Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

이 형태 측정 프로토콜은 사전 진동 개입 및 온난화 후 복구 중에 배반구 수축 및 재확장 강도를 모니터링할 수 있으며 바이러스 진동 방법의 효과에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 고급 이미지 편집 소프트웨어가있는 시간 경과 현미경 및 컴퓨터를 갖춘 체외 수정 실험실에 적용 할 수 있다는 것입니다. 확장의 5 또는 6일째에, 적어도 몇 개의 내부 세포 질량 세포와 응집력 있는 트로페토데름을 0.4 내지 0.7 밀리초 레이저 펄스로 발주하여 4.3 내지 9.4 마이크로미터에 이르는 구멍 직경을 가진 조나 펠루치다와 인접한 두 개의 인접한 트로페토더말 세포의 접합을 지향한다.

그런 다음, blastocoel이 5 분 동안 완전히 또는 부분적으로 붕괴되도록 합니다. 다음으로, 작은 파이펫을 사용하여 9웰 페트리 접시의 마이크로 드롭렛 영역의 구멍에 평형 매체를 추가하여 시간 경과 현미경 검사법과 레코딩을 위해 특별히 설계되었습니다. 모든 배지가 첨가되면 약 30마이크로리터의 평형 배지를 가진 마이크로드롭렛 영역을 오버레이한다.

그리고 마이크로 드롭렛 접시의 마이크로 드롭렛 우물의 바닥에 평형 배지에 레이저 처리 된 blastocyst를 침수. 배반구가 옮겨지는 즉시 카운트다운 타이머를 10분 동안 시작합니다. 그리고 카메라가 장착 된 현미경의 무대에서 마이크로 드롭렛 접시를 전송합니다.

200 X 배율로 마이크로드롭렛 접시를 조정하여 발아세포가 레코딩 창의 중앙에 위치하도록 합니다. 그런 다음 기록이 시작되는 카운트다운 시간을 기록하는 현미경 기록 소프트웨어로 녹음을 시작합니다. 배아를 유리화 빨대에 넣은 후, 빨대를 밀봉하고, 80~110초 사이에 액체 질소로 빨대를 떨어놓은 후, 배반을 음의 섭씨 196도로 두십시오.

평형 단계에서 모니터링된 blastocyst의 단면 영역을 측정하기 위해, 발아세포의 가장자리에 닿을 때까지 빠른 선택 도구 마커를 포스팅포낭 내부로 배치하고, 발아세포의 전체 단면 영역이 선택될 때까지 왼쪽 마우스 버튼을 반복적으로 클릭하고 잡아 야폭물의 바깥쪽 가장자리를 윤곽을 잡는다. 그런 다음 타임라인 창에서 측정 로그를 클릭하고 측정값을 기록합니다. 배반제 재확장을 위해 HSV 빨대를 유리화된 배반물로 신속하게 저장에서 액체 질소가 채워진 휴대용 저장소로 이송합니다.

그리고 집게를 사용하여 빨대를 들어 올려 색 처리 막대를 노출시킬 만큼 충분히 높게 들어 올립니다. 자체 조정 와이어 스트리퍼를 사용하여 컬러 핸들링 로드의 높이에서 빨대를 절단합니다. 그리고 신속한 제어 움직임으로 빨대에서 핸들링 로드를 추출합니다.

핸들링 로드의 곡선 주걱을 섭씨 37도 해동 용액의 용기에 즉시 넣습니다. 그리고 부드럽게 배반을 분리하기 위해 핸들링 로드를 소용돌이. 1분 후, 순차적인 4분 몰입 및 희석 용액으로 배반제를 씻으십시오.

세탁용 1개, 세탁용 2개. 다음으로, 따뜻한 배반제를 신선한 회복 매체를 포함하는 4개의 웰 접시에 옮기고 파이펫을 사용하여 세 방울의 중간 크기로 배반제를 씻습니다. 마지막 세척 후, 복구 매체를 포함하는 9 개의 잘 타임 랩스 접시에 배반 구슬을 옮길.

그리고 시간 경과 카메라 아래에 9 개의 잘 접시를 섭씨 37도, 6 % CO2 및 5 % O2 인큐베이터에 놓습니다. 이제 시간 경과 녹화 소프트웨어를 열고 녹화 카메라를 선택합니다. 라이브 모드를 선택하고 이미지에 커서를 배치합니다.

스크롤하여 이미지를 확대하고 왼쪽 마우스 버튼을 사용하여 화면 중앙에 배반구가 포함된 우물을 배치합니다. 초점 아래, 화상 의 기록 평면을 집중하고 빛의 강도아래 이미지의 빛 강도를 설정 화살표를 사용합니다. 현미경 매개 변수를 클릭하여 노출 시간과 감마를 설정하고 라이브 모드를 클릭합니다.

프로젝트를 시작하려면 프로젝트 데이터를 입력합니다. 문화 접시 유형을 선택하고 기록할 위치를 제외한 모든 위치를 선택 취소합니다. 그런 다음 캡처 타이밍을 설정하여 5분마다 사진을 찍고 승인을 클릭하여 최소 150분 동안 배반재 확장을 기록합니다.

이 대표자에서, 지속적으로 모니터링되고, 그대로 태아, 그대로 배반된 배아는 평형용액에서 완전히 붕괴되지 않았고, 평형용액에 10분 동안 노출된 후 원래 크기의 약 70%로 재확장하였다. 대조적으로, 이러한 인위적으로 붕괴된 발아세포는 레이저 처리 직후 발아세포의 완전히 비워졌으며, 평형용액에 노출된 10분 동안 유의한 재확장이 관찰되지 않았다. 고농도의 극저온 보호제를 함유한 진동 배지로 처리한 후, 이 형평형 전동포세포는 발아세포의 단계별 감소를 겪었다.

온난화 후 복구 매체에 노출되면 다시 확장되었습니다. 그러나 이 레이저 펄스 배반세포는 레이저로 치료할 때 blastocoel의 즉각적인 붕괴를 보여주었으며, 이는 평형 또는 진동 단계 중에 복구되지 않았으며 붕괴된 배반구에 대한 이러한 긴 평형 단계의 필요성에 의문을 제기했습니다. 이 프로토콜은 또한 온난화 후 blastocoel을 복구하는 배반구체의 능력에 대한 통찰력을 제공합니다.

예를 들어, 온난화 후 blastocoel 재팽창이 선형일 수 있거나 몇 가지 더 크거나 작은 수축으로 중단될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 배아는 가능한 한 적은 시간 동안, 녹음 하는 동안 페트리 접시의 바닥에 남아 있어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 고농도의 냉동 보호제가 배아에 독성이 있을 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

각 개발 후, 이 기술은 체외 수정 프로그램에서 냉동 보존 프로토콜의 효과를 탐구하기 위해 냉동 생물학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.