핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

이 방법은 단백질이 작은 분자 또는 큰 분자에 직접 결합하는지 와 같은 단백질 상호 작용 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 원자 수준에서 직접 상호 작용을 감지하는 간단하고 빠른 방법이라는 것입니다. 배출 명령 ej로 공기 흐름을 켭니다.

이것은 자석에서 샘플을 가져올 것이다. 이제 개구부에서 자석 위에 스피너 내에 샘플을 배치합니다. 명령 ij와 함께 삽입합니다.

샘플이 진행하기 전에 자석 내부에 정착 할 때까지 기다립니다. 실험 ZGPR을 선택하여 edc 명령 및 로드 표준 양성자 NMR 매개 변수를 사용하여 새 데이터 집합을 만듭니다. NAME, 실험 번호 및 처리된 데이터 폴더 번호 필드를 입력합니다.

세트 용매 필드에서 용매를 선택하고 표준 프로브헤드 및 용매 종속 파라미터를 읽기 위해 getprosol 실행을 클릭합니다. 잠금 명령을 사용하여 공단된 용매에 샘플을 잠그고 스위핑이 완료되고 잠금이 완료될 때까지 기다립니다. 자동 튜닝 명령 atma를 사용하여 샘플을 튜닝하여 자석의 공진 주파수를 수정합니다.

자동 튜닝이 완료될 때까지 흔들림 곡선을 모니터링합니다. 상판을 사용하여 자기장을 심. 쉬밍은 자기장을 조정합니다.

샘플 주위의 균일성을 달성합니다. 이 값을 명령 wsh로 값에 저장하고 동일하거나 유사한 샘플을 사용하는 경우 topshim 전에 rsh를 사용하여 읽는 것이 좋습니다. 이제 rga 명령으로 수신기 게인을 조정하여 최대 신호 대 노이즈 비율을 달성합니다.

스펙트럼의 중심을 물 공명 오프셋에 놓고 calibo1p1을 사용하여 90도 양성자 펄스를 고출력으로 설정합니다. 제로 이동 zg 명령을 사용하여 양성자 스펙트럼을 수집하고 efp로 처리합니다. 여기에는 지수 곱셈, 라인 확대를 통합한 무료 유도 붕괴, FID의 Fourier 변환 및 위상 보정을 적용하는 pk가 포함됩니다.

통합 옵션 없이 다항형을 사용하여 자동 위상 보정 APK 및 자동 기준 보정 absn을 적용합니다. 실험에서 SFHMQC3GPPH를 선택하여 SOFAST HMBC 실험에 대한 새 데이터 집합을 만듭니다. p1이 최적화된 P1 값인 명령 게프로졸 1H p1 plw1을 이용하여 양성자 스펙트럼으로부터 최적화된 P1 및 O1을 복사하고 P1 의존펄스를 채우고, plw1은 P1의 전력 레벨이다. 이제 CNST54 상수를 최적화하여 아미드 화학 적 변화에 대한 오프셋을 설정합니다.

또한 CNST55를 최적화하여 관심 있는 스펙트럼 영역을 포괄하기 위해 대역폭을 정의하여 수신기 게인을 최적화할 수 있습니다. 이러한 매개 변수를 선택하려면 2차원 스펙트럼에서 첫 번째 FID를 추출하고 관찰된 신호를 찾아 이를 정의합니다. 또한, 이완 지연, 스캔 수 및 더미 스캔을 다양하게 하여 명령 gs로 허용 가능한 신호 감도를 얻을 수 있으므로 실시간으로 데이터 품질을 모니터링할 수 있습니다.

마지막으로 제로 고 zg를 사용하여 스펙트럼을 기록합니다. 간접 차원에서 선택적 선형 예측을 사용하여 처리 매개 변수를 스펙트럼의 직접 F2 및 간접 F1 치수의 크기로 설정합니다. QSINE를 창 함수로 선택하고 2차원 스펙트럼을 처리하기 위해 2개의 새종 이동을 입력합니다.

명령 xfb를 입력하여 창 함수와 Fourier 변환을 사용하여 양방향으로 데이터를 처리합니다. 명령 apk2d를 사용하여 양방향으로 자동 위상 보정을 수행합니다. 2D 데이터에 대한 자동 기준 보정 함수 abs2로 기준선을 수정합니다.

이렇게 하면 처리 매개 변수에 정의된 ppm 값 사이에 다항함수가 적용되고 추가 분석을 위해 2D 스펙트럼을 생성합니다. 상호 작용 데이터를 다른 분자와 비교하기 위해 직렬 처리를 수행하려는 경우 처리 매개 변수를 명령 wpar로 저장하고 rpar로 회수합니다. 피크 따기 과정을 시작하려면 명령 pp를 입력합니다.

예상 피크를 기준으로 ppm 범위, 최소 강도 및 최대 피크 수를 정의합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 육안으로 결과를 확인합니다. 필요한 경우 스펙트럼 품질에 따라 결과가 만족할 때까지 프로세스를 다시 실행합니다.

pp 명령으로 피크 목록을 생성합니다. 이 피크 목록에는 기본적으로 데이터 높이 및 최대 강도 정보가 포함되어 있습니다. 피크 목록은 후속 스펙트럼으로 내보낼 수 있으며 다른 프로그램에서 읽을 수 있습니다.

이제 다른 분자와의 상호 작용을 나타내는 화학 적 변화의 피크 강도 또는 운동의 변화에 대한 단백질 HSQC 스펙트럼을 관찰한다. 상호 작용 분자가 큰 경우, 일부 피크의 실종과 함께 피크 강도의 감소를 기대합니다. 피크 탭을 클릭하고 피크 창에서 마우스 오른쪽 클릭으로 가져오기를 선택하여 다음 데이터 집합으로 피크 목록을 가져옵니다.

스펙트럼을 통해 피크를 시각화하고 필요한 경우 새 위치로 이동합니다. 전체 테이블의 재설정 강도를 클릭하여 강도를 포함하는 스펙트럼에 대한 피크 목록을 생성합니다. 이 피크 목록은 저장된 피크 목록에서 위치 정보를 전달합니다.

내보내기 함수를 선택하여 분석을 위해 다른 데이터 집합에서 스프레드시트 또는 기타 수학 프로그램으로 피크 목록을 내보냅니다. 복잡한 스펙트럼의 기능 피크 강도, 각 피크에 대한 단백질 스펙트럼의 피크 강도로 피크 강도의 변화를 계산합니다. 값을 곱셈에 곱하여 백분율 변경으로 변환할 수 있습니다.

피크 볼륨은 피크 강도가 서로 가까이 위치한 피크를 측정하기 쉽지만 일반적으로 상대적으로 넓은 피크의 밀도가 높은 단백질의 경우와 같이 유용합니다. N15HSQC는 VimRod의 존재 또는 부재에서 야생 형 E-PRD뿐만 아니라 R1914E 돌연변이를 위해 인수되었다. 야생 형 E-PRD의 스펙트럼은 제대로 접힌 단백질을 나타내는 잘 해결 된 피크의 예상 수를 보여줍니다.

VimRod가 있는 동안 스펙트럼은 E-PRD와 VimRod 사이의 바인딩에 해당하는 광범위한 라인 확대 및 피크 실종을 보여줍니다. R1914E 돌연변이의 스펙트럼과 VimRod를 추가하면 이러한 돌연변이 E-PRD에 결합이 부족하다는 것을 나타내는 작은 변화가 관찰됩니다. 여기서 VimRod의 존재와 부재에 있는 E-PRD 피크 강도는 E-PRD 복합체에서 피크 확대의 범위를 나타내기 위하여 상대피크 강도로 비교되고 플롯되었습니다.

VimRod 및 E-PRD의 결합을 검증하고 양화하기 위해 형광 RED-tris-NTA 염료로 표지된 His6-VimRod를 사용하여 MST 분석을 대상으로, E-PRD 리간드의 농도 감소로 수행되었다. 데이터는 1사이트 리간드 바인딩의 표준 모델에 적합했으며 KD를 25.7 플러스 또는 마이너스 2.1 마이크로몰러로 제공했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동일한 획득 및 처리 조건을 사용하는 것이 중요합니다.

NMR 스펙트럼의 수집을 위한 동위원소 표지단백질 견본에 접근 때문에 투쟁할 것입니다. 이 기술의 의미는 암의 치료로 확장, 감염, 또는 신경 퇴행성 질환 그들은 질병에 손상 된 단백질 상호 작용의 형성을 포함 하기 때문에.