를 따기 위해 사용 되는 매개 변수는 일반적인 값으로 표시 됩니다. Ppm 범위, 강도 및 스펙트럼을 최적화 하는 봉우리의 수를 조정 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> 그림 5: 농도와 대표 Peaklist. 숫자, 그리고 그것의 1H NMR 스펙트럼에서 선택은 각 피크 주어진 15N 화학 교대와 신호 강도 표시 됩니다. 이 peaklist 다음 파트너를 상호 작용의 존재/부재에서 얻은 스펙트럼 비교를 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> 그림 6: IMAC와 S. A. VimRod His6 태그의 정화 아이맥 열에서 차입에 대 한 크로마 VimRod의 한 주요 피크를 보여준다. B. 크로마 S 열에서 차입에 대 한 하나의 주요 피크를 보여준다. C. SDS 페이지 분수의 정화의 과정을 통해 수집:는 MW MW 기준 kDa는 젤 (M), 세포 lysate (1), 아이맥 흐름 (2), 세척 (3), 풀링된 차입 (E1)의 왼쪽에 풀링된 S 차입 (E2)에 표시 된. 밴드 레인 E1 및 e 2에 더 높은 분자 무게에서 보이는 서쪽 오 점 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 확인으로 순수한 VimRod의 올리고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> 그림 7: IMAC와 S. A. E-PRD의 정화 SDS-PAGE는 MW와 분자량 표준 보여주는 아이맥 정화의 첫 번째 아이맥 열 (E1)는 TEV 분열 제품 (+ TEV)에서 왼쪽 젤 (M)과 eluate의 kDa에 표시 및 두 번째 아이맥 열 (피트)에서 통해 흐름. B. 크로마 토 그래프 S 열에서 하나의 주요 피크를 보여준다. C. 분자량 표준 (M) 및 S 피크에서 분수의 SDS 페이지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> 그림 8: 야생-타입 및 존재에 E-PRD의 R1914E 돌연변이 VimRod의 부재의 HSQC 스펙트럼. HSQC 스펙트럼 표시 야생-타입 E-PRD (100 µ M) 20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 부재 (A) 또는 50 µ M의 존재에서 pH 7에서에서 VimRod (B). 패널 C와 D는 R1914E 돌연변이 (100µM)의 HSQC 스펙트럼 50 µ M의 존재 또는 부재에 VimRod, 각각. 패널 E 상대 1H-15N 피크 농도 또는 VimRod 바인딩 없이 E-PRD의 최대 수는 임의로 할당 되며 순서 위치를 기반으로 하지의 기능으로 표시 됩니다. 이러한 값 의미 컷오프는 ligand의 추가 따라 피크 강도 감소에 대 한 정의를 사용할 수 있습니다. 할당을 사용할 수 중요 한 값은 바인딩 영역에 매핑할 종종 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> 그림 9: E-VimRod에 PRD의 바인딩. E-PRD 39.1에 1.28 m m에서 두 배 희석의 일련에 희석은 nM MST 분석을 수행 하기 전에 레이블된 VimRod와 인 큐베이 팅 하 고. 3 개의 독립적인 분석에서 데이터를 결합 했다. 데이터는 주는 ± 2.1 μ M의 KD 자신감과 25.7 μ M의 KD KD 모델에 적합 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>수량</td>
		</tr>
<tr>
<td>염기 인산 나트륨 (무수)</td>
			<td>6.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>이수소 칼륨 인산 염 (무수)</td>
			<td>3.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화 나트륨</td>
			<td>0.5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>최대 950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. M9 동위 원소 라벨에 대 한 미디어입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>수량</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 NH4Cl</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>포도 당 (또는 13C-포도 당)</td>
			<td>2.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50mm CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL 티 아민</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3mm FeCl3
</td>
			<td>400 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>금속 혼합 (표 3)</td>
			<td>500 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>최대 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. 영양 보충의 M9 미디어 믹스입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>수량</td>
		</tr>
<tr>
<td>4mm ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1mm MnSO4
</td>
			<td>75.5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.7 m m H3보3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.7 m m CuSO4
</td>
			<td>55.9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>최대 500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3입니다. 금속 혼합 농축 산 영양 혼합에 대 한 보충.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>샘플</td>
			<td>1mm E-PRD 버퍼 A1 (µ L)</td>
			<td>버퍼 A (µ L)에서 1 m m VimRod</td>
			<td>버퍼 (µ L)</td>
			<td>200 µ M DSS D2O (µ L)</td>
			<td>버퍼 B2 (µ L)</td>
			<td>총 볼륨 (µ L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD 혼자</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 버퍼 a: 20 mM Tris HCl, 1mm DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 버퍼 b: 23 mM Tris HCl, 1.14 m m DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 4입니다. NMR 샘플 준비입니다.

여기, 안정 동위 원소와 핵 자기 공명 (NMR) 분광학 및 눈금을 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용의 후속 묘사는 생산 및 분류는 단백질의 정화에 대 한 프로토콜 선물이 Thermophoresis (MST) 실험입니다.

핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

이 방법은 단백질이 작은 분자 또는 큰 분자에 직접 결합하는지 와 같은 단백질 상호 작용 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 원자 수준에서 직접 상호 작용을 감지하는 간단하고 빠른 방법이라는 것입니다. 배출 명령 ej로 공기 흐름을 켭니다.이것은 자석에서 샘플을 가져올 것이다. 이제 개구부에서 자석 위에 스피너 내에 샘플을 배치합니다. 명령 ij와 함께 삽입합니다.샘플이 진행하기 전에 자석 내부에 정착 할 때까지 기다립니다. 실험 ZGPR을 선택하여 edc 명령 및 로드 표준 양성자 NMR 매개 변수를 사용하여 새 데이터 집합을 만듭니다. NAME, 실험 번호 및 처리된 데이터 폴더 번호 필드를 입력합니다.세트 용매 필드에서 용매를 선택하고 표준 프로브헤드 및 용매 종속 파라미터를 읽기 위해 getprosol 실행을 클릭합니다. 잠금 명령을 사용하여 공단된 용매에 샘플을 잠그고 스위핑이 완료되고 잠금이 완료될 때까지 기다립니다. 자동 튜닝 명령 atma를 사용하여 샘플을 튜닝하여 자석의 공진 주파수를 수정합니다.자동 튜닝이 완료될 때까지 흔들림 곡선을 모니터링합니다. 상판을 사용하여 자기장을 심. 쉬밍은 자기장을 조정합니다.샘플 주위의 균일성을 달성합니다. 이 값을 명령 wsh로 값에 저장하고 동일하거나 유사한 샘플을 사용하는 경우 topshim 전에 rsh를 사용하여 읽는 것이 좋습니다. 이제 rga 명령으로 수신기 게인을 조정하여 최대 신호 대 노이즈 비율을 달성합니다.스펙트럼의 중심을 물 공명 오프셋에 놓고 calibo1p1을 사용하여 90도 양성자 펄스를 고출력으로 설정합니다. 제로 이동 zg 명령을 사용하여 양성자 스펙트럼을 수집하고 efp로 처리합니다. 여기에는 지수 곱셈, 라인 확대를 통합한 무료 유도 붕괴, FID의 Fourier 변환 및 위상 보정을 적용하는 pk가 포함됩니다.통합 옵션 없이 다항형을 사용하여 자동 위상 보정 APK 및 자동 기준 보정 absn을 적용합니다. 실험에서 SFHMQC3GPPH를 선택하여 SOFAST HMBC 실험에 대한 새 데이터 집합을 만듭니다. p1이 최적화된 P1 값인 명령 게프로졸 1H p1 plw1을 이용하여 양성자 스펙트럼으로부터 최적화된 P1 및 O1을 복사하고 P1 의존펄스를 채우고, plw1은 P1의 전력 레벨이다. 이제 CNST54 상수를 최적화하여 아미드 화학 적 변화에 대한 오프셋을 설정합니다.또한 CNST55를 최적화하여 관심 있는 스펙트럼 영역을 포괄하기 위해 대역폭을 정의하여 수신기 게인을 최적화할 수 있습니다. 이러한 매개 변수를 선택하려면 2차원 스펙트럼에서 첫 번째 FID를 추출하고 관찰된 신호를 찾아 이를 정의합니다. 또한, 이완 지연, 스캔 수 및 더미 스캔을 다양하게 하여 명령 gs로 허용 가능한 신호 감도를 얻을 수 있으므로 실시간으로 데이터 품질을 모니터링할 수 있습니다.마지막으로 제로 고 zg를 사용하여 스펙트럼을 기록합니다. 간접 차원에서 선택적 선형 예측을 사용하여 처리 매개 변수를 스펙트럼의 직접 F2 및 간접 F1 치수의 크기로 설정합니다. QSINE를 창 함수로 선택하고 2차원 스펙트럼을 처리하기 위해 2개의 새종 이동을 입력합니다.명령 xfb를 입력하여 창 함수와 Fourier 변환을 사용하여 양방향으로 데이터를 처리합니다. 명령 apk2d를 사용하여 양방향으로 자동 위상 보정을 수행합니다. 2D 데이터에 대한 자동 기준 보정 함수 abs2로 기준선을 수정합니다.이렇게 하면 처리 매개 변수에 정의된 ppm 값 사이에 다항함수가 적용되고 추가 분석을 위해 2D 스펙트럼을 생성합니다. 상호 작용 데이터를 다른 분자와 비교하기 위해 직렬 처리를 수행하려는 경우 처리 매개 변수를 명령 wpar로 저장하고 rpar로 회수합니다. 피크 따기 과정을 시작하려면 명령 pp를 입력합니다.예상 피크를 기준으로 ppm 범위, 최소 강도 및 최대 피크 수를 정의합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 육안으로 결과를 확인합니다. 필요한 경우 스펙트럼 품질에 따라 결과가 만족할 때까지 프로세스를 다시 실행합니다.pp 명령으로 피크 목록을 생성합니다. 이 피크 목록에는 기본적으로 데이터 높이 및 최대 강도 정보가 포함되어 있습니다. 피크 목록은 후속 스펙트럼으로 내보낼 수 있으며 다른 프로그램에서 읽을 수 있습니다.이제 다른 분자와의 상호 작용을 나타내는 화학 적 변화의 피크 강도 또는 운동의 변화에 대한 단백질 HSQC 스펙트럼을 관찰한다. 상호 작용 분자가 큰 경우, 일부 피크의 실종과 함께 피크 강도의 감소를 기대합니다. 피크 탭을 클릭하고 피크 창에서 마우스 오른쪽 클릭으로 가져오기를 선택하여 다음 데이터 집합으로 피크 목록을 가져옵니다.스펙트럼을 통해 피크를 시각화하고 필요한 경우 새 위치로 이동합니다. 전체 테이블의 재설정 강도를 클릭하여 강도를 포함하는 스펙트럼에 대한 피크 목록을 생성합니다. 이 피크 목록은 저장된 피크 목록에서 위치 정보를 전달합니다.내보내기 함수를 선택하여 분석을 위해 다른 데이터 집합에서 스프레드시트 또는 기타 수학 프로그램으로 피크 목록을 내보냅니다. 복잡한 스펙트럼의 기능 피크 강도, 각 피크에 대한 단백질 스펙트럼의 피크 강도로 피크 강도의 변화를 계산합니다. 값을 곱셈에 곱하여 백분율 변경으로 변환할 수 있습니다.피크 볼륨은 피크 강도가 서로 가까이 위치한 피크를 측정하기 쉽지만 일반적으로 상대적으로 넓은 피크의 밀도가 높은 단백질의 경우와 같이 유용합니다. N15HSQC는 VimRod의 존재 또는 부재에서 야생 형 E-PRD뿐만 아니라 R1914E 돌연변이를 위해 인수되었다. 야생 형 E-PRD의 스펙트럼은 제대로 접힌 단백질을 나타내는 잘 해결 된 피크의 예상 수를 보여줍니다.VimRod가 있는 동안 스펙트럼은 E-PRD와 VimRod 사이의 바인딩에 해당하는 광범위한 라인 확대 및 피크 실종을 보여줍니다. R1914E 돌연변이의 스펙트럼과 VimRod를 추가하면 이러한 돌연변이 E-PRD에 결합이 부족하다는 것을 나타내는 작은 변화가 관찰됩니다. 여기서 VimRod의 존재와 부재에 있는 E-PRD 피크 강도는 E-PRD 복합체에서 피크 확대의 범위를 나타내기 위하여 상대피크 강도로 비교되고 플롯되었습니다.VimRod 및 E-PRD의 결합을 검증하고 양화하기 위해 형광 RED-tris-NTA 염료로 표지된 His6-VimRod를 사용하여 MST 분석을 대상으로, E-PRD 리간드의 농도 감소로 수행되었다. 데이터는 1사이트 리간드 바인딩의 표준 모델에 적합했으며 KD를 25.7 플러스 또는 마이너스 2.1 마이크로몰러로 제공했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동일한 획득 및 처리 조건을 사용하는 것이 중요합니다.NMR 스펙트럼의 수집을 위한 동위원소 표지단백질 견본에 접근 때문에 투쟁할 것입니다. 이 기술의 의미는 암의 치료로 확장, 감염, 또는 신경 퇴행성 질환 그들은 질병에 손상 된 단백질 상호 작용의 형성을 포함 하기 때문에.

measuring-interactions-globular-filamentous-proteins-nuclear-magnetic

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

핵자기공명분광법(NMR) 및 미시적 열영동(MST)을 통한 구형 단백질과 필라멘트 단백질의 상호 작용 측정

이 비디오는 15개의 N-표지된 야생형 및 돌연변이 엔보플라킨 단백질과 표지되지 않은 비멘틴 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명 분광법 기술에 대해 설명합니다. 야생형 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 성공적인 상호 작용은 NMR 스펙트럼에서 광범위한 라인 확장과 피크 소멸로 이어지는 반면, 돌연변이된 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 상호 작용이 없으면 NMR 스펙트럼에서 잘 분리된 피크를 초래합니다.

원자 수준의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명

이 비디오는 단백질-지질 상호 작용을 연구하기 위한 미시적 열영동을 보여줍니다. 이 분석은 온도 구배에 반응하여 형광 표지 단백질의 열영동 움직임을 정량화하여 분자 간의 상호 작용을 감지합니다. 형광 분자는 비형광 지질 분자의 다른 농도와 혼합되고, 용액에 있는 분자의 혼합물은 모세관에 적재됩니다. 모세관의 샘플에 온도 구배가 적용되고 온도 구배에서 형광 분자의 움직임이 감지되고 기록됩니다.

용액에서 단백질-지질 상호작용을 연구하기 위한 Microscale Thermophoresis

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

MicroScale Thermophoresis(MST)는 압타머-표적 상호 작용을 특성화하는 민감한 기술입니다. 이 원고는 압타머-소분자 상호작용을 특성화하기 위한 MST 프로토콜을 설명합니다.

마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

마이크로스케일 열영동은 낮은 재료 비용으로 결합 상수를 신속하게 획득한다. 표지 또는 라벨이 없는 마이크로스케일 열영동이 상업적으로 입수가능하거나; 그러나, 라벨 없는 열영동은 형광 표지를 사용하여 수행될 수 있는 상호작용 측정의 다양성을 할 수 없다. 우리는 라벨이 붙은 열영동 측정을위한 프로토콜을 제공합니다.

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

핵 자기 공명(NMR) 분광법은 잔류물 특이적 방식으로 구조적 단백질 역학을 특성화할 수 있습니다. 당사는 피코초에서 나노초의 시간 척도에 민감한 NMR 15NR1 및 R2 이완 및 {1H}-15N 이종 핵 오버하우저 효과(hetNOE) 실험을 기록하기 위한 실습 프로토콜을 제공합니다.

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험

이 NMR 기반 프로토콜은 시아노비린-N 및 D-만노스를 사용하여 약한 단백질-글리칸 상호작용을 조사합니다. 리간드 및 단백질 검출 방법을 결합하여 결합 부위를 매핑하고, 알로스테릭 효과를 감지하고, 만남 복합체를 식별합니다. 이 접근 방식은 샘플 준비 및 데이터 분석을 간략하게 설명하며 글리칸 특정 진단 및 인식 메커니즘에 유용한 구조적, 동적 통찰력을 제공합니다.

단백질-글리칸 상호작용 탐구: 핵 자기 공명의 발전

학습하세요 NMR 분광법과 MST를 이용한 구형 및 섬유형 단백질 상호작용 측정 방법입니다. 안정 동위원소 표기 단백질을 활용하여 결합 친화도와 원자 수준 상호작용을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

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