절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨
January 18th, 2019
여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.
이 방법은 단백뇨신장질환이 아닌 단백뇨에서 세포 표면 단백질 인신 매매의 역할에 대한 신장학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 세포 표면 단백질 인신 매매의 연구를 용이하게하고 실험 당 하나 이상의 단백질을 분석 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 구체 세포 표면 인신 매매에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 또한 perfused 및 격리 기술에 의해 액세스 할 수있는 다른 기관 시스템에 적용 할 수 있습니다.
발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고 70 %의 이소 프로필로 마취 마우스의 복부 측면을 소독하는 것으로 시작합니다. 골반에서 흉골까지 피부를 잘라내고 핀셋을 사용하여 복부 근막에서 피부를 제거합니다. 복부 중진선의 양쪽에 피부를 잘라 시포이드에 방광에서 복부 근육 층을 통해 매체를 확인합니다.
가위와 집게를 사용하여 근육을 네 개의 사분면으로 나누고 두 개의 수술 클램프를 사용하여 동물의 목쪽으로 상부 2 사분면을 고정하십시오. 동물을 해부 현미경 아래에 놓고 멸균 스왑을 사용하여 내장 기관을 옆으로 이동하십시오. 미세 가위를 사용하여 간 phrenic 인대를 잘라.
정밀한 외과 핀셋을 사용하여, 신장 동맥의 간 막질 동맥 branial 의 주위에 1 봉합사를 놓습니다. 그리고 대동맥 주위, 신장 동맥에 근위, 부신에서. 근막, 지방 및 기타 조직에서 말단 대어타를 해방하십시오.
그런 다음 정맥 카바와 대동맥을 양분의 높이에 고정시키고 신장 동맥의 대동맥 탈구 주위에 또 다른 봉합사를 놓습니다. 핀셋을 사용하여 근접 대동맥 봉합사를 조이고 혈류를 감쇠시키고 대동맥의 직경의 작은 구멍을 대동맥으로 자르고 신장 동맥에 단념하십시오. 얼음 차가운 PBS 5밀리리터와 칼슘과 마그네슘을 10 밀리리터 주사기에 부착한 10센티미터 카테터를 대어타에 삽입합니다.
그리고 준비 된 합자카테를 수정합니다. 그런 다음 분당 2 밀리리터의 신장을 퍼프하기 시작합니다. 신장 동맥의 신장 정맥으로 구멍을 자르고 간 및 막진 동맥 주위의 봉합사를 조이기 위해 미세 한 가위를 사용하십시오.
PBS의 전체 부피가 전달된 후 퍼퓸을 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS와 칼슘및 마그네슘으로 대체하여 표면 라벨링을 위해 밀리리터 비오틴당 0.5 밀리그램을 보충합니다. 분당 유량 2밀리리터로 신장을 계속 인내하십시오. 전체 부피가 전달되면 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS와 칼슘, 마그네슘이 들어 있는 주사기를 카테터에 100밀리머 글리신으로 보충합니다.
글리신 용액 5밀리리터를 분당 2밀리리터로 담금질합니다. 그런 다음 신장에 얼음 차가운 PBS 5 밀리리터와 칼슘및 마그네슘을 분당 2밀리리터의 유량으로 밀리리터당 200 마이크로리터의 마그네틱 비드로 보충합니다. 갈색 자기 구슬을 가진 구체의 색전은 신장 표면에 보일 것입니다.
모든 구슬이 전달되었을 때 신장캡슐을 제거하고 힐룸에서 신장을 수확하십시오. 신장을 PBS 15 밀리리터와 칼슘및 마그네슘이 함유한 10센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다. 새로운 양날 블레이드를 사용하여 신장을 가능한 가장 작은 조각으로 자른다.
콜라게나아제 A 1밀리리터를 30분간 30분간 함유한 2밀리리터 튜브로 조직을 옮기고, 소화 전후에 1000 마이크로리터 파이펫 팁으로 조직 용액을 부드럽게 혼합한다. 인큐베이션의 끝에서, 100 미크론 세포 여과기를 통해 소화 된 조직을 필터링. 세포 스크레이퍼와 얼음 차가운 PBS플러스 칼슘과 마그네슘을 사용하여 남은 조직을 세포 스트레이너를 통해 으깬다.
신장 단일 세포 현탁액의 최종 볼륨을 신선한 얼음 차가운 PBS플러스 칼슘과 마그네슘으로 최대 50 밀리리터까지 가져와 원심분리로 신장 세포를 수집합니다. 상체를 제거한 다음 1.5 밀리리터 미만의 얼음 차가운 PBS와 칼슘및 마그네슘을 함유하고 구체 현탁액을 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기십시오. 사구를 씻으려면 튜브를 자석에 넣고 사구를 집계합니다.
1분 후 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 상체를 제거합니다. 그리고 자석에서 튜브를 제거합니다. PBS 1 밀리리터와 칼슘과 마그네슘을 조직에 추가합니다.
구체를 한 번 위아래로 피펫하고 세포를 소용돌이시다. 튜브를 자석에 반품하고 방금 시연한 대로 다시 사구를 씻습니다. 40- 100 X 배율에서 광 현미경 분석에 의해 샘플 순도가 적어도 90%에 도달할 때까지.
그런 다음 원심분리에 의해 자기 비드 정제 된 구체 구체를 수집합니다. 95% 이상의 순도를 달성하기 위해, 글로메룰리는 입증된 대로 철저히 세척해야 했습니다. 비오틴 관류는 비오틴에서 모세관 루프의 라벨링을 용이하게 하지만, 조절된 마우스 신장은 아닙니다.
구체 추출물의 비오틴 분획의 면역 침전은 사구형 막 단백질 네프린과 포도잘록신이 바이오틴으로 면역 침전되지만 대조군 분획이 아니라는 것을 보여준다. 연쇄상 바비딘을 사용한 면역 절전 분획의 염색은 바이오틴에 있는 비오틴 래드 네프린의 존재를 더욱 확인하지만, 관대한 동물을 통제하지는 않는다. 내피 단백질 혈관 내피 카헤린 및 세포 내 접착 분자 2도 비오틴 분획 내에서 면역 침전된다.
신증후군의 초기 단계에서 세포 표면 네프린의 감소된 발현은 대조군에 비해 신염 성 신염 동물에서 관찰된다. 실제로 수온 분석은 컨트롤러에 비해 신증후군 동물에서 비오틴 래드 네프린의 현저한 감소를 나타낸다. 전체 nephrin 대 액틴 비의 정량적 분석은 대조군과 신증후군 마우스 사이에 유의한 차이를 보이지 않는다.
또한, 신장독성 신염 및 대조동물에서 동일한 양의 포도세포가 관찰된다. 늦은 신증후군에서, 신증후군 동물은 대조군과 신증후군 마우스 사이에서 측정된 세포 표면 신프린과 신증후군 동물의 전반적인 총 신프린 감소에 큰 차이가 없는 신증후군 발현의 회복을 나타낸다. 또한, 포도세포 수는 대조동물에 비해 감소된다.
이 절차를 시도하는 동안, 구성구의 공기 색전증을 피하기 위해 자신의 연결 중에 주사기 거품을 무료로 유지하고 신장 관류가 시작되면 얼음 차가운 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 사구체 RNA와 단백질의 분리와 같은 다른 방법은 건강하고 병든 신장에서 단백질 발현 또는 상호 작용에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수있다.
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개요
이 기사는 생쥐에서 바이오틴을 사용하여 근세포 세포 표면 단백질의 생체 내 표지를 위한 프로토콜을 제시합니다. 생쥐 신장의 관류, 근세포의 분리, 면역침전을 수행하는 단계를 상세히 설명합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신장학
- 세포 생물학
- 단백질 운반
배경
- 세포 표면 단백질 운반의 이해는 신장 질환 연구에서 중요합니다.
- 이 방법은 다양한 기관 시스템에 적용할 수 있습니다.
- 단일 실험에서 여러 단백질의 분석이 가능합니다.
- 생체 내 연구는 체외 방법으로는 불가능한 통찰력을 제공합니다.
연구 목적
- 신장 질환에서 세포 표면 단백질 운반의 역할을 조사하는 것입니다.
- 근세포 단백질 연구를 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발하는 것입니다.
- 단백뇨 및 비단백뇨성 신장 질환에 대한 이해를 향상시키는 것입니다.
사용된 방법
- 바이오틴을 사용한 생쥐 신장의 관류.
- 신장에서 근세포의 분리.
- 표적 단백질의 내인성 면역침전.
- 마우스의 마취 및 수술 준비의 확인.
주요 결과
- 이 프로토콜은 근세포 세포 표면 단백질을 성공적으로 표지합니다.
- 여러 단백질을 동시에 분석할 수 있습니다.
- 단백질 운반 메커니즘에 대한 통찰력을 얻었습니다.
- 이 방법은 다른 기관 시스템에 사용하도록 적응할 수 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 신장학 연구를 위한 귀중한 도구입니다.
- 생체 내 단백질 운반을 연구하기 위한 프레임워크를 제공합니다.
- 향후 연구에서는 다른 질병에 대한 응용을 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Studying glomerular cell surface protein trafficking in vivo provides mechanistic insights into kidney disease pathogenesis, supporting target validation in nephrology. This method enables semi-quantitative analysis of surface protein abundance under physiologic and pathophysiologic conditions, enhancing predictive confidence in preclinical models. It facilitates biomarker discovery and pathway clarification relevant to proteinuric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking cell surface protein dynamics in intact glomeruli.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of nephrin and podocalyxin trafficking in disease models.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts for assessing target engagement and pathway modulation in vivo.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified glomerular fractions suitable for downstream immunoprecipitation and protein interaction analysis.
- Reproducibility: Standardized perfusion and magnetic bead isolation yield consistent glomerular preparations across experiments.
- Multiplex Capability: Allows simultaneous analysis of multiple surface proteins per experiment, increasing screening efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Captures dynamic changes in nephrin expression during early and late phases of nephrotoxic nephritis.
- Translational Continuity: Links in vivo protein trafficking observations to podocyte loss and disease progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein changes reflect surface trafficking versus total expression shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing functional, in vivo data on glomerular protein behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein trafficking mechanisms in kidney disease models.
- Screening: Delivers quantitative, biotin-dependent immunoprecipitation outputs for comparing protein surface exposure.
- Analytics: Enables semi-quantitation of glomerular cell surface abundance via streptavidin-based detection.
- Translational Research: Connects surface protein dynamics to histologic and functional outcomes in nephritis models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other perfused organ systems, supporting cross-indication target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing surface trafficking from total protein expression changes.
- Operational Value: Standardized perfusion and isolation workflows improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing target accessibility and modulation in physiologic contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo surface protein behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, vascular perfusion, and tissue dissection under sterile conditions.
- Dependent on perfusion equipment, magnetic separation tools, and immunoprecipitation reagents.
- Necessitates standardization of biotin perfusion timing, flow rate, and quenching steps for consistent labeling.
- Adaptation to other organ systems requires validation of accessibility and perfusion efficiency.
- Practical limitations include tissue fragility during digestion and the need for high-purity glomerular isolation (>95%) for reliable downstream analysis.
