Name: Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 학습하세요 체외수정 실험실에서 타임랩스 현미경을 활용한 블라스토시스트 비트리피케이션 및 해동 후 회복 과정의 형태학적 모니터링 방법을. 이 프로토콜은 배아 동결보존 기술의 효율성을 평가하는 데 필수적입니다.

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이 작품 연구 프로그램 P3-0327 및 연구 프로젝트 J3-7177, 슬로베니아어 연구 재단에 의해 설립 된의 일부입니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 19 4 월 2016 (0120-204/2016-2 호)에 국가 의료 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 현미경 녹화 시스템의 설정
<ol><li>현미경의 난방 격판덮개를 해제 합니다.</li>
	<li>어떤 치료를 하기 전에 카메라 장착 거꾸로 현미경 blastocyst의 스냅숏을. 확대는 blastocyst 기록 된 참고 하도록 하십시오.</li>
</ol>2. 선택과 Vitrification 위한 Blastocysts의 Prepreparation
<ol><li>유일한 완전히 확장 된 하루 5 또는 하루 6 blastocysts cryopreservation 적어도 몇 안 세포 질량 (ICM) 세포와 응집력 trophectoderm에 대 한 선택 합니다.</li>
	<li>축소 된 blastocoel와 레이저 치료 blastocysts에 대 한 주제 구멍 직경 4.3에서 9.4 µ m에 이르는 짧은 레이저 펄스 (0.4-0.7 ms) blastocyst tangentially zona pellucida, 두 개의 인접 한 trophectodermal 셀의 교차점에를 감독. 5 분 동안 완전히 또는 부분적으로 붕괴 blastocyst 허용.</li>
	<li>그대로 blastocoel와 치료 blastocysts, vitrification 전에 특정 치료를 수행 합니다. 참고: 이러한 blastocysts 그대로 간주 됩니다.</li>
</ol>3. 평형 단계 Cryoprotectant 및 페 트리 접시의 준비
<ol><li>Aseptically 평형 미디어를 채우기 위해 oocyte 노출 (µ m 직경 135)에 대 한 사용 pithe 피 펫 (M-199 HEPES 버퍼링 매체 7.5 %DMSO, 7.5% 에틸렌 글리콜, 20%와 DSS) microdroplet 영역을 위해 특별히 설계 된 9 잘 배양 접시의 구멍에 시간 경과 현미경 검사 법 그리고 기록입니다. 참고: Oocyte 노출은 oocyte 둘러싸고 적 운 세포를 제거 하는 프로세스입니다. Oocyte 노출에 대 한 한 피 펫의 사용 공기 방울의 생성을 피하기 위해 도움이 됩니다.</li>
	<li>재래식 미디어의 30 µ L 함께 microdroplet 영역을 오버레이.</li>
</ol>4. 평형 솔루션에서 Blastocyst의 전송
<ol><li>실 온 (평형 단계)에서 10 분 동안 microdroplet 접시의 microdroplet 영역의 아래쪽에 레이저 치료 또는 그대로 blastocyst 평형 매체에 잠수함.</li>
	<li>blastocyst 평형 매체에 전송 되 자 마자 10 분 카운트 다운을 시작 합니다.</li>
</ol>5. 평형 단계에서 Blastocyst의 기록
<ol><li>카메라 장착 된 현미경에는 blastocyst와 microdroplet 접시를 전송 합니다. 사용 하 여 같은 확대 이전 같은 blastocyst의 스냅샷을 복용에 대 한. 위치는 microdroplet 접시는 blastocyst 녹음의 중심에 배치 되도록.</li>
	<li>레코딩 소프트웨어 현미경으로 녹음을 시작 합니다. 참고 녹음 시작 카운트 다운 시간. 주: 재래식 솔루션 10 분 노출 시는 그대로 (그림 1, 비디오 1)과 (그림 2, 비디오 2) 축소 blastocyst의 녹음의 대표적인 결과 참조 하십시오.</li>
</ol>6입니다.는 Blastocyst의 vitrification
<ol><li>Aseptically의 vitrification 솔루션 (M-199 HEPES 버퍼링 매체 15 %DMSO, 15% 에틸렌 글리콜, 20 %DSS, 0.5 M 자당) 페 트리 접시 2 분 카운트다운이 종료 되기 전에 50 µ L 드롭 분배.</li>
	<li>10 분 카운트다운 종료 하는 blastocyst vitrification 30에 대 한 솔루션 신속 하 게 전송 하는 때 기록 중지 실 온에서 s.</li>
	<li>부드럽게는 blastocyst 플라스틱 vitrification 솔루션 내에서 적어도 1 x.</li>
	<li>밀 짚 vitrification를 사용 하 여 로드는 blastocyst. 로드, 물개, 및 80 내 액체 질소 (LN)에 빠지게 짚 vitrification 110을 초과 하지 않는 s s vitrification 솔루션 초기 노출 후.</li>
</ol>7. 평형 단계 기록된 Blastocyst의 비디오 편집
<ol><li>소프트웨어를 편집 하는 비디오로 녹화 된 비디오 파일을 가져옵니다.</li>
	<li>이 이번에 20 s. 참고 프레임 번호를 시간 표시 막대 슬라이더를 이동 합니다. 참고:이 번호는 불필요 한 비디오 프레임을 시키면서 사용 됩니다. 만 모든 20 프레임 s 사용 됩니다.</li>
	<li>비디오 탭, 다음 프레임 속도...를 클릭 합니다. 프레임 속도 변환, 아래 여 Decimate 필드를 확인 하 고 앞에서 설명한 프레임 번호를 입력 합니다. 확인을 클릭 하 여 확인 합니다. 클릭 파일 → 내보내기 → 이미지 시퀀스.</li>
	<li>출력 형식으로 JPEG를 선택, 이미지의 저장 순서를 디렉터리를 설정 하 고 확인을 클릭 합니다. 참고:이 디렉터리 기록된 blastocyst의 최대 30 이미지에 만들어집니다 시퀀스 vitrification의 평형 단계.</li>
</ol>8. 평형 단계에서 생성 된 이미지에서 Blastocyst의 단면적의 측정
<ol><li>비디오 분석 소프트웨어를 엽니다. 창 탭을 클릭 하 고 타임 라인을 선택 합니다.</li>
	<li>타임 라인 창에서 필름 스트립 기호를 클릭 하 고 선택 vitrification의 평형 단계 전에 blastocyst의 이미지를 추가 하려면 미디어 추가... -어떤 것이 있었다면 레이저 개입 하기 전에. 참고:이 이미지는 가장 확장 된 상태에서 blastocyst 표시 됩니다 하 고 그것의 단면적을 기준으로 될 것입니다.</li>
	<li>(Vitrification의 평형 단계)의 비디오 편집 소프트웨어와 함께 이전에 생성 된 해당 blastocyst의 이미지 시퀀스를 추가 합니다.</li>
	<li>이미지 → 분석 → 선택 데이터 포인트 → 이동 사용자 정의 데이터 포인트를 선택 창을 엽니다.</li>
	<li>모든 데이터 요소를 취소 다음만 영역 을 선택 하 고 확인을 클릭 하 여 확인.</li>
	<li>첫 번째 이미지에 타임 라인 창에서 시간 표시 막대 슬라이더를 이동 합니다.</li>
	<li>창 탭을 클릭 하 고 도구를 선택 합니다. 참고:이 왼쪽에 [도구] 패널을 활성화 합니다.</li>
	<li>빠른 선택 도구를 선택 합니다.</li>
	<li>터치는 blastocyst의 가장자리 blastocyst 내부 도구 마커를 배치 합니다. 클릭 blastocyst의 외부 가장자리에 도구 마커를 배치 하 여 있는 blastocyst를 약술 하 고 마우스 왼쪽된 버튼을 전체 blastocyst의 단면적까지 blastocyst의 외부 가장자리를 따라 도구 마커를 드래그 선택 되어. 참고: Zona pellucida 아니다 해야 합니다 그래서 측정 부분 제외 (그림 5).</li>
	<li>타임 라인 창에서 측정 로그 를 클릭 하 고 측정 기록 버튼을 누릅니다. 참고:이 선택한 영역을 기록 합니다.</li>
	<li>다시 타임 라인으로 돌아갑니다, 그리고 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 취소를 선택 합니다.</li>
	<li>다음 이미지를 시간 표시 막대 슬라이더를 이동 하 고 아래 해당 타일에 클릭 합니다.</li>
	<li>빠른 선택 도구와 새로운 이미지에서 blastocyst 개요. 측정을 반복 합니다.</li>
	<li>이 절차 (단계 8.9 ~ 8.13) 이미지에 의해 이미지를 반복 하 여 모든 이미지의 횡단면 지역 측정 및 기록 합니다.</li>
	<li>결국, 측정 로그에 지역 변수에서 모든 측정을 선택 하 고.txt 파일에 수출 이동 합니다. 참고: 단면적의 단위는 정사각형 픽셀.</li>
</ol>9. 평형 단계 만든 이미지에서 기록 된 Blastocyst의 횡단면 영역 데이터 파일의 편집
<ol><li>.Txt 파일에서 스프레드시트 편집기 기록된 blastocyst의 횡단면 영역 데이터를 전송.</li>
	<li>첫 번째 단면적 값 참조 값 1 표현으로 (변환) 값을 참조 하는 모든 다른 값의 일부분을 사용 합니다.</li>
	<li>새로운 변수 Area_r를 만들고 아래 코드 영역 값 (기준 값)을 제외 하 고.</li>
	<li>Area_r 변수 옆 시간 변수 만들고 첫 번째 시간 값을 추가 합니다. 참고: 첫 번째 시간 값 평형 해결책 기록 카메라 장착 된 현미경의 발병에는 blastocyst 노출 된 순간부터 전달 시간을 나타냅니다.</li>
	<li>20를 추가 하 여 각 다음 연속 시간 값을 계산 이전 시간 값을 s. 참고:이 녹음 하는 동안 만든 불필요 한 비디오 프레임을 전 멸에 사용 되는 시간 간격입니다.</li>
</ol>10. 온난화는 Blastocyst의
<ol><li>온난화에 대 한 미디어를 준비 합니다.<ol>
<li>하루는 blastocyst 온난 전에 aseptically 3 150 µ L 상품 4-잘 접시에 복구 매체의 분배. 또한, aseptically microdroplet 9-잘 접시 시간 경과 현미경을 위해 특별히 디자인 하 고 기록에 복구 매체 분배. 파라핀 오일 복구 매체를 커버 하 고 6% CO2 와 5% O237 ° C에서 preincubate. 참고: 복구 매체 추가 인간 혈 청 알 부 민 (HSA)와 blastocyst 단계 배아에 대 한 재배 매체가입니다. 복구 매체에서 HSA 12 mg/mL 이어야 한다. 9-잘 접시에 구멍을 채우기 위해 oocyte 노출에 대 한 피 펫을 사용 하 여 공기 방울의 생성을 피하기 위해 다음 오버레이 복구 매체의 30 µ L로 microdroplet 지역.</li>
		<li>온난화는 blastocyst의 날, aseptically 솔루션 (TS)에 4-잘 접시의 단일 잘 녹고의 500 µ L를 분배 하 고 CO2없이 인큐베이터에서 37 ° C 따뜻한 있습니다.</li>
		<li>실내 온도에, aseptically를 분배 한 50 µ L 방울 희석 솔루션 (DS) 및 2 개의 50 µ L 세척 솔루션 (WS)의 멸 균 페 트리 접시에. 파라핀 오일 DS WS1 및 WS2 방울 커버. 참고: 페 트리 접시 대신 4-잘 접시도 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>따뜻한는 blastocyst.<ol>
<li>LN 저장소에서 제거 하 고 지구 온난화 절차에 대 한 준비는 LN 가득 휴대용 저수지에 빨 대를 빠르게 전송할 vitrified blastocyst와 HSV 빨 대를 식별 합니다.</li>
		<li>집게와 빨 대를 들어 올려 노출 색된 처리 로드에 충분. 자체 조정 와이어 스 트리 퍼를 사용 하 여 색깔된 처리 막대의 높이에 빨 대를 잘라.</li>
		<li>처리 로드를 잡아 신속, 아직 통제 운동, 밀 짚에서 그것을 추출 하 고 즉시 처리 로드의 곡선된 주걱 37 ° C TS 급락.</li>
		<li>부드럽게 하는 blastocyst 분리 그것 TS에 1 분의 총에 대 한 처리 로드를 소용돌이 친다.</li>
		<li>실내 온도에, 전송에서 blastocyst 연속적으로 DS, WS1 및 WS2 각 매체에서 4 분.</li>
		<li>지구 온난화 절차 후 복구 매체와 4-잘 접시는 blastocyst 전송 하 고 부드럽게 pipetting으로 모든 3 상품에 그것을 씻어. 참고: 세척 약 1 분에 실시 됩니다.</li>
		<li>복구 매체와 시간 경과 9-잘 접시는 blastocyst 전송. (6% CO2 와 5% O237 ° C)에서 인큐베이터에서 시간 경과 카메라 아래 9-잘 접시를 놓습니다. 참고: 시간 경과 카메라 아래 9-잘 접시는 인큐베이터에 배치와 함께 계속, Thre 온난화 절차 약 17 분 지속.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. 복구 후 온난화 동안 Blastocyst 다시 확장의 시간 경과 기록
<ol><li>시간 경과 기록 소프트웨어를 실행 합니다.</li>
	<li>기록 카메라를 선택 하십시오.</li>
	<li>라이브 모드 단추를 누릅니다.</li>
	<li>이미지에 마우스 커서를 놓고 스크롤 단추를 사용 하 여 그것을 확대 하려면. 클릭 하 고 마우스 왼쪽된 버튼 배치 화면 blastocyst와 잘 커서 이동.</li>
	<li>초점, 아래는 blastocyst의 녹음 평면 초점을 위 아래 녹색 화살표를 사용 합니다. 빛의 강도, 빛의 강도 설정 합니다.</li>
	<li>노출 시간 및 감마 설정 현미경 매개 변수 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>라이브 모드 닫기를 누릅니다.</li>
	<li>프로젝트 시작 버튼을 눌러 및 프로젝트 데이터 입력 문화 접시 유형 (3 x 3 또는 4 x 4)을 선택 하 고 기록 하나를 제외한 모든 위치를 선택 취소.</li>
	<li>5 분 마다 그림을 캡처 타이밍을 설정 합니다.</li>
	<li>승인 버튼을 눌러 녹음을 시작 합니다. 150 분 이상 기록.</li>
	<li>프로젝트를 중지 버튼을 눌러 녹음을 중지 합니다. 참고: 복구 기간에 후 지구 온난화는 그대로 (그림 3)과 (그림 4) 축소 blastocyst의 녹음의 대표적인 결과 보기</li>
</ol>12. 다시 확장 후 온난화 동안 기록된 Blastocyst의 비디오 편집
<ol><li>프로젝트 폴더에가 고는 약 80 KB 크기에 기록 된 이미지를 찾습니다.</li>
	<li>다른 폴더를 만들고 그것에 이러한 이미지를 전송 합니다. 만든 시간에 따라 숫자에 이미지를 이름을 바꿉니다. 소프트웨어 이미지 시퀀스를 편집 하는 비디오로 그들을 가져옵니다.</li>
	<li>비디오 탭 → 필터 → 이동 추가 및 선택 Null 변환 필터.</li>
	<li>오른쪽에 있는 자르기 버튼을 클릭 하 고 떠나 볼 수만 필드 기록된 blastocyst 이미지 자르기. 확인 및 확인다시 확인 합니다.</li>
	<li>클릭 파일 → 내보내기 → 이미지 시퀀스. 출력 형식으로 JPEG를 선택, 이미지의 저장 순서를 디렉터리를 설정 하 고 확인을 클릭 합니다. 참고: 이것은 비디오 분석 소프트웨어에서 추가 측정을 위해 준비 하는 크기 (자른된) 이미지를 만듭니다.</li>
</ol>13. 시간 경과 기록 소프트웨어를 사용 하 여 만든 이미지에 대 한 비디오 분석 소프트웨어에서 측정 비율 설정
<ol><li>시간 경과 기록 소프트웨어의 분석기를 실행 합니다.</li>
	<li>기록 된 blastocyst 프로젝트를 엽니다.</li>
	<li>기록 된 blastocyst와 필드에서 분석 단추를 클릭 합니다. 참고: 새로운 분석 창이 열립니다. 측정 도구를 표시 하려면 측정 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>전체 이미지의 너비를 측정 하는 측정 도구를 사용 합니다.</li>
	<li>이미지에 마우스 하 고 그것을 저장. 속성에서 이미지의 너비 (픽셀) 확인 합니다.</li>
	<li>이미지의 실제 너비를 픽셀 단위로 너비를 나눕니다. 참고:이이 이미지의 단일 픽셀의 실제 길이 계산합니다.</li>
	<li>비디오 분석 소프트웨어를 실행 합니다.</li>
	<li>창 탭을 클릭 하 고 타임 라인을 선택 합니다.</li>
	<li>타임 라인 창에서 필름 스트립 기호를 클릭 하 고 이후 따뜻한 다시 확장 blastocyst의 이미지 시퀀스를 추가 하려면 미디어 추가... 를 선택 합니다.</li>
	<li>클릭 이미지 → 분석 → 측정 비율 설정 → 사용자 정의 측정 비율 창을 엽니다. 픽셀 길이 입력 1; 논리 길이 입력 픽셀 (단계 13.6);의 이전에 계산 된 실제 길이 논리 단위에 대 한 입력 µ m. 프리셋 저장.</li>
</ol>14. 다시 확장 후 따뜻한 동안 작성 된 이미지에서 Blastocyst의 단면적의 측정
<ol><li>측정 비율 설정 및 가져온 이미지 시퀀스 일단 측정 blastocyst의 횡단면 지역 같은 방법으로 단계에서 설명한 8, 유일한 차이이 측정에서 측정 된 횡단면 영역2 µ m에 있는 단위 .</li>
</ol>15. 다시 확장 후 따뜻한 동안 만들어진 이미지에서 기록 된 Blastocyst의 횡단면 영역 데이터 파일의 편집
<ol><li>.Txt 파일에서 스프레드시트 편집기 기록된 blastocyst의 횡단면 영역 데이터를 전송.</li>
	<li>시간 변수를 지역 변수 옆 고 처음 시간 값을 추가 합니다. 참고:이 경우에, 첫 번째 시간 값은 0 분은는 설정 시간 경과 기록의 발병. 각 다음 연속 시간 값 이전 시간 값을 5 분을 추가 하 여 계산 됩니다. 5 분 2 연속 시간 경과 기록 사이 사용 되는 시간 간격입니다.</li>
</ol>16입니다. 라인 다이어그램 생성
<ol><li>Vitrification 또는 재 확장 후 온난화의 평형 단계 시간에서 blastocyst의 횡단면 지역 변화의 시간 줄거리를 만들기 위한 통계 분석 소프트웨어에서 스프레드시트 데이터 파일을 가져옵니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

동안 blastocyst morphodynamics의 전후 cryopreservation 또한 실시 될 수 있습니다 유사한 악기와 다른 제조 업체에서 소프트웨어 도구를 사용 하 여 관찰에 대 한 프로토콜. 발생 학에 대 한 조정 시간 경과 시스템 배아 개발의 지속적인 모니터링을 허용 합니다. 이 작품의 목적은 vitrification를 자신의 온난 후 blastocysts의 준비 동안 blastocyst 동작의 정량화를 소개 했다. 이 변경에는 날짜 표시줄에 형태학의 객관적인 측정에 의해 수행 되었다. 이러한 측정의 취득된 결과 수학적으로 분석 하 고 다른 결과와 비교 될 수 있습니다. 설명된 프로토콜에 따라 할 수 있는 매개 변수 중에서 blastocyst의 크기에서 변화, 그것의 안 세포 질량, blastocoel, 또는 zona pellucida 특정 기간 내. 크기의 볼륨으로도 계산 후, 그리고 큰 blastocyst 횡단면, blastocyst 둘레 또는 직경, 표면 영역으로 표시할 수 있습니다.
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체 외에서 수정 프로그램 (IVF)에서 인간의 preimplantation 배아의 cryopreservation 요즘 대부분 IVF 실험실에서 일상적인 연습 이다. 느린 배아 동결 방법 특정 cryoprotectants 및 얼음 nucleation (시드)에서 유도 되었다 때-7 ° c, 배아의 제어 냉각을 컴퓨터 제어 냉동 고의 도입으로 1985 년에 임상으로 사용 되기 시작 합니다 주변 cryoprotective 매체1. 연속 냉각에 의해 얼음 결정 성장 할 것, 나머지 액체 분수와, 따라서, 탈수의 hyperosmolality를 일으키는 원인이 되 고 배아 세포의 수축 량. -30 ° C 또는-80 ° C, 배아는 저장을 위해 액체 질소에 뛰어들었다 것 이다. 냉각 하는 동안 배아 또는 oocytes 일어나 cryopreservation 프로토콜2를 개선 하는 데 도움이 특별히 적응된 cryomicroscopes에 의해서만 관찰 될 수 있었다. Blastocysts, 높은 볼륨 및 더 액체 포함 된 배아 단계의 그 일3에서 덜 유망한 임상 결과 주었다.
돌파구는 blastocyst의 cryopreservation에 있는 세포의 탈수 일어났다 cryoprotectants4의 높은 농도 사용 하 여 냉각 하기 전에 vitrification 방법의 소개 했다. Vitrification 전에 blastocoel에서 액체의 제거는 또한 두 trophectoderm 셀5사이 기계적인 개방 함으로써 얻을 수 있습니다. Vitrification 온난 후 즉각적인 blastocyst 생존 율은 90%, 그리고 임상 결과 다음 위에 자 궁 캐비티에 vitrified 따뜻하게 blastocyst의 이전은 거의 결과 신선한 전송 후 배아가 cryopreservation 메서드는 아직 표준화 된6,7되지 않았습니다. Vitrification 프로토콜 (a) 종류와 cryoprotectants, (b) previtrification 단계 수의 농도 (c)의 각 단계, (d), vitrification 전에 붕괴 하는 인공 blastocoel의 사용 기간에 따라 다릅니다 (e). 8vitrified 배아 해야하는에서 방법, (f) blastocyst 확장 단계, 및 (g) 평형/vitrification 온도 축소. Cryoprotectants는 셀에 대 한 독성이 있을 수 있습니다, blastocyst 노출 시간이이 솔루션에는 잘 정의 해야 합니다. 그러나, 일부 cryopreservation 미디어 제조 업체는 매우 유연한 프로토콜을 허용합니다.
과학자의 관심 새로운 생체 이식6,,910의 더 나은 예측을 찾을 목적으로 blastocyst 다시 확장 능력을 공부에 일반적으로 집중 된다. 인간 blastocysts cryoprotectants vitrification 고 무슨 blastocysts vitrification 온난 후 발생 하기 전에 추가의 다른 단계에서 탈수, 어떻게 cryoprotectants 있을 때 셀, 그리고 어떻게 된 blastocysts rehydrate에서 제거 하 고 다시 온난 후 확장, 잘 설명도 이해. 목표에 대 한 방법론의 개발 및 다른 cryopreservation 단계 blastocyst 행동의 정량 모니터링은, 따라서, 근거입니다.
다양 한 제조 업체의 시간 경과 현미경, 그건 이제 사전에서 blastocyst의 동작 및 사후 vitrification 단계 모니터링 가능. 추가 컴퓨터 도구를 포함 하 여 그들의 크기 (morphometry)의 측정 또한 수행할 수 있습니다. 으로 감소를 측정 또는 주어진된 시간에 배아 크기에서 증가 디하이드레이션 및 리하이드레이션 동안 배아의 morphodynamics의 평가 객관성을 가능 하다.

<table><tbody><tr><td>도립 현미경 Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>니콘, 일본</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Saturn 5 Laser System</td><td>Research Instruments, Origio, 덴마크</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라 DC1</td><td>Research Instruments, Origio, 덴마크</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라 DC2</td><td>Research Instruments, Origio, 덴마크</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Cronus 3.7</td><td>Research Instruments, Origio, 덴마크</td><td>/</td><td>현미경 기록 소프트웨어</td></tr><tr><td>6% CO2, 5% O2 바인더가 있는 인큐베이터</td><td>, 독일</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Primo Vision 현미경</td><td>Vitrolife, 스웨덴</td><td>16600</td><td></td></tr><tr><td>Primo Vision Capture 소프트웨어</td><td>Vitrolife, 스웨덴</td><td>16608</td><td>타임랩스 녹화 소프트웨어</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS6 확장 소프트웨어</td><td>Adobe Systems Incorporated, USA/</td><td></td><td>비디오 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>VirtualDub&nbsp;</td><td>Avery Lee</td><td>/</td><td>비디오 편집 소프트웨어</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excell&nbsp;</td><td>Microsoft, 미국</td><td>/</td><td>스프레드시트 편집기</td></tr><tr><td>PrimoVision 배양 접시</td><td>Vitrolife, 스웨덴</td><td>16604</td><td></td></tr><tr><td>G2-plus medium</td><td>Vitrolife, 스웨덴</td><td>10132</td><td>배반포 단계 배아용 배양 배지</td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td><td>Vitrolife, 스웨덴</td><td>10064</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 오일</td><td>Vitrolife, 스웨덴</td><td>10029</td><td></td></tr><tr><td>평형 용액 매체</td><td>Irvine Scientific, Ireland</td><td>90131</td><td></td></tr><tr><td>유리화 용액 매체</td><td>Irvine Scientific, Ireland</td><td>90132</td><td></td></tr><tr><td>해동 용액 매체</td><td>Irvine Scientific, Ireland</td><td>90134</td><td></td></tr><tr><td>희석 용액 매체</td><td>Irvine Scientific, Ireland</td><td>90135</td><td></td></tr><tr><td>세척 용액 매체</td><td>Irvine Scientific, Ireland</td><td>90136</td><td></td></tr><tr><td>HSV 유리화 빨대</td><td>CryoBio System, France</td><td>025246, 025249, 025250, 025248</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>극저온 용기 Biosafe 120 MD &beta;</td><td>Cryotherm, 독일</td><td>229286</td><td></td></tr><tr><td>극저온 탱크</td><td>Cryotherm, 독일</td><td></td><td></td></tr> 배반포 조작 Gynetics용 <tr><td>독일 집게</td><td></td>/<td></td>/<td></td></tr><tr><td>가위</td><td>/</td><td></td>/<td></td></tr><tr><td>피펫</td>, <td>벨기에</td><td>ID275/10</td><td>직경 275 &마이크로; </td></tr><tr><td>m 난모 세포 탈변을 위한 피펫</td><td>Vitromed, 독일</td><td>V-DEN-135</td><td>직경 135 &마이크로; m</td></tr><tr><td>피펫터 EZ-Grip</td><td>Research Instruments</td><td>7-72-2802</td><td></td></tr><tr><td>디지털 간격 타이머 Assistent</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td><td>41977010</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics 21</td><td>IBM, USA/</td><td></td><td>통계 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>자체 조정 와이어 스트리퍼</td><td>Knipex, 독일</td><td>1262180</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrification 온난 단계 동안 blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

이 문서 blastocyst morphometry blastocyst의 볼륨 vitrification 전후 개별 단계 변경의 정확한 모니터링에 대 한 시간 경과 microphotography에 따라 비 침 투 적인 방법을 설명 합니다. 메서드는 blastocyst 수축 및 다시-확장 다른 사전 및 사후 vitrification 단계를 관찰 하 여 blastocyst cryoprotectants의 다른 농도에 노출의 가장 최적의 타이밍에 대 한 검색에 유용할 수 있습니다. 이 방법론 blastocyst vitrification 프로토콜을 최적화할 수 있습니다. 이 형태학 방법의 유용성의 더 나은 데모, vitrification에 대 한 두 개의 다른 blastocyst 준비 프로토콜 비교; 붕괴 하는 인공 blastocoel를 사용 하 여 하나 고 하나 vitrification 전에이 개입 없이. 두 blastocysts' 볼륨 변화는 시간 경과 microphotography 뒤 사진 편집 소프트웨어 도구에 의해 측정. Previtrification 단계에서 매 20 초 및 이후 지구 온난화 기간에 5 분 마다 측정 가져옵니다. 시간 단위 당 blastocyst 크기의 변화는 라인 다이어그램에 그래픽으로 표시 됩니다. 결과 있는 그대로 blastocyst 먼저 축소 및 다음 천천히 입력 vitrification 액체가 채워진 blastocoel와 blastocoel은 긴 평형 previtrification 단계 보여. 인위적으로 축소 blastocyst 전체 평형 단계 긴축된 단계에 남아 있습니다. Vitrification 단계 동안, 그것은 또한 변경 되지 않습니다의 볼륨. Blastocyst morphometry previtrification 단계 동안 인위적으로 축소 된 blastocysts의 일정 볼륨을 보여줍니다, 때문에 그것은이 단계 짧은 것 같다. 설명된 프로토콜 중와 속도 볼륨 변경, 부분 blastocoel 수축 또는 총 blastocyst의 수의 강도 기준 cryopreservation 후 blastocyst 행동의 많은 추가 비교 매개 변수를 제공합니다. 붕괴, 그리고 총 blastocoel 다시 확장 하는 시간 또는 부 화 하는 시간.

데모, 우리는 하나의 previtrification에 한 후 지구 온난화 단계 blastocyst morphodynamics을 보였다. 한 차이 blastocyst의 볼륨에 평형 단계의 끝에와 문화 매체는, 사실, 배아 수축 강도 보여 얼음 결정 화에 대 한 배아 보존의 강도 회복의 시작 부분에.
그것은 비디오 1과 그림 1 에서 발견 될 수, 평형 솔루션에서 그대로 blastocyst 완전히 축소 되지 않았다. blastocoel 부분적 으로만 계약을 하지만 10 분 이내 그것 천천히 다시 확장 크기의 70%에 도달. 이, 반대로 인위적으로 축소 blastocyst는 완전히 비우지는 blastocoel 레이저 치료 후 즉시 하지만 재래식 솔루션에 볼륨 더 (<strong clas...

여기 previtrification 개입 및 후 지구 온난화 복구 동안 blastocyst 수축 하 고 다시 확장의 강도 따라 시간 경과 형태학 프로토콜 선물이. 프로토콜의 응용 프로그램에서 체 외에서 수정 시간 경과 현미경을 장착 가능 하며 최적의 blastocyst vitrification 방법의 개발에 것이 좋습니다.

Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

이 형태 측정 프로토콜은 사전 진동 개입 및 온난화 후 복구 중에 배반구 수축 및 재확장 강도를 모니터링할 수 있으며 바이러스 진동 방법의 효과에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 고급 이미지 편집 소프트웨어가있는 시간 경과 현미경 및 컴퓨터를 갖춘 체외 수정 실험실에 적용 할 수 있다는 것입니다. 확장의 5 또는 6일째에, 적어도 몇 개의 내부 세포 질량 세포와 응집력 있는 트로페토데름을 0.4 내지 0.7 밀리초 레이저 펄스로 발주하여 4.3 내지 9.4 마이크로미터에 이르는 구멍 직경을 가진 조나 펠루치다와 인접한 두 개의 인접한 트로페토더말 세포의 접합을 지향한다.그런 다음, blastocoel이 5 분 동안 완전히 또는 부분적으로 붕괴되도록 합니다. 다음으로, 작은 파이펫을 사용하여 9웰 페트리 접시의 마이크로 드롭렛 영역의 구멍에 평형 매체를 추가하여 시간 경과 현미경 검사법과 레코딩을 위해 특별히 설계되었습니다. 모든 배지가 첨가되면 약 30마이크로리터의 평형 배지를 가진 마이크로드롭렛 영역을 오버레이한다.그리고 마이크로 드롭렛 접시의 마이크로 드롭렛 우물의 바닥에 평형 배지에 레이저 처리 된 blastocyst를 침수. 배반구가 옮겨지는 즉시 카운트다운 타이머를 10분 동안 시작합니다. 그리고 카메라가 장착 된 현미경의 무대에서 마이크로 드롭렛 접시를 전송합니다.200 X 배율로 마이크로드롭렛 접시를 조정하여 발아세포가 레코딩 창의 중앙에 위치하도록 합니다. 그런 다음 기록이 시작되는 카운트다운 시간을 기록하는 현미경 기록 소프트웨어로 녹음을 시작합니다. 배아를 유리화 빨대에 넣은 후, 빨대를 밀봉하고, 80~110초 사이에 액체 질소로 빨대를 떨어놓은 후, 배반을 음의 섭씨 196도로 두십시오.평형 단계에서 모니터링된 blastocyst의 단면 영역을 측정하기 위해, 발아세포의 가장자리에 닿을 때까지 빠른 선택 도구 마커를 포스팅포낭 내부로 배치하고, 발아세포의 전체 단면 영역이 선택될 때까지 왼쪽 마우스 버튼을 반복적으로 클릭하고 잡아 야폭물의 바깥쪽 가장자리를 윤곽을 잡는다. 그런 다음 타임라인 창에서 측정 로그를 클릭하고 측정값을 기록합니다. 배반제 재확장을 위해 HSV 빨대를 유리화된 배반물로 신속하게 저장에서 액체 질소가 채워진 휴대용 저장소로 이송합니다.그리고 집게를 사용하여 빨대를 들어 올려 색 처리 막대를 노출시킬 만큼 충분히 높게 들어 올립니다. 자체 조정 와이어 스트리퍼를 사용하여 컬러 핸들링 로드의 높이에서 빨대를 절단합니다. 그리고 신속한 제어 움직임으로 빨대에서 핸들링 로드를 추출합니다.핸들링 로드의 곡선 주걱을 섭씨 37도 해동 용액의 용기에 즉시 넣습니다. 그리고 부드럽게 배반을 분리하기 위해 핸들링 로드를 소용돌이. 1분 후, 순차적인 4분 몰입 및 희석 용액으로 배반제를 씻으십시오.세탁용 1개, 세탁용 2개. 다음으로, 따뜻한 배반제를 신선한 회복 매체를 포함하는 4개의 웰 접시에 옮기고 파이펫을 사용하여 세 방울의 중간 크기로 배반제를 씻습니다. 마지막 세척 후, 복구 매체를 포함하는 9 개의 잘 타임 랩스 접시에 배반 구슬을 옮길.그리고 시간 경과 카메라 아래에 9 개의 잘 접시를 섭씨 37도, 6 % CO2 및 5 % O2 인큐베이터에 놓습니다. 이제 시간 경과 녹화 소프트웨어를 열고 녹화 카메라를 선택합니다. 라이브 모드를 선택하고 이미지에 커서를 배치합니다.스크롤하여 이미지를 확대하고 왼쪽 마우스 버튼을 사용하여 화면 중앙에 배반구가 포함된 우물을 배치합니다. 초점 아래, 화상 의 기록 평면을 집중하고 빛의 강도아래 이미지의 빛 강도를 설정 화살표를 사용합니다. 현미경 매개 변수를 클릭하여 노출 시간과 감마를 설정하고 라이브 모드를 클릭합니다.프로젝트를 시작하려면 프로젝트 데이터를 입력합니다. 문화 접시 유형을 선택하고 기록할 위치를 제외한 모든 위치를 선택 취소합니다. 그런 다음 캡처 타이밍을 설정하여 5분마다 사진을 찍고 승인을 클릭하여 최소 150분 동안 배반재 확장을 기록합니다.이 대표자에서, 지속적으로 모니터링되고, 그대로 태아, 그대로 배반된 배아는 평형용액에서 완전히 붕괴되지 않았고, 평형용액에 10분 동안 노출된 후 원래 크기의 약 70%로 재확장하였다. 대조적으로, 이러한 인위적으로 붕괴된 발아세포는 레이저 처리 직후 발아세포의 완전히 비워졌으며, 평형용액에 노출된 10분 동안 유의한 재확장이 관찰되지 않았다. 고농도의 극저온 보호제를 함유한 진동 배지로 처리한 후, 이 형평형 전동포세포는 발아세포의 단계별 감소를 겪었다.온난화 후 복구 매체에 노출되면 다시 확장되었습니다. 그러나 이 레이저 펄스 배반세포는 레이저로 치료할 때 blastocoel의 즉각적인 붕괴를 보여주었으며, 이는 평형 또는 진동 단계 중에 복구되지 않았으며 붕괴된 배반구에 대한 이러한 긴 평형 단계의 필요성에 의문을 제기했습니다. 이 프로토콜은 또한 온난화 후 blastocoel을 복구하는 배반구체의 능력에 대한 통찰력을 제공합니다.예를 들어, 온난화 후 blastocoel 재팽창이 선형일 수 있거나 몇 가지 더 크거나 작은 수축으로 중단될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 배아는 가능한 한 적은 시간 동안, 녹음 하는 동안 페트리 접시의 바닥에 남아 있어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 고농도의 냉동 보호제가 배아에 독성이 있을 수 있다는 것을 잊지 마십시오.각 개발 후, 이 기술은 체외 수정 프로그램에서 냉동 보존 프로토콜의 효과를 탐구하기 위해 냉동 생물학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.

morphometric-protocol-for-objective-assessment-blastocyst-behavior

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

MicroSecure Vitrification은 FDA 우수 제조 및 조직 취급 관행을 준수하는 비상업적인 무균 폐쇄 유리화 장치 시스템으로 개발되었습니다. 소수성 플러그 배아 빨대가 업계에서 철수함에 따라 유리화 절차는 표준 내부 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 수정되었습니다.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

배반포 생검 및 유리화는 착상 전 유전자 검사를 효율적으로 수행하기 위해 필요합니다. 조나 펠루시다의 순차적 개방및 5-7일째에 7-8개의 트로페토더세포를 회수하는 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 이하의 환경 조건으로 제한한다.

인간 배반포 생검 및 유리화

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

이 원고는 상업적 지원에 실험실에서 만든 미디어와 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 전 생체 부 조나에서 바이피화및 온난화에 이르는 난소 분리에서 부터 모든 단계를 다룹니다.

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

성장 인자 ß 를 변형할 때 가족 전구체 단백질은 제노푸스 라예비스 배아에서 ectopically 발현될 때, 그들은 분화하고, 갈라지고, 초기 가스트루라 단계로 늦은 블라술라에서 시작되는 blastocoele로 분비됩니다. 우리는 면역 blot 분석을 위한 blastocoele 캐비티에서 분열 제품을 심는 방법을 설명합니다.

제노푸스 라레비스 배아의 블라스코클로로 분비된 성장 인자 변형 분석 가족 분열 제품

배반포와 같은 세포를 효율적으로, 시기 적절하고, 순차적으로 생성하는 인간 블라스토이드의 형성을 요약하는 프로토콜.

인간 배반포 모델링 배반포 개발 및 이식을 위한 프로토콜

널리 사용되는 느린 동결 프로토콜에 대한 대안적인 냉동 보존 방법으로서 난소 조직의 유리화를 위한 프로토콜이 제시됩니다.

난소 피질 조직의 유리화(vitrification of the glassy state of aggation)

여기에서는 난자 채취 후 적운-난모세포 복합체의 일부를 신속하게 제거하여 IVF 관찰 과정을 촉진하고, 과립층 세포 제거에 필요한 시간을 단축하고, 외부 요소에 대한 난모세포 노출을 최소화하고, 배아 발달을 방해하지 않으며, 궁극적으로 IVF 실험실 절차의 효율성을 향상시키는 최적화된 방법을 제시합니다.

The Immediate Partial Removal of Cumulus-Oocyte Complexes: A Refined Approach for Rapid Observation of In Vitro Fertilization(적운-난모 세포 복합체의 즉각적인 부분 제거: 체외 수정의 신속한 관찰을 위한 정제된 접근 방식)

여기에서는 홈메이드 주걱으로 구성되고 홈메이드 솔루션을 활용하여 마우스와 양의 착상 전 배아를 유리화하기 위한 Spatula Montevideo 프로토콜을 제시합니다. 배아는 농도가 증가하는 두 개의 동결 보호 용액에서 빠르게 평형을 이루고, 주걱에 적재되고, 액체 질소에 담근 다음, 최종적으로 0.5mL 빨대로 밀봉됩니다.

포유류 배아의 유리화를 위한 주걱 몬테비데오 장치

학습하세요 체외수정 실험실에서 타임랩스 현미경을 활용한 블라스토시스트 비트리피케이션 및 해동 후 회복 과정의 형태학적 모니터링 방법을. 이 프로토콜은 배아 동결보존 기술의 효율성을 평가하는 데 필수적입니다.

Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

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