재조합 막 단백질의 양성자 회전 속도 분석 하기 위한 마이크로-agar 소금 다리 전극

이 방법은 수송기 및 채널과 같은 막 단백질의 조사에 도움이 될 수 있습니다. 단백질 활동 및 특이성 및 상이한 생리학적 및 병리학적 조건을 비교하는 기판 이직률 손실에 대한 정보. 이 기술의 주요 장점은 잠재적인 시프트 변화와 염화물 없는 완충 조건을 최소화한다는 것입니다.

또한 보다 정확한 멤브레인 전위 측정으로 인해 이직률 결정의 정밀도를 크게 높입니다. 주먹 단계의 요소를 수집합니다. 여기에는 두 개의 마이크로 모세관 파이펫 팁, 날카로운 블레이드 및 슬라이딩 캘리퍼가 포함됩니다.

전극의 경우 은철사, 모래 종이 및 3개의 어금니 칼륨 용액을 손에 들고 있습니다. 또한 청소용 에탄올과 물, DC 전원 공급 장치가 있습니다. 두 개의 마이크로 파이펫 팁으로 작업하여 진행합니다.

버퍼가 포함된 팁으로 시작합니다. 두 번째 팁을 첫 번째 팁 옆에 놓습니다. 두 번째 팁을 이동하므로, 삽입할 때 좁은 부분이 첫 번째 의 좁은 부분으로 적어도 5밀리미터 연장됩니다.

팁이 포함된 첫 번째 버퍼가 연결된 위치를 표시합니다. 그런 다음 캘리퍼를 사용하여 미세 천 소금 브리지 전극의 길이를 측정합니다. 블레이드를 사용하여 팁을 적절한 길이로 자른다.

절단된 표면을 에탄올로 청소한 다음 물을 닦습니다. 다음으로, 전극에 대한 은전선의 약 8센티미터길이를 얻을 수 있습니다. 물에 이어 에탄올로 물티슈에 와이어를 청소하십시오.

청소 후 모래 종이를 사용하여 한쪽 끝에서 1센티미터 길이의 표면을 부드럽게 합니다. 매끄러운 끝이있는이 와이어는 전기 화학적으로 코팅 될 준비가되어 있습니다. 코팅을 위한 DC 전원 공급 장치에 연결된 다른 쪽 끝으로 염화 칼륨 용액에 매끄러운 끝을 넣습니다.

코팅하면 전극을 분리하고 물로 청소하십시오. 건조 한 후, 가능한 한 깊이 마이크로 모세관 팁을 관통 할 수있는 길이를 결정합니다. 전극을 코팅되지 않은 쪽에서 적절한 길이로 자른다.

이제 아가로즈와 함께 소금 용액을 준비하십시오. 물을 포함하는 플라스크에서 염화칼륨을 용해시키고 자기 교반기를 사용하여 혼합을 돕습니다. 교반기를 제거 한 후 플라스크에 아가로즈를 추가합니다.

플라스크를 전자레인지에 넣고 가열하여 약 섭씨 100도에서 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈가 완전히 용해되어 있는지 시각적으로 확인하려면 꺼내십시오. 아가로즈가 용해되면 기포를 피하기 위해 천천히 마이크로 모세관에 파이펫 10 마이크로 리터가 용해됩니다.

특히 높은 천 농도에서 한천 염액을 마이크로 모세관 팁에 조심스럽게 파이펫하는 것이 중요합니다. 제대로 하지 않으면 기포는 팁에서 쉽게 생성되고 전기 흐름을 차단합니다. 파이펫에서 팁을 제거 한 후 전극을 밀어 넣습니다.

전극이 소금 용액에 침투하도록 합니다. 전극이 실온에 있을 때 기준 전극을 증폭기로 연결합니다. 1밀리리터의 완충제로 플라스틱 용기로 낮출 수 있도록 기준 전극을 지원합니다.

다음으로 소금 다리 전극을 용액에 담급넣습니다. 전압을 적용하고 계속하기 전에 전류 응답이 있는지 확인합니다. 테스트가 성공하면 전극을 분리합니다.

필요한 경우 염화물 3개의 대구물에 담그어 소금 다리 전극을 보관하십시오. 다음으로 플라스틱 팁이 포함된 버퍼를 준비합니다. 마이크로 모세관 팁을 가지고 좁은 부분에서 2 센티미터 지점을 식별합니다.

가열 와이어를 사용하여이 위치에서 튜브를 90도 구부립니다. 날카로운 칼로 구부러진 튜브를 5밀리미터 잘라냅니다. 에탄올로 절단된 부위를 청소한 다음 물을 닦습니다.

진행하기 전에 축척이 있는 광 현미경을 사용하여 끝에 있는 구멍의 직경을 측정합니다. 그런 다음 파이펫을 용매 용기와 다른 버퍼 근처에 이동합니다. 파이펫 은 용매의 마이크로 리터 3 개가 팁 안팎으로 들어갑니다.

다음으로 측정 팁을 버퍼 의 세 마이크로 리터로 채웁니다. 이제 염화칼륨 용액에서 소금 다리를 회수하십시오. 측정 팁을 버퍼와 함께 소금 브리지 전극에 연결합니다.

염교 전극과 기준 전극을 증폭기와 연결합니다. 이 시점에서, 기준 전극을 가진 완충액에서 염교 전극을 일시 중단한다. 실험에 대한 구성의 표현은 이 회로도에 있습니다.

실험 중에 멤브레인은 파이펫을 포함하는 버퍼의 끝에 형성됩니다. 데이터를 수집하여 멤브레인 용량을 찾습니다. 삼각형 교대 전압 신호를 적용하여 직사각형 교대 전류 응답을 생성하여 이 작업을 수행합니다.

다음으로, 제로 전류에서 전도도 및 전압을 찾습니다. 마이너스 50에서 50 밀리볼트에 이르는 전압 램프의 적용을 자동화하고 전류를 기록합니다. 선형 함수를 데이터에 맞춥시게 합니다.

경사는 전도이며 x-intercept는 0 전류의 전압입니다. 완료되면 소금 다리에서 측정 팁을 제거합니다. 버퍼로 새 측정 팁을 채우고 다른 pH 값으로 조정하여 멤브레인 을 가로질러 양성자 그라데이션을 설정합니다.

측정을 반복하기 위해 새로운 측정 팁과 전극으로 실험 설정을 다시 설정합니다. 다음은 pH 그라데이션이 있는 대표적인 전류 전압 기록입니다. 그리고, pH 그라데이션이 없는 경우.

선은 데이터에 선형 맞춤을 나타냅니다. 다른 pH 값에 대한 x축 교차점의 변화는 Nernst 방정식에 의해 예측됩니다. 이러한 데이터는 흰색의 표준 은 염화물 전극과 검은 색의 미세 천염 교량 전극에 대한 멤브레인 전세의 변화를 나타냅니다.

천소금 다리 전극은 측정 300초 동안 최대 5밀리볼트 미만의 최대 시프트로 더욱 안정되었습니다. pH 그라데이션의 함수로서 잠재적 인 변화의 이 플롯에서 두 전극은 pH 그라데이션이 증가함에 따라 현저하게 다르게 작동하는 것으로 보입니다. 양성자 회전율은 두 전극 유형에 대해 찾아서 비교할 수 있다.

다음은 표준 전극에 비해 염교 전극에 의해 측정된 미토콘드리아 분리 단백질 1UCP1을 위해 결정된 양성자 회전수 수이다. 유사하게 준비된 UCP3에 대한 데이터도 있습니다. 이 속도는 천 소금 다리 전극으로 더 정확하게 보입니다.

이 절차를 시도하는 동안 전극이 천염 용액에 침투하는지 확인하는 것이 중요합니다. 소금 다리도 버퍼 용액에 담그어야 합니다. 마지막으로, 천소금 용액에 기포가 포함되어 있지 않습니다.