Name: 절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 생체 내에서 비오틴을 사용하여 마우스 사구체 세포 표면 단백질을 라벨링하는 방법을. 면역침전을 통해 여러 단백질을 동시에 분석하여 신장 질환에서 단백질 운반 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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저자는 그녀의 뛰어난 기술 지원 시 Duvnjak를 감사합니다. 이 작품 가운데 도이치 (www.dfg.de) WO1811/2-1 M.W. 및 QU280/3-1 지능에 의해 지원 되었다 Funder 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 게시, 결정 및 원고 준비에 전혀 역할을 했다.

마우스는 프랑스에서 1 월 실험실 또는 현지 동물 보호 시설에서 자체 품종으로 획득 했다. 조사 관리 및 실험 동물 사용 (미국 국립 연구소의 건강 게시 번호 85-23, 개정 1996)에 대 한 가이드에 설명 된 지침에 따라 실시 했다. 모든 동물 실험 관련 기관 승인에 따라 수행 했다 (주 정부 LANUV 참조 번호 AZ:84-02.04. 2016.A435)입니다.
1. 악기, 솔루션, 및 장비 준비
<ol><li>1mm 염화 마그네슘 (MgCl2)과 0.1 m m 칼슘 염화 물 (CaCl2) 보충 버퍼링 인산 염 분의 1 L를 준비 (PBSCM) 하 고 살 균 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>관류에 대 한 마우스 당 살 균 PBSCM의 5 mL을 준비 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>각 마우스에 대 한 살 균 PBSCM 0.5 mg/mL 비오 틴 보충의 5 mL을 준비 합니다.</li>
	<li>각 마우스에 대 한 살 균 PBSCM의 5 mL을 준비 하 고 108 자석 구슬 x 0.8을 추가 (예. 200, 전처리 없이 4 × 108 구슬/mL 해결책의 µ L)는 glomeruli의 색전술에 대 한. 원래 관 살 균 자석 구슬을 유지 하기 위해 셀 문화 벤치에서이 솔루션을 준비 합니다. 얼음에이 솔루션을 배치 합니다.</li>
	<li>PBSCM (5 mL 당 마우스)를 100 mM 글리신을 추가 하 여 냉각 솔루션을 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>콜라 솔루션 (0.378 U/mL 콜라 A 메 마른 PBSCM에) 확인 합니다. 마우스, 당 2 mL 튜브에 콜라 솔루션의 1 mL를 플라스틱 하 고 얼음에 그것을 놓습니다.</li>
	<li>세척, 살 균 PBSCM 준비 (단계 1.1 참조) 50 ml에서 튜브를 얼음에.</li>
	<li>관류, 2.0 mL/min의 흐름으로는 주사기 펌프를 사용 합니다.</li>
	<li>21g 바늘으로 10 mL 주사기를 준비 합니다. 20-30 센티미터 긴 카 테 테 르 바늘의 팁 장소 (내경, ID = 0.58 m m). 카 테 터 연결 (0.58 m m ID) 10cm 짧은 카 테 테 르와 (0.28 m m ID) 마우스 대동맥에 쉽게 삽입에 대 한 간접 작은 카 테 터의 끝을 잘라.</li>
	<li>수술 동안에 합자 절차, 잘라 마우스 당 3 5-7 cm 실크 스레드 (6-0 4-0).</li>
	<li>수술, 3 수술 클램프, 2 수술가 위, 핀셋 2, 2 고급 핀셋, 1 좋은 위, 및 면봉을 준비 합니다. 마 취 (예: 복 마 취 마 취 제 100 mg/kg bodyweight 및 xylazine 5 mg/kg 체중)을 준비 합니다.</li>
	<li>두 개의 신장 glomeruli의 격리, 100 µ m 셀 스 트레이너, 2 개의 50 ml 튜브, 그리고 자석 포 수를 사용 하 여.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼 챕 준비: 20 m m 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (챕); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 m m sodiumchorlide (NaCl); 50 m m sodiumfluoride (NaF); 15 m m 나4P2O7; 0.1 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; 그리고 2 m m adenosinetriphosphat (ATP)입니다.</li>
	<li>4 ° c.에 멋진 원심 분리기</li>
</ol>2입니다. 수술 현미경
<ol><li>Anesthetize는 마우스 (예를 들어, 케 타 민/xylazine와 intraperitoneally, 단계 참조 1.11). 발가락-핀치 테스트 확인 하는 적절 한 마 취를 수행.</li>
	<li>70% 소 프로 파 놀과 마우스의 복 부 측을 치료.</li>
	<li>흉 골을 골반에서 피부를 통해 중간 컷을 수행 하 고 핀셋을 사용 하 여 복 부 근 막에서 피부를 제거 합니다. 수술가 위로 복 부 중간 양쪽에는 피부를 잘라.</li>
	<li>수술 도구를 변경 합니다. 복 부 근육 층을 통해 방광에 칼에서 중간 컷을 적용 하 고 핀셋과 수술가 위를 사용 하 여 4 개의 사분면으로 나눕니다. 마우스의 목 쪽으로 2 개의 외과 클램프와 클램프 상단 두 옆으로 첨부 합니다. 참고: 복 지금 열립니다.</li>
	<li>따로 멸 균 면봉으로 내장 기관 넣고 잘가 위 키 모 인할지 인 대를 잘라.</li>
	<li>2 개의 정밀한 핀셋으로 부 신 샘의 높이에 신장 동맥의 근 위 대동맥 주위 (실크 스레드 4-0 6-0)와 함께 결 찰을 준비 합니다. 핀셋으로 혈액 흐름을 폐지 하 고 인접 대동맥 결 찰을 조입니다.</li>
	<li>근 막, 지방, 그리고 다른 조직에서 원심 대동맥 및 미세 수술 핀셋을 사용 하 여 신장 동맥의 두개골 키 모/mesenteric 동맥 주위 결 찰을 준비 합니다.</li>
	<li>결 찰 (실크 스레드 4-0 6-0)와 원심 대동맥 주위 신장 동맥의를 준비 하 고 분기의 높이에서 베 나 정 맥과 대동맥을 클램프.</li>
	<li>작은 구멍으로 잘라 대동맥 원심 신장 동맥에 구멍은 대동맥의 절반 직경. 대동맥으로 카 테 터를 넣고 준비 된 합자와 그것을 해결. 주의: 공기 색 전 증을 방지 하기 위해 관류 시스템에서 거품을 피하십시오.</li>
	<li>2 mL/min의 유량에 얼음 처럼 차가운 PBSCM로 재 관류를 시작 합니다.</li>
	<li>미세 수술가 위 신장 동맥의 수준에서 신장 혈관에 구멍을 삭감 하 고 간장 및 mesenteric 동맥 주위 결 찰 조입니다. 참고: 신장 한다 돌 창백한는 관류를 시작 후.</li>
</ol>3. Vivo에서 Biotinylation
<ol><li>변경 차가운 PBSCM를 거품 없는 주사기 0.5 mg/mL biotin 라벨, 표면에 대 한 보충 하 고 신장 2 mL/min의 유량에 5 mL와 함께 perfuse. 참고: 혼합 PBSCM 솔루션 (예를 들어, 50 mL 튜브 여) 솔루션 내에 거품 형성 방지를 부드럽게. 주사기 내 솔루션의 포부, 후 주사기에서 어떤 거품 또는 공기를 철수. 주사기에 여분의 정 (21 G)를 사용 하 여 정 맥 카 테 터 시스템에 연결 된에서 공간을 채우기 위해. 마지막으로, 거품 없이 카 테 터와 정 맥에 주사기를 스틱.</li>
	<li>거품 없는 주사기는 glomeruli 담금질 2 mL/min의 흐름에 5 mL와 함께 perfuse를 100 mM 글리신 보충 차가운 PBSCM 변경 합니다.</li>
	<li>변경 차가운 PBSCM를 거품 없는 주사기 200 μ 자석 구슬/mL으로 보충 하 고 신장 2 mL/min에서 perfuse. 참고: 신장 표면에 갈색 자석 구슬 glomeruli의 색전술 표시 됩니다.</li>
</ol>4입니다. 두 개의 신장에서 Glomeruli의 격리
<ol><li>신장은 hilum에서 제거 하 고 캡슐을 제거. 10 cm 세포 배양 접시에 PBSCM의 15 mL에 얼음에 신장을 놓습니다. 신장 수확 후 마 취에서 자 궁 경부 전위와 마우스 안락사 수술 및 관류 절차 마지막 약 20 ~ 22 분.</li>
	<li>신장으로 잘라 작은 조각 가능한 새로운 더블 가장자리 칼 날. 콜라 A의 1 mL 2 mL 튜브에 조직 이동 (단계 1.6 참조) 및 30 분 동안 37 ° C에서 다이제스트. 전후 소화, 피 펫 컷 1000 μ와 부드럽게 섞는다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBSCM를 사용 하 여 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 소화 조직 린스. 부드럽게 셀-스 크레이 퍼를 사용 하 여 나머지 조직 구 유 셀 스 트레이너를 말하다 고 차가운 PBSCM 50 mL의 총 볼륨에 나중에 그것을 씻어.</li>
	<li>5 분 제거는 상쾌한 고 resuspend vortexing 펠 릿 하면서 차가운 PBSCM의 약간 미만의 1.5 mL와 펠 릿 4 ° C 500 x g에서 현 탁 액을 원심. 나중에, 새로운 2 mL 튜브에 사 현 탁 액을 넣어.</li>
</ol>5입니다. 세척
<ol><li>자석 포 수를 사용 하 여 한쪽에는 glomeruli를 당겨. glomeruli 자석 쪽으로 이동 하기 전에 1 분을 기다립니다.</li>
	<li>2 mL 튜브 자석 포 수에 남아 있는 동안 1000 μ 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다. 첫 번째 및 두 번째 세척 중 단계 (단계 5.3 참조), 250 μ glomeruli의 손실을 방지 하기 위해 튜브 표면에 뜨는 남아의. 관 구조는 튜브의 바닥에 침 몰 시키는 피하기 위해 신속 하 게이 프로시저를 수행 합니다. 참고: 세척 절차 오래 지속 됩니다 그렇지 않으면.</li>
	<li>자석 포 수에서 2 mL 튜브를 제거 하 고 PBSCM, (매우 중요), 그 아래로 피 펫의 1 mL을 추가 소용돌이.</li>
	<li>자석 포 수 튜브를 다시 넣어 고 5.2 단계부터 다시 시작.</li>
	<li>세척 단계를 반복 하 여 glomeruli 순도 90%에 도달 했습니다. 이 위해, 현미경 (40-100 X) 상쾌한의 대표적인 약 수를 검사 합니다. 참고: Glomeruli 갈색 자석 구슬을 포함 하는 둥근 구조로 표시 됩니다. 길쭉한 구조는 관 조각, 그리고 무료 자석 구슬 갈색 둥근 점으로 표시. 셀 파편은 부피가 큰 구조로 나타날 수 있습니다.</li>
	<li>순수성에 도달 하면 glomeruli PBSCM의 1 mL에 용 해 하 여 glomeruli의 수를 견적 한다. 혼합 후, 10 μ의 약 수 고 현미경 glomeruli 계산. 다음 방정식으로 glomeruli의 수를 계산: glomeruli의 최종 번호 = 10 μ aliquot x 100에에서 glomeruli의 수.</li>
	<li>Glomeruli의 성공적인 절연 리드 10000-40000 glomeruli의 범위.</li>
</ol>6. 단백질 추출 및 Immunoprecipitation (IP)
<ol><li>6800 x g 5 분에서 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수집 glomeruli 자석 포 수를 사용 하는 동안은 상쾌한을 제거 하 고 얼음 세포의 용 해 버퍼에 펠 릿을 resuspend (예., 300 μ; 30000 glomeruli 챕, 단계 1.11 참조). 30에 대 한 최고 속도로 조직 균질 화기와 샘플을 균질 s와 30 분 동안 얼음에 그들을 lyse.</li>
	<li>15000 x g 30 분 4 ° c에서 원심 분리 하 여 불용 성 물질을 제거 새로운 1.5 mL 튜브에 lysate 셀을 포함 하는 상쾌한 플라스틱 펠 릿을 삭제 합니다.</li>
	<li>Bicinchoninic (BCA)를 사용 하 여는 상쾌한의 단백질 농도 측정-제조업체의 지침에 따라 방법을 기반으로. 30000 glomeruli의 성공적인 세포 사 단백질 양의 700-1000 µ g/mL를 생성합니다. 세포의 용 해 버퍼와 동일한 단백질 양을 조정 합니다.</li>
	<li>10%에 대 한 전체 볼륨의 약 수를 사가지고 lysate Laemmli + 5 분 동안 부 화 하기 전에 dithiothreithol (DTT) x 2 95 ° c.에 추가</li>
	<li>IP, 오버 헤드 통에 4 ° C에서 하룻밤 streptavidin agarose 구슬 lysate의 나머지를 품 어.</li>
	<li>Agarose 구슬 4 ° C에서 3 분 1000 x g에서 원심, 상쾌한, 제거 하 고 씻어 난다 단백질 바인딩 위한 구슬 세포의 용 해 버퍼의 800 μ를 추가.</li>
	<li>반복 세척 3 번 하 고는 상쾌한을 완전히 제거.</li>
	<li>2x Laemmli + DTT의 30 μ를 추가 하 고 5 분 동안 95 ° C에 품 어.</li>
	<li>Lysate를 로드 하 고 10 %SDS IP 프로브 젤 70 V 30 분, 다음 20에 SDS 젤을 실행 1.5 헤 대 한 젤 당 mA 나중에, 오 점 200에서 2 h 젤 니트로 멤브레인에 mA.</li>
	<li>버퍼를 세척에 니트로 막 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 4 ° C에서 하룻밤을 차단 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 하룻밤의 항 체를 막 품 어 세척 통에 5 분 동안 3 번 버퍼와 세척 하 고 실 온에서 1 h HRP 태그 이차 항 체를 막 품 어. 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>lysate 시각화 및 CCD 카메라와 슈퍼 해상도 chemiluminescent 에이전트를 사용 하 여 막에 조사 하는 immunoprecipitation 있습니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

제시 방법 glomeruli 조사 사 RNA 또는 단백질의 성공적인 격리 수 있습니다. 또한, 기본 사 셀 문화 격리 glomeruli에서 수행할 수 있습니다. Biotin 사 격리 하기 전에 적용 되는 경우 사 세포 표면 단백질의 라벨을 수행할 수 있습니다. 이 방법으로, vivo에서 사 세포 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다, 그리고 단백질 풍부의 반 정량 가능 합니다. 사 세포 표면 단백질 풍부를 성공적으로 테스트를 위한 가장 중요 한 단계 1는) 마우스 수술 대동맥의 특히 cannulation 수동 전문성 개발, 2) 거품 없는 주사기의 연결의 공기 색전술을 피하기 위하여는 glomeruli, 및 3) 차가운 조건에서 일 하는 관류 PBSCM 함께 시작 했다.
이 기술에 대 한 수동 전문 마우스 수술에 필수적 이다. 대동맥의 cannulation은 특히 중요 한 혈관의 해 부는 신장 관류를 방지할 것 이다. 대동맥에서 컷 충분히 커야 한다 (혈관 직경의 ...

Proteinuria 사 상해의 상징 이며 일반적으로 사 필터1의 장애를 동반 한다. 사 필터 fenestrated endothelium, 사 지하실 막, 및 podocytes 구성 됩니다. 사 필터의 섬세 한 분자 구조는 매우 역동적이 고 모두 건강 하 고 병에 걸린 신장2,3,,45,6에에서 거래 하는 세포 표면 단백질에 . 세포 표면 단백질 endocytosis podocytes7의 생존을 위해 필수적인 것으로 표시 되었습니다. Nephrin와 podocalyxin는 막 횡단 단백질 podocytes에 표현. Podocalyxin은 sialoglycoprotein podocytes8,,910의 보조 발 프로세스 코팅 Nephrin은 사 슬릿 격 막의 중추 이다. Endocytic 매매 이전 표시 되었습니다 nephrin와 podocalyxin3,11,12,,1314에 대 한.
우리의 지식의 베스트에 세포 표면 단백질 endocytosis 하지 아직 설명 하고있다 문학에서 사 내 피 세포에. 그러나, 내 피 세포는 일반적 endocytosis (즉, clathrin 종속, 뗏목 종속 endocytosis)15,16의 다른 종류에 대 한 모든 필요한 단백질을 표현 한다. 따라서, 내 피 세포 표면 매매 수로 공부 될이 메서드를 사용 하 여, 예를 들어 혈관 내 피 (VE)-cadherin 및 세포내 접착 분자 (ICAM-2) 셀으로 표면 사 내 피 세포17 마커 단백질 .
불행히도, 아니 정확 하 게 체 외에서 모델 필터에 대 한 섬세 한 3 계층화 사 어느 셀에 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다 이다. 이 방법의 목표는 이렇게 사 단백질 밀매 vivo에서공부 하. 또한,이 프로토콜 glomeruli, 추가 분석 사 RNA, 단백질, 세포의 활성화를 격리 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 유사한 사 격리 기법으로 다른 설명 되었습니다18,19그룹화 합니다.
이전에 우리와 다른 비보 전 사 세포 표면 단백질의 biotinylation2,,34,,2021에 의해 라벨 사용 했습니다. 그러나,이 비보 전 방법, 격리 glomeruli endocytic 인신 매매에 영향을 미칠 수 있습니다 기계적 스트레스에 노출 되었다. 또는, 사 세포 표면 단백질의 면역 형광 라벨은 광범위 하 게 사용 되었습니다 문학2,20,22에. 그러나이 방법으로 단백질 수가 적은 하나의 슬라이드 내에서 분석 될 수 있다, 그리고 면역 형광 이미지의 정량은 종종 어려운.
사 세포 표면 단백질 풍부 하 고 매매 정확 하 게에 건강 하 고 병에 걸린 신장, 공부를 신뢰할 수 있는 도구를 제공 하는이 소설은 vivo에서 방법 그리고 면역 형광 시험에 추가로 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>마우스 수술 용</td> <td>Motic SMZ168 BL</td><td>Motic</td><td>SMZ168BL</td> 현미경</tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>Pulch 및 Lorenz 현미경</td><td>150500</td><td>마우스 수술</td></tr><tr><td>용 광 Rompun (Xylazin) 2 %</td> <td>바이엘</td><td>PZN : 01320422</td><td>마취</td></tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun, Aesculap</td><td>FD100R</td><td>미세 가위, 대동맥</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td> 절단 용Braun, <td>복부 절단을 위한</td> <td>Aesculap</td><td>BC210R</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>Braun, 복</td><td>부가 열릴 때까지 수술을 위한</td>Aesculap <td>BD215R</td></tr><tr><td>Pr&auml; 수술용 parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner</td><td>IC108000</td><td>실크 스레드</td></tr><tr><td>케타민 10%</td><td>Medistar</td><td></td><td>마취</td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) 2%</td><td>Bayer</td><td></td><td>마취</td></tr><tr><td>파인 보어 폴리에틸렌 튜빙 ID 0.28mm OD 0.61mm</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>카테터</td></tr><tr><td>파인 보어 폴리에틸렌 튜빙 ID 0.58mm OD 0.96mm</td><td>Portex</td><td>800/100/200</td><td>카테터</td></tr><tr><td>Harvard Apparatus 11 Plus</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2209</td><td>주사기 펌프</td></tr><tr><td>EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>비오틴</td></tr><tr><td>Dynabeads 비접촉 마우스 T 세포</td> 사<td>구체 색전술을 위한</td><td>Invitrogen</td><td>11413D</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 A</td><td>Roche</td><td>10103578001신</td><td>장 조직</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123.21D</td><td>자석 포수</td></tr><tr><td>100&micro; </td><td>사구체 분리를 위한</td>m 세포 염색기 <td>Greiner-bio</td><td>542000</td></tr><tr>사<td>구체 순도를 확인할 수</td>없는<td>Axiovert 40 CFL</td><td>Zeiss</td> 사구체 순도를 확인할 <td>수 없음</td></tr><tr><td>TissueRuptor</td><td>Quiagen</td><td>9002755</td><td>조직 균질화기</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td>용해 완충액</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td> 용해 <td>완충액</td></tr><tr><td>용해 완충액용</td> <td>NaCl</td><td>VWR 화학 물질</td><td>27810295</td> 용해 완충액용</tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td>용해 완충액용</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>용해 완충액용</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td>용해 완충액용</td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>제조업체의 지침을 따르십시오.</td></tr><tr><td>nephrin 항체</td><td>Progen</td><td>GP-N2</td><td>for westernblot</td></tr><tr><td>Polyclonal goat anti-podocalyxin 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF15556-SP</td><td>for westernblot</td></tr><tr><td>Streptavidin Agarose Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>20347</td><td>면역침전</td></tr><tr><td>단백질 A 세파로스 CL-4B</td><td>GE 헬스케어</td><td>17096303</td><td>면역침전성</td></tr><tr><td>다클론 토끼 anti-p57 항체</td><td>SCBT</td><td>sc-8298</td><td>면역조직화학용</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항베타 액틴 항체, 클론 AC-74</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td>웨스턴 블롯 로딩 제어</td></tr><tr><td>토끼 안티-p44/42</td><td>세포 신호</td><td>4695</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>피어스 고감도 스트렙타비딘-HRP</td><td>웨스턴</td><td></td> 블<td>롯</td></tr><tr><td>폴리클론 마우스 ICAM-2 항체</td><td>R& 웨스턴</td><td></td><td>블롯</td></tr><tr><td>다클론 마우스 안티 VE-cadherin</td><td>R & 웨스턴</td><td>블롯용</td> D Systems <td>AF1002</td></tr></tbody></table>

절연 glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria fenestrated endothelium, 사 지하실 막 그리고 podocytes 그들의 슬릿 격 막으로 구성 된 사 필터의 붕괴에서 유래한 다. 사 필터, 특히 슬릿 격 막의 섬세 한 구조는 다양 한 세포 표면 단백질의 상호 작용에 의존합니다. 공부 하는이 세포 표면 단백질은 생체 외에서 연구 또는 조직학 분석을 제한 되었습니다 지금까지. 여기, 우리 murine vivo에서 biotinylation 라벨 생리 및 pathophysiologic 조건 사 세포 표면 단백질의 연구를 수 있는 방법 제시. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 사 셀 표면 풍부의 반 정량이 새로운 방법, 그리고 모든 단백질 biotin 관류에 액세스할 수와 함께 쉽게 사용할 수 이며 immunoprecipitation 공부 될 수 있다. 또한, 격리 또는 biotinylation 없이 glomeruli의 기본 사 세포 배양 (즉, 기본 podocyte 세포 배양) 뿐만 아니라 사 RNA와 단백질의 분석을 추가 있습니다.

격리 glomeruli 정확 하 게, 먼저 murine 신장 PBSCM와 perfuse 필요가 있다. PBSCM와 관류 신장 창백 (그림 1A) 나타났다. 마그네틱 구슬 glomeruli의 색전술 신장 표면 (그림 1B)에 갈색 점 들으로 표시 됩니다. 자석 포 수와 glomeruli의 절연 오염 신장 tubuli (그림 1C)으로 표시할 수 있습니다. 추가 분석 glomeruli, 전에 glomeruli의 &gt; 95% 순도 glomeruli를 더 철저 하 게 세척 하 여 달성 될 필요가 (그림 1D).
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여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

이 방법은 단백뇨신장질환이 아닌 단백뇨에서 세포 표면 단백질 인신 매매의 역할에 대한 신장학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 세포 표면 단백질 인신 매매의 연구를 용이하게하고 실험 당 하나 이상의 단백질을 분석 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 구체 세포 표면 인신 매매에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 또한 perfused 및 격리 기술에 의해 액세스 할 수있는 다른 기관 시스템에 적용 할 수 있습니다.발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고 70 %의 이소 프로필로 마취 마우스의 복부 측면을 소독하는 것으로 시작합니다. 골반에서 흉골까지 피부를 잘라내고 핀셋을 사용하여 복부 근막에서 피부를 제거합니다. 복부 중진선의 양쪽에 피부를 잘라 시포이드에 방광에서 복부 근육 층을 통해 매체를 확인합니다.가위와 집게를 사용하여 근육을 네 개의 사분면으로 나누고 두 개의 수술 클램프를 사용하여 동물의 목쪽으로 상부 2 사분면을 고정하십시오. 동물을 해부 현미경 아래에 놓고 멸균 스왑을 사용하여 내장 기관을 옆으로 이동하십시오. 미세 가위를 사용하여 간 phrenic 인대를 잘라.정밀한 외과 핀셋을 사용하여, 신장 동맥의 간 막질 동맥 branial 의 주위에 1 봉합사를 놓습니다. 그리고 대동맥 주위, 신장 동맥에 근위, 부신에서. 근막, 지방 및 기타 조직에서 말단 대어타를 해방하십시오.그런 다음 정맥 카바와 대동맥을 양분의 높이에 고정시키고 신장 동맥의 대동맥 탈구 주위에 또 다른 봉합사를 놓습니다. 핀셋을 사용하여 근접 대동맥 봉합사를 조이고 혈류를 감쇠시키고 대동맥의 직경의 작은 구멍을 대동맥으로 자르고 신장 동맥에 단념하십시오. 얼음 차가운 PBS 5밀리리터와 칼슘과 마그네슘을 10 밀리리터 주사기에 부착한 10센티미터 카테터를 대어타에 삽입합니다.그리고 준비 된 합자카테를 수정합니다. 그런 다음 분당 2 밀리리터의 신장을 퍼프하기 시작합니다. 신장 동맥의 신장 정맥으로 구멍을 자르고 간 및 막진 동맥 주위의 봉합사를 조이기 위해 미세 한 가위를 사용하십시오.PBS의 전체 부피가 전달된 후 퍼퓸을 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS와 칼슘및 마그네슘으로 대체하여 표면 라벨링을 위해 밀리리터 비오틴당 0.5 밀리그램을 보충합니다. 분당 유량 2밀리리터로 신장을 계속 인내하십시오. 전체 부피가 전달되면 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS와 칼슘, 마그네슘이 들어 있는 주사기를 카테터에 100밀리머 글리신으로 보충합니다.글리신 용액 5밀리리터를 분당 2밀리리터로 담금질합니다. 그런 다음 신장에 얼음 차가운 PBS 5 밀리리터와 칼슘및 마그네슘을 분당 2밀리리터의 유량으로 밀리리터당 200 마이크로리터의 마그네틱 비드로 보충합니다. 갈색 자기 구슬을 가진 구체의 색전은 신장 표면에 보일 것입니다.모든 구슬이 전달되었을 때 신장캡슐을 제거하고 힐룸에서 신장을 수확하십시오. 신장을 PBS 15 밀리리터와 칼슘및 마그네슘이 함유한 10센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다. 새로운 양날 블레이드를 사용하여 신장을 가능한 가장 작은 조각으로 자른다.콜라게나아제 A 1밀리리터를 30분간 30분간 함유한 2밀리리터 튜브로 조직을 옮기고, 소화 전후에 1000 마이크로리터 파이펫 팁으로 조직 용액을 부드럽게 혼합한다. 인큐베이션의 끝에서, 100 미크론 세포 여과기를 통해 소화 된 조직을 필터링. 세포 스크레이퍼와 얼음 차가운 PBS플러스 칼슘과 마그네슘을 사용하여 남은 조직을 세포 스트레이너를 통해 으깬다.신장 단일 세포 현탁액의 최종 볼륨을 신선한 얼음 차가운 PBS플러스 칼슘과 마그네슘으로 최대 50 밀리리터까지 가져와 원심분리로 신장 세포를 수집합니다. 상체를 제거한 다음 1.5 밀리리터 미만의 얼음 차가운 PBS와 칼슘및 마그네슘을 함유하고 구체 현탁액을 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기십시오. 사구를 씻으려면 튜브를 자석에 넣고 사구를 집계합니다.1분 후 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 상체를 제거합니다. 그리고 자석에서 튜브를 제거합니다. PBS 1 밀리리터와 칼슘과 마그네슘을 조직에 추가합니다.구체를 한 번 위아래로 피펫하고 세포를 소용돌이시다. 튜브를 자석에 반품하고 방금 시연한 대로 다시 사구를 씻습니다. 40- 100 X 배율에서 광 현미경 분석에 의해 샘플 순도가 적어도 90%에 도달할 때까지.그런 다음 원심분리에 의해 자기 비드 정제 된 구체 구체를 수집합니다. 95% 이상의 순도를 달성하기 위해, 글로메룰리는 입증된 대로 철저히 세척해야 했습니다. 비오틴 관류는 비오틴에서 모세관 루프의 라벨링을 용이하게 하지만, 조절된 마우스 신장은 아닙니다.구체 추출물의 비오틴 분획의 면역 침전은 사구형 막 단백질 네프린과 포도잘록신이 바이오틴으로 면역 침전되지만 대조군 분획이 아니라는 것을 보여준다. 연쇄상 바비딘을 사용한 면역 절전 분획의 염색은 바이오틴에 있는 비오틴 래드 네프린의 존재를 더욱 확인하지만, 관대한 동물을 통제하지는 않는다. 내피 단백질 혈관 내피 카헤린 및 세포 내 접착 분자 2도 비오틴 분획 내에서 면역 침전된다.신증후군의 초기 단계에서 세포 표면 네프린의 감소된 발현은 대조군에 비해 신염 성 신염 동물에서 관찰된다. 실제로 수온 분석은 컨트롤러에 비해 신증후군 동물에서 비오틴 래드 네프린의 현저한 감소를 나타낸다. 전체 nephrin 대 액틴 비의 정량적 분석은 대조군과 신증후군 마우스 사이에 유의한 차이를 보이지 않는다.또한, 신장독성 신염 및 대조동물에서 동일한 양의 포도세포가 관찰된다. 늦은 신증후군에서, 신증후군 동물은 대조군과 신증후군 마우스 사이에서 측정된 세포 표면 신프린과 신증후군 동물의 전반적인 총 신프린 감소에 큰 차이가 없는 신증후군 발현의 회복을 나타낸다. 또한, 포도세포 수는 대조동물에 비해 감소된다.이 절차를 시도하는 동안, 구성구의 공기 색전증을 피하기 위해 자신의 연결 중에 주사기 거품을 무료로 유지하고 신장 관류가 시작되면 얼음 차가운 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 사구체 RNA와 단백질의 분리와 같은 다른 방법은 건강하고 병든 신장에서 단백질 발현 또는 상호 작용에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수있다.

isolation-glomeruli-vivo-labeling-glomerular-cell-surface

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 쥐의 신장에서 온전한 사구체를 분리하는 방법을 설명합니다. 이렇게 얻어진 캡슐화 및 캡슐화되지 않은 사구체는 쥐 신장에서 두정엽 상피 세포 파생물을 배양하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

사구체 분리: 쥐 신장에서 온전한 사구체를 얻는 기술

이 비디오는 쥐 장의 점막하 및 판막에서 장 신경교세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 점막하 및 얇은 판 propria 조직을 추출하고, 장 신경교세포를 분리하고, 코팅된 웰 플레이트에서 세포를 배양하여 장 신경교세포 배양을 확립하는 단계를 간략하게 설명합니다.

쥐의 점막하부(submucosa and lamina propria)에서 장 신경교세포(enteric glial cells)를 분리(isorating enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of a mouse)

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

postembedding immunogold 방법은 특정 분자의 세포 내 국소화에 대한 고해상도 분석을 제공하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다. 여기에서는 망막 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체를 정량적으로 분석하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

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그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

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배우세요 생체 내에서 비오틴을 사용하여 마우스 사구체 세포 표면 단백질을 라벨링하는 방법을. 면역침전을 통해 여러 단백질을 동시에 분석하여 신장 질환에서 단백질 운반 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

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