Name: 식물 성장 및 Extremophyte Schrenkiella parvula 의 꽃-딥 변환 Agrobacterium 중재 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 배우세요 극한 환경 적응 식물 Schrenkiella parvula의 안정적 형질전환을 위한 꽃-딥 방법을 활용한 Agrobacterium 중재 유전자 도입 기술입니다. 이 프로토콜은 다중 이온 염 스트레스 적응 연구와 Arabidopsis thaliana 비교 기능 유전체학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 수상 MCB 1616827에 의해 지원 되었다.

1. 식물 성장
<ol><li>
종자 살 균 (선택 사항)
	<ol>
<li>이중 증 류 물 (ddH2O) 1 표 백제 50% 준비 또는 비 이온 세제의 2 상품 ( 재료의 표참조) 50 mL 튜브에. 여러 번 솔루션을 혼합 튜브를 반전. 참고: 그것은 층 류 캐비닛 15 분 동안 UV 살 균된 표면 살 균 씨를 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>~ 100-200 표 백제 솔루션 추가 1.5 mL 튜브에 S. parvula 씨. 철저 하 게 혼합 하 고 튜브를 5 분 동안 앉아 보자.</li>
		<li>튜브에서 표 백제를 제거 하 고 70% 에탄올을 추가. 여러 번 pipetting으로 씨앗을 세척 하 고 에탄올 솔루션을 즉시 제거.</li>
		<li>초과 표 백제 및 에탄올, 제거 하는 소독된 물에 씨앗을 씻어 다음 물을 제거 합니다. 5 ~ 6 배가이 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
씨앗 층 리
	<ol>
<li>소독된 물에 씨앗을 담가 그리고 4 ° c.에 5 ~ 7 일 동안 저장 또는, 젖은 토양에 직접 말린된 unsterilized 씨앗을 뿌리 다 하 고 토양 트레이 4 ° c.에 5 ~ 7 일에 대 한 장소</li>
	</ol>
</li>
	<li>
변화의 준비에서 성장 하는 식물
	<ol>
<li>작성 토양 7 x 6 cm2 냄비에 ( 재료의 표참조)를 혼합, 냄비, 물에 담가 고 균일 하 게 젖은 성장 매체를 되도록 위에서 물 스프레이. 각 포트의 토양 표면에 5-비료 구슬 ( 재료의 표참조)를 추가 합니다. 참고: 마찬가지로 지금까지 우리가 경험한 S. parvula A. thaliana 성장할 수 있는 토양 혼합에서 잘 자 랍니다.</li>
		<li>젖은 이쑤시개를 사용 하 여 전송 20 ~ 25 씨앗 토양 표면에 당. 참고: 편리한 방법은 네 모퉁이 냄비 (그림 1, 하루 15, 왼쪽된 패널)의 센터에 4-5 씨앗의 배치를 넣어 것입니다.</li>
		<li>발 아 중 높은 습도에서 씨앗을 계속 분명 돔 냄비 트레이 커버.</li>
		<li>공장 트레이 성장 챔버에 130 µmol m−2 s− 1 , 22-24 ° C 온도, 조명과 밤 사이클 당 하루/10 h 당 14 h에서 빛의 강도 유지. 7-10 일 발 아 후 돔을 제거 합니다. 바람직한 수준에 균일 하 게 습 토양을 유지 하는 쟁반의 바닥에서 물을 추가 합니다.</li>
		<li>여분의 묘 밖으로 대마초와 냄비 (그림 1, 하루 15, 오른쪽 패널) 서로 잘 분리 당 유일한 4-5 건강 한 묘를 두고.</li>
		<li>부드럽게 물 식물 2 일 마다 하 고 교류가 솔루션16 x 0.2와 거 름을 한 번 매 2 주. 참고: 균일 한 수준에 토양 수 분을 유지 하는 것은 키 성장과 S. parvula 일관 되 게 건강 하.</li>
		<li>여러 inflorescences 생산 공장 (그림 1, 하루 60-80) 당 100-150 꽃 봉 오리 때까지 8-10 주 동안 식물 성장을 계속 합니다. 당일 꽃 딥 기반된 변환 (4.5 단계)에 대 한 계획, 식물에서 모두 성숙 하 고 발전 siliques를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 공장 변환에 대 한 벡터에 관심사의 유전자 또는 Genomic 요소 복제
<ol><li>중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)17 분리 젤 추출을 사용 하 여 PCR 제품 키트 ( 재료의 표참조)을 사용 하 여 대상 DNA 파편을 증폭 키트 프로토콜 또는 정화 DNA agarose 젤을 사용 하 여 다른 적절 한 방법을 전기 이동 법17,18. 생어 시퀀싱19통해 격리 된 PCR 제품의 시퀀스를 확인 합니다.</li>
	<li>복제의 복제 유능한 대장균 에 복제 구성 세포 topoisomerase 기반 복제를 사용 하 여 변환 벡터에 원하는 PCR 제품 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침에 따라.</li>
	<li>적절 한 항생제, Luria Bertani20 (파운드) 한 천 세균성 성장 미디어 (표 1)에 변형 된 제품의 50 µ L를 확산 예., 50 µ g / mL Spectinomycin ( 재료의 표참조), 그리고 37 °에서 품 어 C 하룻밤입니다.</li>
	<li>다음 날 5 – 10 단일 식민지를 선택, 적절 한 항생제로 액체 LB 매체에 접종 하 고 부드러운 하룻밤 37 ° C에서 흔들어와 품 어.</li>
	<li>격리 플라스 미드 플라스 미드 격리를 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조)를 생어 시퀀싱19 통해 2.1 증폭 대상 시퀀스 제대로 복제 여부를 확인 합니다.</li>
	<li>복제 및 확인 된 PCR 제품을 전송 공장 변환 ( 재료의 표참조) 복제 재결합 기반 호환에 대 한 대상 벡터 ( 재료의 표참조), 다음 키트 recombinase 효소 혼합을 사용 하 여 장비 제조 업체의 지시입니다. 2.3 단계에서 단계로 2.5 분리 하 고 적절 한 플라스 미드 구조를 은닉 하는 클론을 확인을 반복 합니다.</li>
</ol>3. 변환 벡터 생성 식물의 변화를 위한 Agrobacterium tumefaciens
<ol><li>A. tumefaciens 스트레인 GV3101:pMP90RK21, 리 팜 피신 저항 유전자 염색체 배경 선택에 대 한 항구는 2.6에서 벡터 구성의 플라스 미드를 변환 합니다. 예를 들어 Gentamycin 또는 대 적절 한 항생제를 사용 하 여 ( 재료의 표참조), 식물의 선택에 대 한 변환 구성 (Ti 플라스 미드). A. tumefaciens electroporation 통해 변환에 대 한 간단한 프로토콜 섹션 3.2에에서 포함 됩니다.</li>
	<li>
A. tumefaciens 변환 electroporation에 의해
	<ol>
<li>A. tumefaciens 유능한 세포22 얼음에 녹여 2.6에서 준비 하는 플라스 미드의 믹스 0.1-1 µ g ddH2O, 얼음에 유능한 세포와의 1-2 µ L에 녹아. Electroporation 베트로 혼합물을 전송 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>플라스 미드와는 electroporator를 사용 하 여, 3.2.1에서 유능한 세포의 혼합물에 electroporation 수행 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침에 따라. 참고: electroporation 시작 하기 전에 멧의 표면 청소.</li>
		<li>액체 LB의 1.5 mL를 포함 하는 microcentrifuge 튜브에는 베트에서 반응 혼합물을 전송 pipetting으로 잘 혼합 하 고 부드러운 떨고와 28 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3.2 파운드 접시 포함 하는 적절 한 선택 항생제에 섹션에서 변환 된 A. tumefaciens 를 접종 (예: 대 25 µ g / mL, Spectinomycin 50 µ g / mL, Gentamycin 25 µ g / mL, 그리고 리 팜 피신 50 µ g / mL)와 28 ° C에서 3 일 동안 품 어.</li>
</ol>4. S. parvula 의 변화 Agrobacterium 중재
<ol><li>단일 변형 예방 살 균 50 mL 원뿔에 항생제 (3.3와 동일)를 포함 된 파운드 액체 미디어 10 mL에 격판덮개에서 식민지 튜브 ( 재료의 표참조). 떨고 인큐베이터에서 24 h에 대 한 품 어 ( 재료의 표참조)에서 250 r.p.m.에서 28 ° c.</li>
	<li>메 마른 250 mL 플라스 크에 세균성 솔루션 3.4.1에서 전송, 적절 한 항생제로 파운드 액체 미디어의 40 mL를 추가 하 고 600 nm 파장 (OD600)에서 광학 밀도 약 2.0에 도달할 때까지 12 h를 품 어.</li>
	<li>원심 10 분 제거에 대 한 A. tumefaciens cultureat 3100 x g 는 상쾌한 고 다시 A. tumefaciens 침투 솔루션 (표 1) 40 mL에 세균성 문화를 일시 중단.</li>
	<li>최종 세600 0.8의 침투 솔루션 resuspended A. tumefaciens 를 희석. 계면 활성 제 솔루션 (표 1)의 25 µ L 희석된 A. tumefaciens 50 mL에 추가 솔루션 및 여러 번 반전에 의해 혼합.</li>
	<li>A. tumefaciens 솔루션 6 화분에서 꽃이 핌을 찍기 후 20 s. 사용 신선한 세균 솔루션에 대 한 섹션 4.4에에서 준비에 있는 식물의 꽃이 핌을 찍어. 모든 꽃은 솔루션 접촉 다는 것을 확인 하십시오. 피펫으로 솔루션으로 감소 될 수 없는 경우는 화 서의 아래 부분에 있는 꽃에 직접 세균 솔루션. 참고: 1 라운드 변환에 대 한 날카로운 메스 또는 작은 위를 사용 하 여 모든 성숙 하 고 발전 siliques를 제거 해야 합니다. 두 번째 시간에 대 한 변환을 수행 하는 경우에 siliques을 제거 하지 마십시오.</li>
</ol>5. 후 변환 공장 관리와 두 번째 변환
<ol><li>1-2 일에 대 한 어두운 성장 방에 식물을 커버 하는 돔 가진 깨끗 한 쟁반에 담근 꽃 식물을 가로로 놓습니다. 참고: 높은 습도 아래 꽃을 유지 하는 것은 (그림 1, 변환 후에 식물)이이 단계에서 중요 하다입니다.</li>
	<li>수직 위치에 식물을 반환 하 고/10 일 밤 주기, 130 µmol m-2 s-1 빛의 강도 및 온도 22 ~ 24 ° C h 당 14 h로 성장 방에 식물을 전송.</li>
	<li>다음 주에 담근된 inflorescences를 모니터링 합니다. 꽃의 상당수는 (그림 2)를 중단, 또는 꽃의 많은 수는 새로 개발 된 후 약 4 주 후 꽃 딥 (4 단계)를 반복 합니다. 참고: 첫 번째 변환 (단계 1.3.7)에 대 한 준비 단계와 달리 제거 하지 마십시오 siliques (그림 2)를 개발 하거나 기존 변환의 두 번째 라운드 전에.</li>
	<li>씨 성숙 하 고 ~ 21 주에 씨앗을 수확 때까지 식물을 성장.</li>
	<li>실내 온도 밀폐 용기에 2-3 주 동안 건조 씨 방 ( 재료의 표참조)으로 가득 합니다.</li>
</ol>6입니다. 긍정적인 Transformants의 선택
<ol><li>야생 타입 씨앗 1.2 1.3 단계에서 설명한 대로 T1 씨앗 공장.</li>
	<li>처음 2 진정한 잎 개발, 발 아 후 약 10-14 일 때까지 식물을 성장.</li>
	<li>
제 초 제 저항 (그림 3A와 3B)으로 아래에 대 한 첫 번째 선택 항목을 수행 합니다.
	<ol>
<li>Glufosinate 염화 (11.3%) 제 초 제 (또는 바스) 희석 (표 1) 1:1,000 (v/v)을. 묘에 희석된 바스 솔루션 스프레이 하 고 하룻밤 돔 가진 식물을 커버.</li>
		<li>반복 2-3 회 분사 라고 매 5-7 일.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
아래로 바스 드롭 테스트를 사용 하 여 두 번째 선택을 수행 합니다.
	<ol>
<li>그만하 라고 솔루션 3-4 회 분무 되 후 생존 하는 식물을 식별 합니다. 3-5 잎 비교적 큰 표면 영역을 개발할 때까지 또 다른 2-3 주에 대 한 식물을 성장.</li>
		<li>식물 당 최대 성숙한 잎을 선택 하 고 왁 스 층을 제거 하는 손가락으로 부드럽게 잎의 표면을 문질러 (6.3.1 단계)에서 희석된 바스 솔루션의 드롭 장소. 참고: 그만하 라고 드롭과 가까운 줄기에 종이 테이프를 배치 하 여 적용 하는 잎의 위치를 표시 합니다.</li>
		<li>나뭇잎 바스 드롭 최대 1 주일까지 들고의 흔적에 대 한 적용을 모니터링 합니다. 그만하 라고 상품에 의해 영향을 받지 않는 잎을 가진 식물을 선택 합니다. 참고: 가장 거짓 양성 식물에서 잎 바스 솔루션의 드롭그림 3(C) 건조 후에 진정한 긍정에서 잎은 그대로 2 일 이내 시 들고를 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
긍정적인 transformants 게놈 PCR를 사용 하 여 확인 합니다.
	<ol>
<li>2-3 잎 단계 6.4.5에서 살아남은 식물에서 수집 합니다.</li>
		<li>CTAB 방법23 또는 다른 적절 한 DNA 추출 방법을 사용 하 여 잎에서 게놈 DNA를 추출 합니다.</li>
		<li>(긍정적인 컨트롤로) 대상 식물, 야생-타입 식물 (컨트롤로 부정적인), 단계 3.1에서에서 플라스 미드 구조에서 추출 된 genomic DNA 견본을 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 예를 들어 선택적 마커 유전자 특정 PCR 뇌관의 적절 한 쌍을 사용 하 여, 라고 내성 유전자 (바), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (앞으로)와 GTCAACCACTACATCGAGACAA (반전)에 대 한.<ol>
<li>예제에서는 PCR 뇌관 바 유전자를 대상으로 사용 하 여 다음 PCR 조건: 30 98 ° C에 초기 변성 단계 s; 뒤에 98 ° C 30에서 변성 시키기의 30 주기 s, 59 ° C 30에서 어 닐 링 s, 그리고 30 대 72 ° C에서 확장 s; 그리고 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장. 참고: 전체 T-DNA의 삽입을 위해,이 좋습니다 또한 선택적 마커 유전자에서 PCR 뇌관을 사용 하 여 게놈 PCR을 수행 하 고 다른 PCR 뇌관 대상 시퀀스에 단계에서 공장 변환 벡터를 복제</li>
		</ol>
</li>
		<li>Agarose 젤 전기 이동 법17 대상 샘플(그림 4)에 대 한 뿐만 아니라 사용 하 여 격리 된 PCR 제품19 시퀀싱 증폭된 바 PCR 제품의 예상된 크기의 존재를 확인 2.1 단계 에서처럼 동일한 절차입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

식물의 생리 적 상태 변환25의 효율을 크게 영향을 줍니다. 변환에 대 한 건강 하 고 활기찬 식물의 사용 S. parvula에서 성공적인 변환에 대 한 주요 요구 사항입니다. 물 또는 가벼운 스트레스 식물 변환 (그림 1, 센터 패널)에 대 한 이상적인 건강 한 식물에 비해 적은 꽃 있을 것 이다. S. parvula 는 빛의 강도에 성장할 수 있는 보다 작은 130 µmol m-2의 -1하지만 식물 경향이 frailer; 이러한 식물 들이 더 이어질 것 이다 꽃 꽃 찍어 다음 중단. S. parvula 보다 더 높은 속도로 Agrobacterium 담근 꽃을 중단 하는 경향이 있다 A. thaliana. 따라서, 중단된 꽃 A. tumefaciens 침투 솔루션에서는 감소 하는 경우를 최소화 하기 위해 이동 하는...

이 프로토콜에서 성장 및 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula에 대 한 안정적인 유전자 변형 라인의 설립을 설명합니다. 효율적인 변환 시스템의 가용성은 어떤 다양 한 유전자 모델의 특징 이다. 극한 환경에서 번 창 하는 식물 extremophytes, 식물 환경 스트레스에 적응을 이해 하기 위한 중요 한 리소스 제공 이라고 합니다. Schrenkiella parvula (이전 Thellungiella parvula , Eutrema parvulum) 게놈 자원1,2,3,,45를 확대와 함께 한 같은 extremophyte 모델입니다. 그러나, 변환 프로토콜 하지 아직 보고 되었습니다 S. parvula 에 대 한 게시 된 연구.
S. parvula 의 게놈 십자화과 (겨자 양배추 가족)에 첫 번째 게시 된 extremophyte 게놈 이며 비 extremophyte 모델, 애기 thaliana1광범위 한 전체 게놈 synteny를 보여줍니다. 따라서, A. thaliana S. parvula 사이 비교 연구 A. thaliana 어떻게 parvula S. 게놈 진화 있으며 규제에 유익한 가설을 수행 하는 유전자 연구의 재산에서 혜택을 수 있는 다르게 대처에 극단적인 환경5,,67강조 합니다. S. parvula 는 가장 소금 관대 (토양 NaCl LD50 기준) 알려진된 야생 친척 중의 종 A. thaliana8중 하나입니다. NaCl 내성 이외 S. parvula 통과 대부분 식물7독성 높은 농도에서 여러 소금 이온의 존재 그것의 수명 주기를 완료. 그것의 자연 서식 지에서 널리 퍼진 abiotic 스트레스에 대응, 그것 중 여러 연구에서 생화학 또는 생리 적 레벨 8,,910, 다양 한 특성을 진화 했다 11.
2010 년부터 대상 종으로 S. parvula 를 사용 하거나 다른 식물 게놈 비교에 사용 하는 400 개 이상의 피어 reveiwed 게시 되었습니다. 그러나, 분명 병목 어떤 유형의 연구를 실시 했습니다의 면밀 한으로 확인 될 수 있습니다. 대부분의 이러한 보고서의 미래 연구에 S. parvula 의 잠재적인 사용을 논의 하거나 비교 genomic 또는 phylogenomic 연구에서 그것을 사용 하 여. 개념 증명 변환 프로토콜의 부족으로 인해 설립 S. parvula에 대 한 날짜에 사용할 수 있는 최고 품질 식물 게놈의 한이 있는도 불구 하 고 기능 게놈 연구에 사용 되지 않은 (> 5 Mb contig N50) 조립 및 염색체 수준 pseudomolecules1에 주석을 답니다.
Agrobacterium 중재 꽃 dip 변환 방법 A. thaliana에서 trasngenic 라인을 만드는 가장 광범위 하 게 사용 되는 방법은 되고있다 그리고 변환의 재현 시스템의 개발은으로 그것의 성공에 중요 한 요소는 유전자 모델12,13. 그러나, 모든 십자화과 종 A. thaliana개발 꽃 딥 방법을 사용 하 여 변환 성공적으로 표시 되었습니다. 특히, S. parvula 를 포함 하는 십자화과 리니지 II 종 꽃-딥 기반된 변환 방법14,15고집 불통 되었습니다.
S. parvula, 그것의 좁은 잎 형태와 결합의 불확정 꽃 성장 습관 도전 표준 Agrobacterium 중재 꽃 딥 변환 방법을 채택 했다. 이 연구에서 우리는 수정 된 프로토콜 S. parvula의 재현성 변화에 대 한 개발 했습니다 보고 합니다.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-762</td><td>Bacto 한천 솔디파잉제, BD 진단</td></tr><tr><td>B5 비타민</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1019</td><td>Gamborg' s 비타민 용액</td></tr><tr><td>건조제</td><td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td><td>22005</td> 식물 변형을위한 <td>DRIERITE 6 메쉬</td></tr><tr><td>목적지 벡터</td><td>표시 TAIR</td><td>벡터 : 6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>Electroporation 큐벳, 둥근 캡, 0.2cm 갭</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td><td>1652100</td><td>MicroPulser Electroporator</td></tr><tr><td>비료 비즈</td><td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td><td>N/A</td><td>Osmocote 스마트 릴리스 식물 식품&nbsp; 플라워 & 식물성</td></tr><tr><td>젤 추출 키트</td><td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin 총 단편 DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1914-5G</td><td>Gentamicin sulfate</td></tr><tr><td>Glufosinate-ammonium (11.3%) 제초제 (BASTA)</td><td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td><td>N / A</td><td>FINALE 제초제</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>200004-444</td><td>Kanamycin monosulfate</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld, Dublin, OH</td><td>41320024-2</td><td>MES, Free Acid</td></tr><tr><td>MS salt</td><td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td><td>092621822</td><td>Hoagland의 변형된 기초 염 혼합물</td></tr><tr><td>N6-benzylaminopurine (BA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>B3274</td><td>6-Benzylaminopurine 용액</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Alrich</td><td>S7653</td><td>염화나트륨</td></tr><tr><td>비이온 세제</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&nbsp;</td></tr><tr><td>플라스미드 분리 키트</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D4036</td><td>Zyppy 플라스미드 키트</td></tr><tr><td>재조합 효소 믹스 키트</td><td>Life Technology</td><td>11791-020</td><td>Gateway LR Clonase II 효소 믹스</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R3501-1G</td><td>Rifampicin, 분말, 
&#8805; 97 % (HPLC)</td></tr> <tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 벤치 탑 궤도 쉐이커</td></tr><tr><td>토양 믹스</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 재배자 믹스</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>멸균 50 mL 원추형 튜브</td><td>USA Scientific, Ocala, FL</td><td>1500-1811</td><td>50mL 원뿔형 스크류 캡 튜브, 공중합체, 랙, 멸균</td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>57-50-1</td><td>수크로오스, ACS</td></tr><tr><td>계면활성제 용액</td><td>Lehle 종자, Round Rock, TX</td><td>VIS-02</td><td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>Topoisomerase-based cloning kit</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>K240020</td><td>pENTR/D-TOPO 클로닝 키트, One Shot TOP10 Chemically CompetentE. coli</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-722&nbsp;</td><td>BD Bacto 효모 추출물, BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

식물 성장 및 extremophyte schrenkiella parvula 의 꽃-딥 변환 agrobacterium 중재

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula 는 여러 이온 독성 스트레스를 포함 하 여 다양 한 abiotic 스트레스에 적응 하는 extremophyte입니다. 높은-품질 게놈 자원을 사용할 수 있는도 불구 하 고 식물 환경에 적응 하는 방법을 공부를 강조, 기능 유전체학 모델 값 고 도구 가능한 변환 시스템의 부족에 의해 제한 되어 있다. 이 프로토콜에서 우리는 안정적인 유전자 변형 미 parvula 를 생성 하는 방법을 보고 Agrobacterium 중재 꽃 딥 방법을 사용 하 여 라인. 우리는 A. thaliana 불확정 꽃 습관 등 잎에 높은 epicuticular 왁 스 콘텐츠 S. parvula의 독특한 특성에 대 한 계정에 사용 하는 변환 프로토콜을 수정 합니다. 간단히, S. parvula 씨앗 심기 전에 5 일 동안 4 ° C에서 층 화 되었다. 식물 photoperiod 14 h 빛과 어둠 10 h과는 130 µmol m-2s-1 빛의 강도, 22 ° C 24 ° c에서 성장 했다 8 9 주 된 식물 여러 inflorescences 변환에 대 한 선정 됐다. 이러한 inflorescences Agrobacterium tumefaciens GV3101의 pMP90RK 플라스 미드를 들고 침투 솔루션에서 감소 했다. 우리는 꽃 찍기 변환 효율을 높이기 위해 3 ~ 4 주 간격으로 2 라운드를 수행. T1 씨앗 수집 하 고 후보에 대 한 화면 발 변형 라인 전에 방와 컨테이너에 4 주 동안 건조 했다. 그만하 라고 저항 T1 식물에 사용 되었다. 우리는 가양성을 줄이기 위해 2 주 된 식물에서 시작 하는 3 일 간격으로 세 번 그만하 라고 솔루션을 살포. 그만하 라고 드롭 테스트 살아남는 진정한 긍정적인 transformants를 식별 하기 위해 개별 공장에서 수행 되었다. 변환 효율 0.033%, 10000 T1 씨앗 전파 당 3-4 유전자 변형 식물을 양보 했다.

우리는 150 일 이내 T0 씨앗의 수확을 가능 하 게 변환 프로토콜을 A. thaliana에서 수정 꽃 딥 방법을 사용 하 여 개발 했다. 그림 1 타임 라인 및 S. parvula 식물 꽃 딥 통해 변화를 실행 하기 위한 최적의 단계를 나타내는 요약을 보여 줍니다. 우리는 변환에 대 한 대상 무대도 발 아 후 60-80 일에 여러 inflorescences에 S. parvula 70 –80 꽃을 가진 식물을 선택. 기존의 오픈 또는 수정 된 꽃 및이 단계에서 siliques의 작은 수 꽃 dip 방법으로 A. tumefaciens 침투 하기 전에 제거 되었다. A. tumefaciens 감염 (그림 2(a) 괄호) 꽃의 낙태 귀착되는. Siliques 꽃 딥 변형...

Agrobacterium 중재 변환 꽃 딥 메서드를 사용 하 여 성공적으로 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula의 안정적인 유전자 변형 라인을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 선물이 프로토콜에서 애기 thaliana, 다른 성장 습관을 고려 하 고는 extremophyte의 생리 적 특성에 대 한 수정.

식물 성장 및 Extremophyte Schrenkiella parvula 의 꽃-딥 변환 Agrobacterium 중재

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

이 방법은 슈렌키엘라 파르불라의 재현 가능한 변형 프로토콜로 식물 비교 및 기능 적 젠닝 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 식물 적응을 거친 환경에 대한 연구로 조사합니다. 이 기술은 다중 이온 염응응에 적응된 극성에 대한 슈렌키엘라 파르불라의 일상적인 기능을 조사할 수 있게 해줍니다. 그것은 또한 그것의 가까운 친척, 어머니 부모 아리비도프시스 탈리아나를 보는 비교 연구를 가능하게 합니다.슈렌키엘라 파르불라와 아리비도프시스 탈리아나를 비교하면 슈렌키엘라 파르부엘라의 독특한 적응을 가능하게 하는 유전자 조절 및 기능의 차이에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아라비도시스 탈리아나의 변형 프로토콜은 이미 잘 확립되어 있습니다. 이 방법은 이제 트랜스제닉 슈렌키엘라 파르불라 식물을 사용하여 비교 연구를 가능하게합니다.일반적으로이 방법에 새로운 연구원은 꽃 습관과 식물 딥뿐만 아니라 진정한 변압제의 선택을 사용하여 효과적인 변환을 만드는 Schrenkiella Parvula 식물의 잎 형태 때문에 투쟁할 것입니다. 시작하려면 젖은 이쑤시개를 사용하여 약 20~25개의 S.Parvula 씨앗을 젖은 토양으로 옮긴다. 그런 다음 5 ~7 일 동안 섭씨 4도에서 씨앗을 계층화합니다.계층화 후, 7 ~10 일 동안 성장 챔버에 씨앗을 반환합니다. 모든 묘목이 발아되면, 네 모서리와 냄비의 중앙에 하나의 묘목을 둡니다. 식물이 꽃을 피우기 전까지 성장 실에서 8~10주 동안 식물을 재배합니다.변환 당일 텍스트 프로토콜에 따라 S.Parvula 식물을 선택합니다. 집게와 작은 가위를 사용하여 이미 실리크로 발전하고있는 수분된 꽃집을 제거하십시오. 식물이 준비된 후, 농균 침투 용액을 준비하십시오.그 후, 20초 동안 S.Parvula 의 침투 용액을 아그로박테리움 침투 용액으로 담급드세요. 여기에 이미 개발 된 실리크가 변환전에 제거되는 한 변환에 사용할 수있는 식물의 초기 단계이며, 더 많은 꽃을 가진 오래된 식물을 사용할 수 있습니다. 변환 후, 식물을 커버하기 위해 돔깨끗한 트레이에 수평으로 담근 꽃을 놓습니다.그런 다음 1 ~2 일 동안 어두운 성장실에 식물을 놓습니다. 식물을 똑바로 세워 서 성장실로 옮기면 됩니다. 다음 주에 담근 꽃집을 모니터링합니다.첫 번째 꽃 딥 후 10 일, S.Parvula 식물은 새로운 꽃과 실리크를 생산 계속됩니다. 새로 떠오르는 꽃무늬를 더욱 변화시키기 위해 두 번째 꽃 딥을 연주할 수 있습니다. 씨앗이 성숙 할 때까지 식물을 성장하고, 약 21 주 씨앗을 수확.건조제로 채워진 밀폐 용기에 실온에서 2 ~ 3 주 동안 씨앗을 건조. 텍스트 프로토콜에 따라 T 씨앗을 심습니다. 처음 2~3개의 진정한 잎이 생길 때까지 식물을 재배합니다.제초제 저항에 대한 첫 번째 선택을 수행하려면 글루포시늄 제초제를 희석하고 모종에 스프레이하십시오. 하룻밤 사이에 돔으로 묘목을 덮습니다. 트레이를 다시 성장실로 넣고 돔을 제거합니다.대부분의 묘목이 제초제에 의해 선택될 때까지 기다립니다. 두 번째 선택을 시작하려면 BASTA 용액으로 3~4회 분사한 후 살아남은 식물을 식별합니다. 2 ~ 3 주 동안 식물을 재배 한 후 각 식물에서 가장 큰 성숙한 잎을 선택하십시오.다음으로 잎 표면을 손가락으로 부드럽게 문지르면 왁스 층을 제거합니다. 그런 다음 잎에 희석 된 BASTA 용액한 방울을 놓습니다. BASTA 솔루션으로 처리된 잎을 최대 1주일 동안 시스팅할 징후를 모니터링합니다.마지막으로 추가 분석을 위해 BASTA 낙하의 영향을 받지 않는 잎이 있는 식물을 선택합니다. 이 프로토콜에서 S.Parvula는 꽃 딥 방법을 사용하여 아그로박테리움으로 변형되었습니다. 농균 감염은 일부 꽃의 낙태 결과.그러나 S.Parvula 식물은 첫 번째 꽃 담그기 후 새로운 꽃을 계속 생산하고, 다시 변환 할 수 있습니다. BASTA 스프레이 및 드롭 테스트를 사용하여 진정한 양성 변압제를 정확하게 식별할 수 있습니다. PCR 확인을 사용하여 테스트된 샘플 수를 줄일 수 있습니다.이 방법은 아라비도시스 탈리아나의 변형과 유사하지만, 슈렌키엘라 파르불라의 성장과 형태에 대한 차이를 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 차이를 반영하도록 프로토콜을 수정하는 것은 성공적인 변환에 매우 중요합니다. 이 기술은 연구원이 극단적 인 모델, 슈렌키엘라 파르불라에서 여러 염응 적응으로 이어지는 게놈 변이의 진화를 탐구하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술을 아랄도시스 탈리아나의 기능에 대한 정보와 결합, 슈렌키엘라 파르불라와 밀접하게 관련된 또 다른 공장. 연구원은 이 두 종 사이 2개의 명백한 구조물인 규칙 그리고 기능에 있는 변이를 공부할 수 있습니다. 변환 과정에서 모든 아그로박테리움 침투 용액을 자동 복제 가능한 용기에 포함하는 것이 중요합니다.장갑, 매크로 파이펫 팁 및 종이 타월을 포함하여 아그로박테리움과 접촉한 모든 재료를 살균하고 안전하게 폐기하십시오.

plant-growth-agrobacterium-mediated-floral-dip-transformation

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

출처: Lee, H. et. al., 감염 중 박테리아로부터 전달되는 이펙터를 시각화하기 위한 녹색 형광 단백질 시스템 분할. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 공초점 현미경과 결합된 분할 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 상보를 사용하여 식물 세포에서 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 이 접근 방식을 통해 숙주 세포 세포질로의 이펙터 전좌를 정확하게 시각화할 수 있습니다.

식물 세포의 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달 모니터링

이 비디오에서는 Agrobacterium 매개 이진 박테리아 인공 염색체 기반 유전자 변형을 통해 안정적인 전이유전자를 발현하는 형질전환 애기장대 식물의 생성을 보여줍니다.

애기장대 식물의 이진 박테리아 인공 염색체 벡터 기반 유전자 변환: 단일 사본 삽입으로 형질전환 식물을 생성하는 기술

여기, 우리는 꽃 딥 통해 아그로 박테 리움을 매개 성 식물 형질 전환을 사용하여 아마 변환하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 수행 간단하고 저렴하면서도 아마 변환에 대한 현재 가능한 방법보다 더 높은 변환 속도를 산출한다.

아마의 꽃 - 딥 변환 ( LINUM usitatissimum) 높은 변환 속도와 형질 전환 자손을 생성합니다

PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

여기서 우리는 대장균 또는 니코티아나 벤타미아나에서생합성 효소의 합성 발현을 통해 디테르페노이드 대사산물을 생산하고 정화하기 위한 프로토콜을 쉽게 사용하고 크로마토그라피 생성물을 제시합니다. 정화. 생성된 대사산물은 분자 구조 특성화, 효소 기능성 연구 및 생체 활성 검정을 포함한 다양한 연구에 적합합니다.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

이 프로토콜은 녹색 미세조류 클로렐라 심가리스(Chlorella vulgaris)의 핵 게놈에 관심 유전자를 통합하기 위한 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)의 활용을 간략하게 설명하여 안정적인 형질전환체를 생산합니다.

Agrobacterium tumefaciens-Medited Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris (녹색 미세 조류, 클로렐라 심가리스의 Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris)

우리는 자원 집약적 멸균 조직 배양 절차 없이 무성 양서류 배두과(Brassicaceae) 종인 Rorippa aquatica의 아그로박테리움 매개 변환을 위한 효율적이고 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 시각적 변형 마커와 새싹 재생 파이프라인을 활용해 거의 클론 변환체에 가까운 변환체를 성공적으로 생성하여 식물의 수중 환경에 적응하는 미래 연구를 진전시켰습니다.

무성 양서류 배아과(Rorippa aquatica)의 재생 기반 아그로박테리움 매개 효율적인 변형

우리는 P. capsici  에도 적용 가능한 Phytophthora palmivora의 아그로박테리움 매개 변형을 위한 간단하고 효과적이며 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다.

아그로박테리움 매개 피토프토라 팜미보라의 변형을 위한 간소화된 방법

배우세요 극한 환경 적응 식물 Schrenkiella parvula의 안정적 형질전환을 위한 꽃-딥 방법을 활용한 Agrobacterium 중재 유전자 도입 기술입니다. 이 프로토콜은 다중 이온 염 스트레스 적응 연구와 Arabidopsis thaliana 비교 기능 유전체학 연구에 활용됩니다.

식물 성장 및 Extremophyte Schrenkiella parvula 의 꽃-딥 변환 Agrobacterium 중재

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