Name: 작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 작은 각 엑스레이 산란(SAXS)을 사용하여 용액 상태에서 생체분자의 크기, 형태 및 구조적 변화를 분석하는 방법을. ATSAS 프로그램을 활용한 데이터 처리와 구조 모델링 과정을 시각적으로 확인하세요.

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이 프로젝트는 NSERC RGPIN-2018-04994, 캠퍼스 앨버타 혁신 프로그램 (RCP-12-002 C) 및 앨버타 프리온 연구소에 의해 지원 되었습니다 / 앨버타 혁신적인 바이오 솔루션 (201600018) 보조금 지 TRP 수 여는 RNA에 캐나다 연구의 자 & 생물 물리학 단백질 (201704)과 NSERC 발견 그랜트 (RGPIN-2017-04003) 인정. TM 자금 NSERC 발견 그랜트 TRP.에 의해

1. SAXS 샘플 준비 및 데이터 수집
<ol><li>샘플 준비:<ol>
<li>SAXS 실험 필요 균질, 안정적이 고 비 집계 단백질 견본; 안정성과 크기 배제 크로마토그래피 (S)와 oligomeric 상태 관찰 DL 및 데이터 수집 전에 AUC.</li>
		<li>샘플 제목 (nidogen 1과 laminin γ-1이 경우에서) DL 분석 및 tricine 샘플 순도10시각화 하 SDS 페이지. 참고: 샘플 농도 (1-4 mg/mL) 그들의 크기, 자기 협회 및 안정성; 함께 집계 등 그들의 솔루션 동작의 범위를 커버 수 있습니다. 여기, nidogen-1, (139 kDa)의 5 농도 laminin γ-1 (109 kDa)의 3 및 4의 S 정화 아데닌 복잡 한 준비 되었다 이전 설명10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 수집:<ol>
<li>시설 또는 제조업체의 지침에 따라 내부 시스템 또는 싱크 로트 론를 사용 하 여 SAXS 데이터를 수집 합니다. 참고:이 작업에 사용 되는 데이터는 내부 시스템을 사용 하 여 수집 ( 재료의 표참조)를 포함 하는 3-핀 홀 카메라 장착 + 002 미소 초점 튜브 봉인 (1.54에 Cu Kα 방사선 Å)과 W. 40에서 운영 하는 Confocal 최대 플럭스 (CMF) 광학 시스템은 또한 데이터 수집을 위해 200 nm 멀티 와이어 2D 검출기를 갖추고 있습니다. 그러나, 프랑스, 독일, 영국, 미국, 그리고 다른 국가에서 현대 synchrotrons의 가용성과는 정기적으로 가능한 집계/저하, 우리가 지금에서 monodispersed 준비의 분리를 용이 하 게 하는 S SAXS 설정에 대 한 액세스 제공 싱크 로트 론 시설에서 데이터를 수집 합니다. 11 DNA G-quadruplex 최근 게시 된 기사는 S SAXS 데이터 수집 전략의 예입니다. 이 경우에, SAXS 데이터 nidogen-1 3 시간에서 0.08 ≤ q ≤ 0.26 Å의 범위에서 수집 된 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 및 4.0 mg/mL); laminin γ-1 (1.5, 2.0 및 2.5 mg/mL) 그리고 그들의 복합물 (0.8, 1.0, 1.25와 1.5 mg/mL).</li>
		<li>버퍼 및 시스템에 특정 처리 소프트웨어를 사용 하 여 샘플 데이터를 줄일 수 있습니다. 프리머스/qt12 (그림 2A) 같은 프로그램을 사용 하 여 단백질 데이터에서 버퍼 기여를 뺍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 데이터 분석
참고: 현재, 있다 SAXS 데이터 분석에 유용한 몇 가지 소프트웨어 패키지: ScÅtter43 (www.bioisis.net에서 다운로드), bioXtas 원시44, 그리고 ATSAS 스위트13. 이 섹션에서는 원시 SAXS 분석 데이터는 ATSAS를 사용 하 여 프로그램 제품군 및 특정 단계는 ATSAS 2.8.1에서에서 가져옵니다 경우 수행할 일반적인 단계에 대 한 개요를 제공 합니다 다운로드. 다른 프로그램 사용 될 수 있다 고는 나중에 설명 간단히.
<ol><li>버퍼 빼기 참고:이 단계는 정적 SAXS 샘플만 관련.<ol>
<li>프리머스/qt에서 "열기" 메뉴 옵션을 선택 하 고 관심의 데이터 파일을 선택 합니다. 데이터 파일에서 첫 번째 열은 s-벡터 축 ASCII 형식 이어야 하 고 두 번째 열은 강도 다는 것을 유의 하십시오. 같은 메뉴에이 데이터를 삽입 하 여 버퍼 자체에 대 한 수집 된 데이터에 대해이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>만 관심의 고분자에서 비 산 대표 뺀된 산란 곡선을 생성 하는 데이터 처리 창에서 "빼기"를 선택 합니다. 각 농도 대해이 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Guinier 분석<ol>
<li>Guinier 분석 수행, 버퍼 로드 분산 곡선을 프리머스/qt 2.1.1 단계에서 앞에서 설명한로 뺍니다.</li>
		<li>"반지름의 선회" 프리머스 Guinier 마법사; 여 진행 하 게 됩니다를 클릭합니다 ln(I) vs q2 의 표시 됩니다.</li>
		<li>예비 Rg 는 외부 모듈에 기본 제공 된 프리머스/qt. 찾기 "Autorg" 버튼은 클릭 "AUTORG" 기능을 사용 합니다.</li>
		<li>그들 모두를 강조 하 고는 오른쪽에, 2.1.1 매우 비슷한 메뉴에 삽입 하 여 한 번에 여러 파일을 입력 합니다.</li>
		<li>데이터 품질; 평가 이전 만든 Guinier 플롯을 사용 하 여 Guinier 음모 아래 녹색 줄 맞추기의 선형성을 나타내는 오차 플롯을 표시 됩니다. 비-선형성 Guinier 분석에서 샘플 집단의 서명 수 및 추가 분석을이 경우에 수행 하지 않도록 다는 것을 유의 하십시오. 참고: 선형 Guinier 적합 제공 작은 오류와 Rg (< 5%)와 높은-품질의 샘플을 제시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kratky 분석<ol>
<li>위에서 설명한 대로 비슷한 방식으로 시각에 데이터를 로드 합니다.</li>
		<li>"선택 상자" 데이터 파일 이름 옆에 클릭 하십시오. 이 데이터는 별도 창에 플롯 됩니다.</li>
		<li>다음 드롭다운 메뉴에서 "Kartky 음모" 선택 "플롯" 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>이 "q2 L(q) vs qx"로 데이터를 플롯 합니다. 펼쳐진된 단백질 피크 대신 고원 표시 되며 쌍곡선 플롯17닮은 동안 구형 단백질 가우스 피크를 표시 다는 것을 유의 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 병합<ol>
<li>부하 버퍼 단계 2.1.1로 다시 한번, 프리머스/qt에 각 농도 대 한 데이터를 뺍니다.</li>
		<li>데이터를 병합 하려면 단순히 처리 창에서 "병합" 버튼 클릭 합니다.</li>
		<li>각 곡선 및 나 규모 번호 원래 샘플에서 만든 희석에 연결을 검사 합니다. 참고: 높은 농도에서 샘플 곡선의 꼬리 영역에서 더 적은 소음을 표시합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>P(r) 배포<ol>
<li>P(r) 플롯을 생성 하려면 앞에서 설명한 프리머스/qt로 병합된 데이터 곡선을 로드 합니다.</li>
		<li>"거리 분배" 버튼 오른쪽에 흩어져 빛 대 q 쌍 거리 분포 함수 줄거리의 강렬의 병합 된 데이터를 제시 새 창을 열을 클릭 합니다. 참고: 오른쪽에 정보 쌍 거리 분포 함수 계산의 전반적인 품질을 제공합니다.</li>
		<li>원시 데이터의 꼬리 끝에 어떤 중요 한 소음을 방지 하려면 병합 된 데이터의 데이터 범위를 조정 합니다.</li>
		<li>낮은 q 지역에서 빔 정지에 가까운 데이터 포인트를 생략 합니다.</li>
		<li>~ 5 번 Rg Guinier 분석에서 얻은 범위 D최대, 시작을 결정 합니다. 점차적으로 P(r) 줄거리 갑자기 y 축에는 0을 삭제 하지 않습니다 때까지 0에 접근 하기 전에 긴 꼬리는이 값을 줄입니다.</li>
		<li>확인 실험 Rg/나0 (Guinier 근사에서 파생 된)와 P(r) Rg/나0숫자는 유사한. 참고: 경우에 따라 추가 데이터, 데이터 요소, 및 알파 (조정 매개 변수는 프로그램의 얼마나 많은 주의 피팅 실험 데이터에 비해 분포의 매끄러운 비율)의 조작 범위에는 또한 좋은 품질 P(r) 음모를 얻기 위해 필요한21 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>3.b 론 적 구슬 모델링 및 평균
<ol><li>일단 여러 농도에서 수집 된 데이터는 병합 또는 S SAXS를 사용 하 여 수집 하는 데이터를 최소화 하 고 Kratky 음모, P(r) 줄거리와 Guinier 분석 확인, 고분자의 저해상도 구조 계산 및 그들의 단지입니다. 이 파이프라인 솔루션 구조 및 핵 산, 단백질, 핵 산 단백질 또는 단백질 단백질 복합물10,11,,2122,23의 상호 작용 연구에 사용할 수 있습니다. ,,2425,26,27,28,29,30,31,32 ,,3334. 가장 인기 있는 프로그램 중 하나는 DAMMIN, Svergun35 ATSAS 패키지13, Rg 및 D최대 에 대 한 예비 입력 정보 모의 어 닐 링 프로토콜을 채택 하는 부분에 의해 개발 . Ab의 initio 모델링 방법 및 원리 설명에 자세히 다른18,36.</li>
</ol>

저자 아무 공개 선언할 수 있다.

이 종이 포함 버퍼 빼기, Guinier 분석, Kratky 분석, 데이터 병합 및 P(r) 배포의 프로토콜에서에서 설명 하는 SAXS 데이터 분석의 중요 한 단계. Ab initio 비드 모델링 너무 광범위 한 여기 자세히 덮여 있을 것 이며 따라서 짧게 덮여만.
Synchrotrons (예: 독일에서 DESY, 영국에서 다이아몬드와 프랑스에서 ESRF), 그것은 SAXS는 아주 작은 분수에 대 한 데이터를 수집할 수 (~ 몇 µ L)으로 분수 각 샘플의는 되 고 eluted s 열에서 즉 연결 된 인라인 (참조 그림 1 ). 탄력적 흩어져 SAXS 데이터 버퍼 빼기 자리를 차지할 수 전에 악기 제조 업체 나는 싱크 로트 론을 제공 하는 패키지를 사용 하 여 평균 광선 이다. 결과 1 D 데이터 Y에 ( 내가(q))에 흩어져 빛의 양을 나타냅니다-축 및 산란 각도 (q= 4πsinθ/λ, λ가 파장 사건 X-광선) 그림 1에 제시 된. 프리머스/qt12 프로그램 어떤 배경 때문에 버퍼를 직접 사용 하 고 섹션 1.1에서에서 설명. 다른 프로그램으로; ScÅtter43 ( www.bioisis.net에서 다운로드)와 https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, 그리고 bioXtas 원시44 ( 에서 https://에 제공 되는 자습서 bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) ATSAS 패키지의 대 안으로 이용 될 수 있다.
Guinier 분석 샘플 집계 동질성 뿐만 아니라 선회 반경 (Rg)를 제공 하는 낮은 s 지역14SAXS 데이터에 따라 관심의 고분자에 대 한 정보를 제공 합니다. 음모는 SAXS 데이터 곡선 q 1.30 최대의 최대 범위와 맞춤 다음 각 농도에서 얻은 프리머스/qt 구성 Rgx. 반면에 비선형 Guinier 집계 결과 플롯15,16monodispersed 샘플 준비 (그림 2D),이 지역에서 선형 Guinier 플롯을 제공 해야 합니다. Guinier 분석 선형 이면 강 체 모델링 수행 또는 저해상도 모델의 앙상블을 만들 것인지를 결정할 때 유용 Kratky 음모와 관심의 고분자의 "unfoldedness"의 정도 관찰할 수 있습니다. 구형 단백질 분자를 확장 하는 반면 종 모양의 곡선을 플롯 또는 펼친된 펩 티 드 고원 또는 심지어 더 큰 q 범위에서 증가 하 고 부족 한 종-모양 (그림 2C)를 표시 하는 Kratky에 표시 됩니다.
그러나 1 D 점도 (그림 2D)의 낮은 q 영역에서 데이터 요소를 고려만 Guinier 분석에서 Rg 를 취득,, 그것은 거의 전체 데이터 집합을 사용 하 여 간접 푸리에 변환을 수행할 수 실제 공간 거리 분포 함수 (P(r)) D맥스 와 Rg 에 정보를 제공으로 ln (I (q)) 대 (q)의 상호 공간 정보를 변환 하려면 (그림 2B) P(r) 음모의 모양 관심18,19의 고분자의 총 솔루션 구조를 나타냅니다. 실제 공간 데이터를 상호 공간 데이터의 변환을 중요 한 단계 이지만 자세한 설명은이 문서의 범위 내에서 아니에요. 따라서, Svergun20 각 매개 변수를 이해 하는 문서를 참조 하십시오.
일단 버퍼 뺀 데이터 개별 농도에서 Rg, Kratky 분석을 사용 하 여 그들의 접는 패턴을 조사 하 여 다음에 대 한 일관 된 값으로 Guinier 분석을 통해 처리 됩니다, 그리고 이러한 데이터를 병합할 수 있습니다. 병합 된 데이터 위에서 설명한 대로 nidogen-1, laminin γ-1, 그리고 그들의 복합물 처리 하 고 결과 P(r) 플롯 2B를 그림에 표시 됩니다. 이상적으로, 하나 또한 쌍 거리 분포 함수 비슷한 Rg 및 D최대 값을 제공 하는 각 농도 대 한 수집 SAXS 데이터를 각 농도 대 한 P(r)를 계산 해야 합니다. Rg 및 D최대 남아 있으면 비슷한 농도의 넓은 범위는 사용자 진행 해야 합니다. 그 신호를 따라 데이터가 잘릴 수 있습니다 데이터 병합 전에 주목 한다. 이것은 종종 경우 농도 및 조사 고분자의 분자량이 낮은 경우입니다.
다양 한 모드에서 DAMMIN를 사용 하 여 저해상도 모양 분석을 수행할 수 있습니다 (예: 패스트, 슬로우, 전문가 모드, 등). 빠른 모드는 P(r) 음모 제공 좋은 품질 모델을 평가 하는 이상적인 첫 번째 단계입니다. 일반적으로, 적어도 10 모델 경우 저해상도 구조 재현 가능한 결과 얻을 수 있습니다, χ (0.5-1.0의 값으로 간주 됩니다 좋은 우리의 광범위 한 작업에 따라 적합된 매개 변수의 낮은 선 확인 각 P(r) 음모에 대 한 얻을 수 있어야 ), 실험적으로 수집된 SAXS 데이터와 모델에서 파생 된 데이터 계약을 설명 하는 값. 게시를 위해, 우리는 일반적으로 느림 또는 전문가 모드를 사용 하 고 적어도 15 모델 계산. DAMMIN, 뿐만 아니라 그것, DAMMIF37, 뿐만 아니라 GASBOR38 의 더 빠른 버전 대안 있습니다. 또한, 단백질-단백질 또는 단백질 핵 산 단지 공부, MONSA 프로그램35, 고분자 뿐만 아니라 그들의 복잡 한에 대 한 개별 SAXS 데이터의 동시 피팅을 용이 하 게 사용 가능 하다. 에 대 한 자세한 내용은 RNA-단백질 상호 작용 연구를 위해 또한 고해상도 모델 계산, 파 텔 외3에 의해 최근 기사를 참조.
SAXS는 이론적으로 간단 하지만 의심할 여 지 없이 다른 구조 생물학 도구 및 결과 자체에 사용할 수 있는 구조적 데이터의 저해상도 또는 고해상도 기법을 정보를 명료 하 게와 함께에서 매우 보완 방법 고분자 구조와 역학에 대 한 으로 고분자와 그들의 단지 monodispersed 준비를 얻을 수 있습니다, SAXS 솔루션에 구조 생물학 고분자의 모든 종류의 상호 작용을 공부 하 고 활용할 수 있습니다. 여기서 설명 하는 복잡 한 경우 그것은 놀라운 그 적은 질소 1과 laminin의 전반적인 액세스할 수 표면적의 10% 보다 γ-1은 매장이 복잡 한 반면 두 단백질의 도메인의 나머지는 자유롭게 다른 상호 작용에 액세스할 수 (그림 3)의 구조적 강성을 유지 하는 세포 외 기질에 단백질. 복잡 한에 대 한 정보를 얻기 ~ 240kDa 다른 구조 생물학 기술이 엑스레이 결정학, NMR, Cryo-EM 현미경을 사용 하 여 매우 어려운 것입니다.
엑스레이 결정학 또는 NMR을 통해 잠복 단백질 구조는 기본적으로 시간이 걸리는 과정입니다. 구조 결정에서이 병목은 SAXS 구조적 기술; 그것의 힘을 표시 한 지역 단일 SAXS 실험에 대 한 데이터 수집 시간을 걸릴 수 있으며 유선형된 분석 소프트웨어의 도움으로 분석 할 수 있습니다 신속 하 고 효율적으로. SAXS는 크게 처리량을 증가 구조 연구는 독립 실행형 기술로 고해상도 데이터를 사용할 수 전에 고분자 구조의 저해상도 모델을 제공 하기 때문에. 다른 구조 기술에 방 벽은 시간의 긴 기간 동안 단백질 식 및 안정성의 높은 레벨을 필요로 하는 데이터 수집에 대 한 매우 순수 하 고, 집중 샘플에 대 한 요구 사항. SAXS 또한 순수 하 고 집중 될 필요가 샘플, 샘플 볼륨은 약 100 µ L 만들기 SAXS 분석 다른 구조 기술에 비해 상대적으로 저렴 한 방법. 또한, SAXS 크기 배타 착 색 인쇄기와 결합 되고있다 점점 일반적인 추가 품질 관리 단계를 제공 합니다. 최근 앙상블 최적화 방법 (엄)45,46 을 사용 하 여 유연한 시스템을 명료 하 게 하는 NMR 및 SAXS 데이터의 조합에 강한 발전 되었습니다. Mertens와 Svergun47에 의해 최근 논문에서 저자 NMR, 함께 NMR와 함께에서 사용 되 고 SAXS 데이터의 많은 다른 예제와 함께 조합에 엄 SAXS의 여러 최근 사례를 설명 합니다. 진보, SAXS의 분야에서 계속 해 서 만들어지고는 그리고 새로운 기술을 하지 그냥 다른 구조 기술에 무료, SAXS와 함께에서 사용할 수에 대 한 개발 되고있다. 따라서, 우리는 SAXS에 대 한 수요가 시간이 지남에, 특히 동적 시스템 기능 유연성에 의해 정의 된 특징을 NMR와 함께에 증가할 것 이다 믿는다.

셀 역할을 분자 기계 신호 폭포 및 구조적 무결성 관리 같은 세포질 기능을 수행 하는 단백질의 복잡 한 네트워크를 포함 합니다. 이러한 다양 한 구성 요소 이동 및 3 차원 공간에서 상호 작용 하는 방법으로 고분자의 특정 기능에 상승을 제공 합니다. 단백질 구조, 역동성, 및 상호 작용 기능을 결정의 중요성은 이러한 속성을 측정 하기 위해 지속적으로 진화, 복잡 한 기술에 대 한 필요를 제공 했다. 이들의 핵 자기 공명 (NMR), 엑스레이 결정학 (XRC) 등 최근, Cryo 전자 현미경 검사 법 (CEM) 고해상도 구조 정보 제공. 그러나, XRC CEM 많은 바이오 상태 중의 구조를 생성 하 고 NMR에 의해 3 차원 구조 결정은 일반적으로 작은 구형 단백질을 제한 하는 동안 단백질 구조 역학에 대 한 정보 부족. 이러한 한계를 극복 하기 위해 한 가지 방법은 작은 각 x 선 산란 (SAXS), 다중 도메인, 큰 또는 complexed 시스템의 분자 봉투를 생성 하 고 전역 명료 고해상도 딱딱한 고분자 구조를 결합을 활용 하는 건축 및 동적 기능입니다.
SAXS는 구조 뿐만 아니라 복잡 한 표시 동적 특성에 뿐만 아니라 통찰력을 주는 약 10-20 Å 1의 해상도 가진 고분자 복합물의 저해상도 봉투 생성 합니다. SAXS는 분자 구조를 밝히기 위해 엑스레이 활용, 비록 그것입니다 XRC 달리 솔루션에서 입자의 무작위 등방성 방향 회절, 아니라 오히려 산란, 원자 분해능을 얻을 수 없습니다 리드 하지 않습니다. 대신, 전자는 고분자의 "봉투"는 고분자 표시 conformations의 평균을 나타내는 생성 됩니다. 이 정보는 단일 단백질 또는 소 단위 조직, 유연성 또는 더 큰, 다중 단백질 복잡 한 역학의 영역을 유추할 수 직접 피팅 이전 해결된 원자 해결책 구조에 사용할 수 있습니다. SAXS 데이터는 고 에너지 단색 엑스레이 사용 하 여 synchrotrons 또는 약한 x-레이 소스 샘플 노출 시간 (그림 1)의 초 보다 시간을 요구를 제공 하는 내부 소스에서 수집 됩니다. SAXS 데이터는 종종 여러 샘플 하나의 실험적인 체제와 시스템에 유용한 데이터의 수집에 오랜된 시간을 필요로 하는 버퍼에서에서 수집 됩니다. 샘플, 따라서 해야 안정적이 고 비 집계 동적 산란 (DLS) 등 높은-품질 SAXS 데이터2 를 분석 ultracentrifuge (AUC) 분석 검증 품질 관리 방법에 따라 적어도 몇 시간에 대 한 , 3. 우리가 짧게에 ab initio 모델링을 사용 하 여 감동과 함께 SAXS, 그것의 사용, 혜택, 한계 및 샘플 준비와 초점에 무 겁 게 데이터 수집 및 분석, 뒤에 원리의 실제적인 설명 제공에 세포 외 기질 단백질 nidogen-1과 laminin γ-1 실험 예를 들어.
원칙, 혜택, 그리고 SAXS의 한계:
SAXS 뒤에 지도 principle(s)은 비교적 간단 하다: 관심의 macromolecule(s)의 monodispersed 준비의 솔루션 모 세관 내에서 배치 되 고 고 에너지 단색 x 선 빔에 노출 됩니다. 광자 원인 진동, 하려면 원자 포탄의 전자 같은 에너지와 파장의 방출 되는 구형 파의 결과로. 모든 전자 진동 것입니다 지속적인 배경, 달성 될 것 이다 고 결과 전자 밀도 고분자의 배경에 대조 됩니다. 결과 산란 강도 산란 각도, 2Θ의 기능으로 수집 됩니다 (그림 1).
다른 기술 하면서 XRC, NMR, CEM 구조 정보 제공 원자 수준에서와 같은 다른 기술을 제공할 수 없습니다 SAXS에 여러 이득이 있다. SAXS 거의 모든 버퍼에 수행할 수 있습니다 그리고 어떤 특별 한 샘플 준비를 필요 하지 않습니다. 이 모노-또는 divalent 양이온 또는 pH4,5변경의 유무 등 다양 한 조건 하에서 고분자의 구조와 동작을 공부에서 특히 중요 하다. SAXS는 고분자6, 뭔가 다른 나열 된 기술을 투쟁 수 유연한 영역에 대 한 정보를 제공 하는 기능이 있다. 그러므로, SAXS는 강한 무료 고분자의 안정적인 부분 XRC, NRM 또는 CEM와 전체 고분자 공부 또는 복잡 한 SAXS 낮은 해상도 분석 기술과 같은 다양 한 분석 도구를 사용 하 여 결합으로 사용 될 수 있습니다. FoXSDock7 또는 CRYSOL8. SAXS 솔루션 기술 이기 때문에, XRC에서 얻은 그 같은 정적 구조 솔루션6에서 경우 확인 하려면 자주 사용 됩니다. SAXS는 또한 상대적으로 적은 양의 샘플 투자 (일반적으로 50-100 µ L)과 상대적으로 작은 양의 실험 시간 (30 분-1 시간)을 요구 하는 기술 되 고의 이점이 있다.
SAXS의 가장 큰 한계는 샘플 집계 및 저하, 잘못 된 구조 예측으로 이어질 수 있는 취약점 이다. 집계도 5%로 낮은 수 있습니다 최대 입자 크기 (D최대)와 반지름 (Rg) 선회의 과대평가로 이어지는 매우 높은 금액에 빛을 피해 라. 다른 한편으로, 분자 속성의 과소 평가 샘플 저하 될 수 있습니다. 이 취약점은 SAXS는 평균 기법 샘플 동질성은 안정적이 고 재현 가능한 결과 달성 하는 중요 한 의미 되 고에서 발생 합니다. SAXS에 의해 분석 하는 모든 샘플 정화 및 동질성 검사, 변성 및 네이티브 젤 전기 이동 법, 크기 배제 크로마토그래피, 비 산, 동적 빛의 여러 방법의 받을 따라서, 분석 ultracentrifugation입니다. 종종, SAXS beamlines SAXS (S-SAXS)3,9시 전에 최종 품질 관리로 고성능 액체 착 색 인쇄기를 통해 샘플 단계 실행 됩니다. SAXS 데이터 여러 농도에서 수집 되어야 하 고 각 데이터 집합의 Rg 비교 해야, interparticle 상호 작용 및 집계, 입자의 과대평가 방지 하기 위해 가까운 유사성을 보장 치수, 부정확 한 데이터 분석 및 모델링. 분산 농도 및 크기에 따라, 이후 작은 고분자의 농도 범위는 좀 더 구체적인 최적화가 필요할 수 있습니다. 이것은 상호 정리, 큰 크기 작은 각도 작은 크기 큰 각도 쪽으로 향해 흩어입니다. 이 데이터 수집, 나오 가 비례 R6, R은 입자 반지름에에서 명시 한다. SAXS의 최종 한계 노출, 데이터의 왜곡으로 이어질 수 있는 동안 샘플에 방사선 손상 위한 잠재력을 이다. 그것은이 하지 발생 되도록 SAXS 샘플 노출 전후 샘플 품질을 비교 하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>HEK 293 EBNA 세포주</td><td>실험실 내 가용성</td><td>-</td><td>단백질을 과발현하는 데 사용되는 세포주Ni</td></tr> <tr><td>Sepharose 고성능 히스티딘 태그 단백질 정제 수지</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>Affinity 단백질 정제 수지</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>SEC Column</td></tr><tr><td>&Auml; KTA 순수 FPLC</td><td>GE 헬스케어</td><td>-</td><td>FPLC 시스템</td></tr><tr><td>나노드롭</td><td>나노드롭</td><td>-</td><td>분광광도계</td></tr><tr><td>기본 시약(NaCl, Tris-HCl 등)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S-MAX3000</td><td>Rigaku-SAXS</td><td></td> <td>핀홀 카메라 시스템</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano-S</td><td>Malvern Instruments</td> <td>Ltd-Dynamic</td> <td>Light Scattering instrument</td></tr><tr><td>0.1&micro; m 필터</td><td>Millipore</td><td>JVWP04700</td><td>DLS</td></tr><tr><td>Thrombin cleavage kit</td><td>abcam</td><td>ab207000</td><td>Thrombin cleavage to remove His tag</td></tr><tr><td>Strep-tactin Sepharose column</td><td>IBA</td><td>2-1201-010</td><td>Strep-Tag Affinity Purification</td></tr><tr><td>D-desthiobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533-48-2</td><td>Strep Tag Protein<strong의 용출</td></tr> 이전에 샘플을 농축하는 데 사용됩니다<tr><td>> 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAXGUI</td><td>Rigaku-SAXS</td><td></td> <td>및 데이터 축소를 위한 데이터 수집</td></tr><tr><td>ATSAS Suit</td><td>Franke et al., 2017-SAXS</td><td></td> <td>데이터 분석 소프트웨어 프로그램 제품군</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al., 2003-Buffer</td><td></td> <td>Subtraction</td></tr><tr><td>GNOM</td><td>Svergun, 1992-Rg</td><td></td><td>, Dmax 및 p(r) 계산</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>Franke and Svergun, 2009</td><td>-</td><td>Ab initio 모델 계산</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>Volkov and Svergun, 2003-Averaged</td><td></td> <td>Solution Conformation calculations</td></tr><tr><td>MONSA</td><td>Svergun, 1999-Simultaneous</td><td></td> <td>model fitting for the complex</td></tr><tr><td>GASBOR</td><td>Svergun et al., 2001</td><td>-</td><td>대안적인 Ab initio 모델 계산</td></tr><tr><td>DTS 소프트웨어 V6.20</td><td>Malvern Instruments</td> <td>Ltd-DLS</td><td>는 장비 소프트웨어</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schrodinger, LLC</td>를 공급했습니다.<td>-</td><td>PyMOL 분자 그래픽 시스템 V2.0</td></tr><tr><td>단백질 데이터 뱅크</td><td>Berman et al., 2000-PDB</td><td></td> <td>ID: 1NPE</td></tr></tbody></table>

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

도메인이 여러 개인 구형 단백질을 포함 하는 단백질 단백질 상호 작용 어떻게 같은 단지 형태와 도메인 지향/위치는 어떻게 결정에 대 한 기술적인 도전을 제시. 여기, ab의 initio 모델링을 통해 multicomponent 시스템에는 특정 도메인 중재 하십시오 상호 작용 elucidating에 대 한 잠재력을 가진 프로토콜을 설명 합니다. 고분자 및 그들의 어셈블리 솔루션 구조를 계산 하는 방법 관련 된 작은 각 엑스레이 뿌리기 (SAXS), 크로마토그래피, 그리고 하이브리드 접근 방식 함께 원자 해결책 구조에서 데이터를 통합 하는 제공 됩니다. 구체적인 예를 전체 길이 nidogen-1, 세포 외 기질 단백질을 조립 하 고 형성 하는 확장, 곡선 nanostructure의 복잡 한. 하나는 구형 도메인 laminin γ-1, 지하실 멤브레인 구조에 연결 합니다. 이 유연한 다중 도메인 단백질 복합물의 정확한 구조를 결정 하기 위한 기초를 제공 하 고 자동화 로봇 및 크기 배제 크로마토그래피 시스템 함께 싱크 로트 론 근원에 의해 활성화 됩니다. 이 조합은 급속 한 분석을 여러 oligomeric 상태 SAXS 데이터 수집 직전 분리 되어 있습니다. 분석 선회, 입자 크기, 분자 모양과 우선 페어링의 반지름에 대 한 정보를 생성합니다. 구성 요소 단백질의 고해상도 구조를 피팅 하 여 단지의 3D 모델을 생성 하기 위한 프로토콜도 제공 됩니다.

위에서 설명한 데이터 분석 접근 nidogen-1, laminin γ-1, 그리고 그들의 복합물 P(r) 기능을 사용 하 여에 대 한 Rg 및 D최대 계산에 이용 되었다. 우리는 각각 7.20 (±0.10) nm, 8.10 (±0.20), 및 10.9 (±0.4) nm nidogen-1, laminin γ-1 및 그들의 복잡 한에 대 한의 Rg 값을 얻은 (그림 2A-B). 또한, 24의 D최대 값 nm, 26, 및 35 nm nidogen-1, laminin γ-1, 그리고 그들의 복잡 한에 대 한 각각 (그림 2)10 획득 했다. DAMMIF 프로그램 nidogen 1과 laminin의 저해상도 구조를 가져오는 데 사용 되었다 γ-1, 두 단백질 솔루션에서 확장된 모양 채택 제안. Nidogen-1 (1 ~ 0.8) 및 laminin γ-1에 대 한 X 및 파워볼 값 (~0.9 및 0.8 각각) 허용 범위에 또한 있었다. 고해상도 구조 정렬 nidogen-1의 두 도메인 및 laminin γ-1, SAXS를 사용 하 여 얻은 그들의 저해상도 구조에 두 그들의 N와 C 맨끝 영역10의 id 허용.
와 상호 작용 사이트 엑스레이 결정학 C 터미널 도메인41을 사용 하 여 매핑된 Nidogen-1 laminin γ-139,40 의 상호 작용 협동자로 발견 했다. 그러나, 고해상도 구조는 상호 작용 도메인 아닌 전체 길이 nidogen-1 또는 전체 laminin γ-1 팔만 참여. 따라서, 우리는 복잡 한 포함 nidogen-1 (전체 길이)와 대 두 단백질의 N 맨끝 도메인의 상대적 방향을 공부 뿐만 아니라 상호 작용 영역을 식별 하 laminin γ-1 팔 정화. SAXS 데이터는 복잡 한에 대 한 굴복 10.9 (±0.4) nm의 Rg 와는 D최대 35 nm. 우리는 실제로,만 두 단백질의 C-터미널 지역에 참여 중재 상호 작용, 도메인의 나머지 멀리 떨어져 서로 ( 는 반면 제안 전체 단지의 저해상도 구조를 MONSA 활용 그림 3, 비디오 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig1.jpg"> 그림 1. SAXS 설정의 설계도입니다. 생체 또는 그들의 단지 monodispersed 준비, 고 에너지 엑스레이 노출 다음 준비가 되어 있습니다. 원본 (예를 들어, 사내 대 싱크 로트 론)에 따라 엑스레이 소스 거리 샘플의 에너지는 달라질 수 있습니다. 엑스레이 산란 패턴 (생체의 형태와 크기에 따라 달라 집니다) 기록 하 고 광선으로 산란 각도 관하여 뿌려 진된 빛의 강도 대 한 정보를 포함 하는 1 차원 플롯 (1 D)를 평균 했다. 버퍼 분자는 또한 빛을 피해 라, 이러한 분자에서 기여는 관심의 생체의 산란 패턴을 얻기 위해 빼 집니다. SAXS 데이터 수집 전에 싱크 로트 론에서 인라인 크기 제외/고성능 크로마토그래피를 사용 하 여 추가 정화 단계는 또한 일반적으로 수행 (상위 보기). 이 단계는 복잡 한에서 어떤 언바운드 생체를 제거 뿐만 아니라 모든 집계 또는 저하 제품 제거에 중요 한. 1 D 분산 플롯 전자 쌍 거리 배포 플롯 (P(r) 플롯), 회전 반경 및 생체의 최대 입자 크기 제공 하로 변환 됩니다. 이 음모는 ab initio 모델링 패키지 (즉, DAMMIN/DAMMIF)에 대 한 입력 파일로 가져오기 위해 사용 저해상도 구조 생체, 또는 다른 패키지 (즉, SASREF/산호)의 경우 부품의 고해상도 구조 생체 또는 복합물의 개별 생체 알려져 있습니다.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig2.jpg"> 그림 2. (A) 산란 각도 흩어져 빛 대 의 강도의 음모 (q = 4πsinθ/λ, nm-1) 생체 (낮은 지역) 및 생체의 모양 (높은 지역)의 품질을 제안. (B) 전자 쌍 거리 분포 P(r) 분산 데이터에서 확인 조사 (laminin γ-1, nidogen-1, 그리고 그들의 복합물) 생체의 길쭉한 모양을 제안 합니다. (C) Kratky 음모 제안 그 nidogen-1 및 laminin γ-1 단백질 펼친 되지 않습니다. (D) Guinier nidogen-1, laminin γ-1에 대 한 음모 그리고 데이터를 사용 하 여 낮은 산란 각도로 회전 반지름의 결정에 대 한 선형 영역을 나타내는 그들의 복잡 한. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig3.jpg"> 그림 3. 저해상도의 nidogen-1, 그리고 laminin γ-1 프로그램 MONSA를 사용 하 여 병합 된 데이터 집합의 분석에 의해 얻어진의 복잡 한 구조. 색 구성표는 그림 2와 동일 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58538/58538movie1.jpg"> 동영상 1입니다. Nidogen 1 laminin의 저해상도 구조 γ-1 단지. 이 영화는 단지의 다양 한 구조 기능을 시각화 PYMOL를 사용 하 여 준비 되었다. Laminin nidogen 복잡 한 결정 구조 (PDB ID: 1NPE)이 복잡이 한에 대 한 사이트는 상호 작용 강조 리본 만화로 표시 됩니다. 색 구성표는 그림 2와 동일 합니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/complex_movie.mpg" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

여기, 우리는 어떻게 작은 각 엑스레이 뿌리기 (SAXS) 고분자 구조를 나타내는 저해상도 봉투에 대 한 정보를 활용할 수 있습니다 제시. 고해상도 구조 기술 엑스레이 결정학, 핵 자기 공명 등와 함께에서 사용 될 때 SAXS 다중 도메인 단백질 및 고분자 복합물 솔루션에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

이 방법은 생체 분자 및 그 복합체의 크기, 모양 및 형성 변화와 같은 생화학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 분자가 안정되어 있는 환경에서 생리적으로 관련된 완충 조건하에서 실험을 수행할 수 있다는 것입니다. SAXS는 다른 많은 생물 물리학 및 구조 생물학 방법에 대한 무료 기술입니다.이러한 방법과 SAXS를 결합하면 구조 기반 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 생체 분자 복합체에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 나노 particals 및 약물 전달 versicles를 연구하는 것과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 일반적으로 이 메서드에 새로 온 개인은 원시 산란 데이터에서 저해상도 구조로 이동하는 압도적이고 복잡한 프로세스로 나타나기 때문에 어려움을 겪게 됩니다.이 방법의 시각적 데모는 원시 데이터에서 구조 모델을 얻기 위한 데이터 분석 파이프라인이 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. SAXS 데이터 분석에 유용한 몇 가지 소프트웨어 패키지가 있습니다. 여기에는 SCATTER, BioXTAS RAW 및 ATSAS 제품군이 포함됩니다.이 비디오에서는 ATSAS 프로그램 제품군을 사용하여 원시 SAXS 데이터를 분석할 때 취해야 할 일반적인 단계에 대한 개요를 제공합니다. 시작하려면 ATSAS 프로그램 제품군을 설치하고 로드합니다. PRIMUS/Qt 프로그램을 열고 열기 메뉴 옵션으로 이동합니다.여기에서 관심 있는 데이터 파일은 최대 13개까지 선택합니다. 데이터 파일은 ASCII 형식으로 이루어져야 하며, 첫 번째 열은 s-벡터 축이고 두 번째 열은 강도입니다. 이 단계를 버퍼 전용 데이터에 대해서만 반복하여 이 데이터를 두 번째 도구 메뉴에 삽입합니다.다음으로 데이터 처리 창으로 이동하여 빼기를 선택합니다. 이렇게 하면 관심 있는 거대 분자의 산란만을 나타내는 빼기 산란 곡선이 생성됩니다. Guinier 분석을 수행하려면 PRIMUS/Qt에 로드된 버퍼 빼기 분산 곡선으로 시작합니다.다음 을 클릭 Gyration의 반지름, 프리머스 기니어 마법사를 엽니 다. 이 시점에서, 제곱 된 강도 대 산란 각도의 자연 로그를 보여주는 플롯이 표시됩니다. gyration의 예비 반지름을 얻으려면 명령 프롬프트 창을 찾아 Autorg 함수를 사용합니다.Autorg를 밀어낸 후 상한을 한 쪽위로 클릭한 다음, 한 쪽을 아래로 이동하여 프로그램이 통계 측정을 업데이트하도록 합니다. 또는 동일한 열기 프롬프트를 클릭하고 이전에 설명한 것과 동일한 방식으로 강조 표시하여 여러 데이터 파일 이름을 선택하여 여러 파일을 한 번에 입력합니다. Kratky 분석을 시작하려면 클릭하여 데이터 파일 이름을 선택합니다.이렇게 하면 창에 있는 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 플롯을 선택합니다. 다음으로 플롯 버튼 아래에서 Kratky 플롯을 클릭합니다.그 결과, 구형 단백질은 GALC-ean 피크를 표시하고, 전개된 단백질은 피크 대신 고원을 표시하고 여기에 표시된 것과 같은 고풍스러운 음모를 닮습니다. PRIMUS/Qt의 각 농도에 대해 버퍼 를 로드하는 데이터를 다시 한 번 로드합니다. 그리고 처리 탭에서 각 곡선과 i-scale 번호를 클릭하고 검사하여 원래 샘플에서 만든 희석과 상관관계가 있습니다.검사 후 처리 창에서 병합 단추를 클릭하여 데이터를 병합합니다. 거리 분포 플롯을 생성하려면 병합된 데이터 곡선을 PRIMUS/Qt에 로드한 다음 분석 탭에서 거리 분포를 클릭합니다. 병합된 데이터의 데이터 범위를 조정하여 원시 데이터의 꼬리 끝에서 중요한 노이즈를 방지합니다.또한, 낮은 범위 값을 선택하고 수를 증가시킴으로써 저큐 영역의 빔스톱에 가까운 데이터 점을 생략한다. Dmax를 결정하려면 Guinier 분석에서 얻은 교향반의 5배 범위로 시작합니다. 그런 다음 거리 분포 플롯이 y축에서 갑자기 0으로 떨어지지 않고 0에 접근하기 전에 긴 꼬리가 없을 때까지 이 값을 점진적으로 줄입니다.기니에 근사치및 강도 수치의 거리 분포 반경으로부터 파생되는 교화 대 강도 플롯의 실험적인 반지름이 유사하다는 것을 확인한다. 여기서, 산란된 빛의 강도는 산란 각도에 대하여 플롯되어, 생체 분자 니도겐-1, 라미닌 감마-1 및 그들의 복잡한, 그들의 모양의 질을 모두 건의합니다. 산란 데이터에서 결정된 전자 쌍 거리 분포는 생체 분자가 길쭉한 모양을 가지고 있으며 Kratky 플롯은 데이터가 고원경향이 있거나 더 큰 Q-range에서 증가하고 종 곡선 모양이 부족하기 때문에 단백질이 접힌 상태에 있음을 시사합니다.또한 낮은 산란 각도에서 데이터를 사용하는 Guinier 플롯은 니도겐-1, 라미닌 감마-1 및 복합체에 대해 여기에 표시되는 gyration 반경을 결정하기 위한 선형 영역을 나타냅니다. 단백질-단백질 복합체를 연구하기 위해 MONSA는 전체 니도겐-1 라미닌 감마-1 복합체의 저해상도 구조를 얻기 위해 사용되었으며, 이는 두 단백질의 C-말기 영역만이 상호 작용에 참여하는 반면 나머지 도메인은 서로 멀리 떨어져 있음을 시사합니다. Synchrotron 방사선을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며 각 빔라인에 명시된 예방 조치및 안전은 초기 데이터 수집을 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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작은 각도 중성자 회절 계 KWS-2에서 나노 미터와 마이크로 미터 크기에서 넓은 길이 규모 이상 소프트 물질과 생물학적 시스템을 공부

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

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S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

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막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

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