Name: 재조합 막 단백질의 양성자 회전 속도 분석 하기 위한 마이크로-agar 소금 다리 전극 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 재조합 막 단백질의 양성자 회전 속도를 정밀 측정하는 마이크로-agar 소금 다리 전극 기법을. 이 방법은 확산 전위 왜곡을 최소화하여 막 단백질 활성 연구의 정확도를 높입니다.

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이 작품은 오스트리아 연구 기금 (E.E.P.에 P31559-B20)에 의해 지원 되었다. 저자는 생산에서 우수한 기술 지원에 대 한 사라 Bardakji 감사 하 고 재구성의 마우스 UCP1 및 UCP3 proteoliposomes에.

1. 재조합 연결을 푸는 단백질 (UCPs)의 생산 및 평면 Bilayer 막의 형성
<ol><li>Rupprecht 외 에 설명 된 대로 재조합 UCP1와 UCP3를 생산 9 및 Hilse 외. 10
</li>
	<li>벡 외 에 설명 된 대로 기존의 불가결 플라스틱 펫의 팁에 평면 bilayer 막 형성 7
</li>
</ol>2. 마이크로 agar 소금 다리 전극의 준비
<ol><li>조정 microcapillary 피 펫 팁 적절 한 길이를 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>포함 하는 버퍼 팁에 부착 될 것입니다 및 슬라이딩 캘리퍼스를 사용 하 여 마이크로-agar 소금 다리 전극의 길이 측정 하는 빈 끝에 위치를 표시 합니다. 주의: microcapillary 팁 해야 합니다 충분히 측정에 대 한 버퍼 솔루션을 입력.</li>
		<li>날카로운 칼 또는 블레이드 microcapillary 끝을 잘라 고 에탄올과 물 커트 표면 청소.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AgCl 코팅 전극을 준비 합니다.<ol>
<li>길이 약 8cm의 Ag 와이어에서 잘라내어 에탄올과 물으로 청소.</li>
		<li>샌드 페이퍼의 한 조각을 그리고 소금 솔루션 접촉 해야 와이어의 끝에 1 cm 길이의 표면 아래로 부드럽게.</li>
		<li>3m KCl 솔루션으로 마무리 끝을 찍어와 10 1.5 V DC 공급 장치를 사용 하 여 염화와 그것을 화학적 코트 s.</li>
		<li>물으로 전극 청소 하 고, 건조 한 microcapillary 팁 가능한 깊은 침투 코팅된 측에서 AgCl 전극의 길이 조정. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3m KCl 소금 솔루션 1% (v/v) agarose 준비 합니다.<ol>
<li>그리고 KCl의 4.47 g 밖으로 무게는 플라스 크에 감동 하 여 그것을 물 20 mL에 녹.</li>
		<li>활동가 제거 하 고의 agarose, 0.2 g으로 무게는 플라스 크에 추가.</li>
		<li>agarose를 용 해 하 고 응고 하지 않도록를 100 ° C에 솔루션을 열. 주의: 플라스 크 매우 뜨거운 될 것 이다입니다. 맨 손으로 그것을 만지지 마십시오. 글러브를 사용 하 여 처리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agarose 소금 솔루션 microcapillary 팁을 작성. 주의:이 솔루션은 뜨거운. 손을 보호 하 고 작업을 피하기 위해 신중 하 게 많아요.<ol>
<li>agarose 시작 되 면 응고, 열을 완전히 다시는 agarose를 녹 소금 솔루션을.</li>
		<li>Microcapillary 팁으로 agar 소금 솔루션의 10 µ L를 담근 다. 천천히 그것을 흡수 하 고 신중 하 게 거품을 공기를 피하기 위해 팁.</li>
		<li>피펫으로에서 끝을 제거 하 고 AgCl 전극 팁의 광범위 한 측면에서 밀어. 전극 소금 솔루션 침투 확인 합니다.</li>
		<li>실내 온도에 전극 아래로 냉각 하 고 앰프에 연결.</li>
	</ol>
</li>
	<li>측정에 대 한 버퍼를 준비 합니다.<ol>
<li>등4, MES의 0.195 g 나2의 0.710 g 밖으로 무게, 0.121 g 트라이앵글, EGTA, 0.023 g 비 커에 증류수 100 mL를 추가 하 고 솔루션을 저 어.</li>
		<li>PH 전극 사용 하 여 버퍼의 pH 값에 대 한 확인 하 고 pH 값 7.32 조정.</li>
		<li>기준 전극과 한 천 염 다리 전극 전기 접촉에 있는 확인 하십시오.<ol>
<li>플라스틱 용기를 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>기준 전극과 한 천 염 다리 전극에와 신호 응답 확인. 신호 응답이 정확한 경우 2.7 단계로 진행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>있다면 거짓 신호 응답 또는 전기 접촉에, 다음 문제 해결을 수행 합니다.<ol>
<li>소금 솔루션 접촉 전극 인지 확인 하 고 솔루션으로 전극을 밀어. 참고: 경우이 솔루션은 이미 너무 끈 적, 마이크로-agar 소금 다리를 제거 하 고 새로운 microcapillary 팁을 준비.</li>
		<li>소금 솔루션 내에서 공기 방울 인지 확인 하십시오. 그렇다면, 새로운 microcapillary 팁을 준비 합니다.</li>
		<li>버퍼 솔루션 문의 소금 솔루션 인지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 다음 다른 1 mm의 팁의 튜브 끝을 잘라. 주의: 팁은 아직도 충분히 포함 하는 버퍼 끝을 관통 하는 것을 해야 합니다. 여전히 접촉은, 새로운 microcapillary 팁을 준비.</li>
		<li>이러한 단계 중 도움이 새로운 microcapillary 팁을 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>저장용, 천 염 다리 전극 3 M KCl 해결책에 찍어. 참고: 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다. 일시 중지에 대 한 하룻밤, 4 ° c.에 3 M KCl 소금물에 전극을 저장</li>
	<li>플라스틱 팁 포함 하는 버퍼를 준비 합니다. 참고: 전극 하룻밤 저장 된 경우 밖으로 그것을가 고 그것을 하자 30 분 동안 실내 온도까지 열.<ol>
<li>Microcapillary 팁 고 벤드 튜브, 좁은 부분의 가장자리에서 2cm 난방 철사를 사용 하 여 약 90도.</li>
		<li>매우 날카로운 칼 또는 칼 날을 사용 하 고 굽이에서 약 5 m m 튜브를 잘라.</li>
		<li>끝에 에탄올과 물 표면을 청소 고 끝의 구멍의 지름을 측정 한다. 이것에서 표면 영역을 계산 합니다.</li>
		<li>코트 85:15 (v:) 헥 산: hexadecane와 팁의 표면.<ol>
<li>용 매의 3 µ L 플라스틱 고 끝에서 제거 합니다.</li>
			<li>모든 팁에 잔류 용 매 증발 되도록 1 분을 기다립니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>버퍼의 3 µ L를 측정 팁와 소금 다리 전극에 연결. 참고: 경우 소금 다리 전극과 참조 전극 전기 접촉에서 단계 2.5.3 수행 하 여 다시 확인 하십시오.</li>
		<li>전기 접촉 나 있는 경우에, 다음에 대 한 확인:<ol>
<li>소금 다리 전극 접촉 버퍼 솔루션 인지 확인 합니다. 그렇지 않다면, 다음에 있는 버퍼의 볼륨을 증가 하거나 더 긴 microcapillary 팁을 준비 합니다.</li>
			<li>공기 방울이 있는 경우에, 마이크로-소금 다리 전극에서 끝을 제거, 팁에 버퍼를 리필 그리고 그것 전극에 다시 꽂습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 재조합 단백질으로 재구성 하는 막의 전기 매개 변수 측정
<ol><li>삼각 교류 전압 신호를 적용 최대 전압 U최대 50 mV와 δ T램프 = = 50ms 사각형 교류 전류 응답을 만듭니다. 포지티브 및 네거티브 전류 (+ 어 나-)의 평균 값에서 다음 수식에 따라 막의 용량을 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>-50에서 배열 하는 전압 램프 적용 + 50 mV를 기록 현재 mV. -기울기는 전도도-데이터를 선형 함수에 맞게 그리고 적합의 x 축 교차점을 계산.</li>
	<li>플라스틱에 있는 솔루션을 방전 하 고 새로운 한 증가 기질 농도 포함 하는 버퍼를 채울.<ol>
<li>아니 막 처음으로 20-30 s 내에서 형성 되 면 볼륨 방전 고 그것을 리필. 이 막에 걸쳐 농도 기온 변화도 막 형성 동안 크게 변경 되지 않습니다 보장 합니다.</li>
		<li>막의 형성, 3.1과 3.2 다시 적절 한 막 형성을 확인 하 고 x 축 교차점을 단계를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 기판 회전 속도의 계산
주: 자세한 내용은3,7에 대 한 이전 작업을 참조 하십시오.
<ol><li>지질 및 단백질 (M지질 및 M단백질), 막의 한 지질 머리 그룹 (막 지질), 지역 및 당 단백질의 대량 비율의 분자 질량에서 막에 있는 단백질의 양을 추정합니다 지질 (r)입니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>네른스트 수송된 기판에 대 한 잠재적인 계산 합니다. R은 기체 상수, T는 온도, z 수송된 기판, F는 패러데이 상수, 및 c의 충전1 과 c2 막의 양측의 기판의 농도. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>전류-전압 녹음에서 걸릴 반전 잠재적인 존재와 부재의 기판 그라데이션 선형 맞는에서 x 축 교차점의 차이와 계산.</li>
	<li>네른스트 잠재적인11역 잠재력의 비율에 의해 기판 전도도, G기판, G총, 총 막 전도도의 비율을 계산 합니다. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>계산 기판 매출 번호 ΔN기판 기판 전도도 (G기판), 적용된 전압 U, 그리고 기판 z: 충전 시간 단위 δ T 당 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>단백질의 수는 시간 당 수송된 기판의 비율에서 이직 률 κ를 계산 합니다. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165668">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silver-silver+chloride+electrode%3A+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li>
<li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+kinetics+of+uncoupling+proteins.+Analysis+of+UCP1+reconstituted+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).</li>
<li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+human+uncoupling+proteins+1+and+2+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers.</a> The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).</li>
<li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+intrapipette+salt+bridge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple intrapipette salt bridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).</li>
<li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+automated+technique+for+the+reconstitution+of+hydrophobic+proteins+into+planar+bilayer+membranes.+Studies+of+human+recombinant+uncoupling+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li>
<li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li>
<li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li>
<li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li>
<li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li>
<li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li>
<li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

전극 마이크로-agar 소금 다리 구현 그것의 유포 가능성을 최소화 하 고 막 잠재적인 pH 기온 변화도 의해 생성 된의 더 정확한 측정을 허용 한다. 두 전극의 잠재적인 변화 다양 한 막 횡단 pH 기온 변화도, 존재 ΔpH에서 허용 했다 잠재적인 네른스트 평형의 이론적인 값을 비교할 때 0.35 = (Φ네른스트 23.8 = ΔpH에 대 한 mV = 0.4). 그러나, 더 많은 생리 적 pH 기온 변화도에서 인스턴스는 매트릭스와 intermembrane 공간, 표준 AgCl 전극 사이의 미토 콘 드리 아에서 ΔpH에 잠재적인 변화를 정확 하 게 측정 하지 못했습니다 = 1 (그림 3A) 합니다. 전극 마이크로-agar 소금 브리지 전달 값 훨씬 더 이론에 비교 했다.
버퍼 솔루션 실험 기간 동안 변경 되 면 잠재적인 확산 AgCl 기준 전극에 발생할 수 있습니다. 염화-무료 버퍼 솔루션 연결을 푸는 단백질 염화 이온 수송을 제안 했다 때문에 Tris 또는 MES를 사용 하 여 pH 조정 실험에서 사용 되었다. 전극 잠재력, 염화 물의 상당한 농도의 부재는 주로 염화 불순물 버퍼 솔루션에서에 따라 달라 집니다. 그것의 구성 실험 기간 동안 변경 되지 않습니다, 그것은 단순히 일정 오프셋된 가능성이 발생 합니다. 그러나, 두 개의 전극 사이의 절대적인 전위차 측정에 대 한 간단한 한 천 소금 브리지 시스템 (Ag/AgCl 3 M KCl) 또한 기준 전극에 대 한 사용 될 수 있습니다.
마이크로-agar 소금 다리 전극 전위의 평형에 의해 잠재적인 확산을 균형. 소금 솔루션 안정화를 위해 1% (w/v) agarose 버퍼 솔루션 소금물의 혼합을 방지 하기 위해 추가 되었습니다. + K 및 Cl- 소금 이온 액체에서 비슷한 mobilities 있고 전극 전위를 균형. 소금 다리를 제대로 설치 하려면 agar 소금 솔루션 충분히가 열 될 어떤 기포 없이 microcapillary 팁 작성 AgCl 전극 커버 하 고 있다. 더 사용 하기 전에 소금 다리 전극과 기준 전극 사이의 전기 접촉 확인할 수 있다. 염 다리를 사용 하는 시간에 따라 소금 솔루션은 수 충분히 gelled 어떤 버퍼와 소금 솔루션의 혼합을 방지 하기 위해. 이것은 K+ 또는 Cl- 전송기 조사 하는 경우에 특히 중요입니다. 그리고 염 다리 아주 짧은 시간 동안 사용 agarose의 차입은이 시간 범위에 무시할 수 있습니다. Agarose 최대 5%, 또는 천 (3%-5%)의 높은 농도 소금 다리를 사용 하 여 시간6,12의 더 긴 기간에 대 한 수 있습니다.
이 메서드는 전송 속도 론 (i)와 낮은 이직 률 막 운송업 자 그리고 (ii) 표준 패치 클램프 업13조사 거의 수 있는 내부 막의 미토 콘 드리 아 단백질의 결정을 수 있습니다. 그것의 정밀도 주로 낮은 총 막 전도도 및 막 잠재적인 아래 녹음의 소음을 유발 하는 작은 농도 기온 변화도에 있는 정확도 감소 역방향 잠재적인 측정에 의존 합니다.
이 설정 사용 하 여, UCP1와 UCP3는 동일한 조건 하에서 생산으로의 이직 률을 측정 했다. 높은 산도 그라데이션 때문 획득된 속도 더 정확 하 고 작은 전극 잠재적인 변화에서 발생 하는 인공 물에 의해 교란 될 것 같습니다. 그것은 더 분석 하 고 유사한 조건 하에서 생산 하는 미토 콘 드 리아 멤브레인 전송기를 비교 하 여 사용할 수 있습니다.

막 단백질은 모든 알려진된 의약품1의 최대 60%까지 타겟팅 됩니다. 막 단백질의 electrophysiological 측정 분석 기판 막 캐리어 단백질에 의해 중재의 electrogenic 전송 하 강력 하지만 섬세 한 도구입니다. 일정 전압 또는 전압 램프의 적용으로 막 횡단 전류의 변조 수 예를 들어, 활성화 및 저해 기질 또는 전송 사업자의 약리학 및 물리적 특성 평가 속도 론입니다. 특별 한 관심의 기판 매출 번호, 시간 단위 당 막 단백질에 의해 translocated 기판의 표시 이다. 다양 한 막 단백질의 활동을 비교 하는 경우 주요 매개 변수입니다. 막에 걸쳐 청구 기판의 농도 기온 변화도 설치는 기판의 매출 수 연 역 한 기전력 생성 합니다.
AgCl 전극에 사용 하 여, 염화 무료 버퍼의 존재 확산 잠재력을 전극 전위를 전류-전압 측정2의 변화에 이르게 만듭니다. 이러한 매개 변수 중 하나는 이후 그것은 표준 전도도 및 용량 측정에 대 한 무시할 수 있지만 항상 존재는 전류-전압 기록 (전도성) 또는 단일 기록 (용량)의 차이의 기울기에 따라 어떤 잠재력을 취소합니다. 그러나, 기판의 전송에 의해 생성 되는 역방향 잠재력의 녹음 잠재적인 확산에 의해 크게 방해 될 수 있습니다. 따라서, 역방향 잠재력의 정확한 측정을 위해 전극 전위를 일정 하 게 유지 될 필요가.
두 가지 방법으로 잠재적인 확산을 최소화할 수 있습니다: (i) bilayer 막의 존재 기질 농도 막3,4의 1 개의 측에 증가 또는 (ii) 소금 다리 균형 전극 전위 5. 첫 번째 방법은 높은 측정의 안정성에 따라 달라 집니다. 막 기판 솔루션에서 거의 동일 하 게 배포 때까지 교 반 아래 기판의 추가에서 몇 분 동안 살아남을 수 있다. 막 사이 파열, 기판 그라데이션 된 분자의 자유 교환에 의해 변경 하 고 측정 설정 부정확. 두 번째 방법은 잠재적인 확산을 균형 하지만 설정의 크기에 의해 제한 됩니다. 작은 구현 하지만 electrophysiological 설정에 마이크로 범위에 소금 다리를 작동6을도전 이다. 후자의 방법을 소금 솔루션은 microcapillary 팁으로 가득 및 버퍼 솔루션에 소금 솔루션의 확산을 방지 하기 위해 agarose의 추가 의해 안정.
이 프로토콜에서 마이크로-한 천 염 다리 및 피 펫 설정7 에 따라 electrophysiological 설정으로 구현 간단한 생산 설명 되어 있습니다. Microcapillary 팁 1 mol % (w/v) agarose 3m KCl 솔루션을 포함 하 고 다리는 AgCl 전극 및 버퍼 솔루션 조정 됩니다. 마이크로-소금 다리의 장점은 전극 잠재적인 변화의 시간 녹음 및 다양 한 pH 기온 변화도에 잠재적인 막의 더 정확한 측정으로 표시 됩니다. 리로 재구성 하는 재조합 형 단백질의 모델 시스템에서 미토 콘 드 리아 사업자 UCP1와 비슷한 조건 하에서 생산 하는 UCP3의 이직 률은 reinvestigated 이며 이전 결과3,8에 비해.

<table><tbody><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>마이크로캐필러리 피펫 팁</td></tr><tr><td>Ethanol 99%</td><td>AustrAlco &Ouml; 스터르. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td><td>AAAH-5020-07025-230317</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>DC 공급</td><td>Voltcraft</td><td>V10/CPG 1940 -01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Standard</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>3810.2</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>Heka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>샘플 튜브</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>5863.1</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>8560.3</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>4256.2</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH + Co.</td><td>Kg 3054.1</td><td></td></tr><tr><td>헥산</td><td>시그마-알드리치</td><td>296090-100ML</td><td></td></tr><tr><td>헥사데칸</td><td>시그마-알드리치</td><td>296317-100ML</td><td></td></tr><tr><td>전열선</td><td>볼트크래프트</td><td>USPS-2250</td><td></td></tr></tbody></table>

재조합 막 단백질의 양성자 회전 속도 분석 하기 위한 마이크로-agar 소금 다리 전극

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

날짜 하려면, 모든 약물 약물의 50% 이상이 막 단백질의 전송 속도 대상. 막 캐리어 단백질 지질 bilayer 막 재구성 electrophysiological 특성은 그들의 물리 화학적 및 약리 속성의 평가 대 한 강력 하지만 섬세 한 방법입니다. 기판 매출 수 다른 막 단백질의 활동의 비교를 허용 하는 고유 매개 변수입니다. Electrogenic 전송에서 translocated 기판의 그라데이션 막 잠재적인 단백질의 기판 회전 속도에 직접 연결을 만듭니다. 전극 잠재력을 상당히 정확한 막 잠재력 측정을 방해 사용 하 여 염화는 전극, 유포 잠재력, 가능성, 액체 접합 라고도 유발 됩니다. 전극 잠재력 균형 소금 다리 확산 가능성을 최소화할 수 있습니다. 이 문서에서는, 마이크로-한 천 염 다리는 electrophysiological 설정, 막 형성에 대 한 micropipettes를 사용 하 여 하도록 설계 되었습니다. 소금 솔루션 microcapillary 피 펫 팁, agarose의 추가 의해 안정으로 채워집니다 그리고 표준 전극에 쉽게 장착할 수 있습니다. 마이크로-소금 다리 전극의 전극 전위는 표준 전극에 비해 더 안정적입니다. 이 시스템의 구현 전극 전위를 안정화 하 고 막 잠재적인 pH 기온 변화도 의해 생성 된의 더 정확한 측정을 허용 한다. 이 시스템을 사용 하 여, 미토 콘 드 리아 사업자 UCP1 및 UCP3의 양성자 이직 률 reinvestigated 이며 이전 측정에 비해.

잠재적인 확산의 최소화, 확인 하는 그대로 막의 전류-전압 측정의 안정성 측정 했다. 그림 2A, 대표 전류 전압 녹음 존재 (흰색 점) 및 pH 기온 변화도의 부재 (검은 점)에 묘사 된다. Nernst 방정식에 따라 pH 기온 변화도 전압의 변화를 유도 한다. 데이터에 선형 적합의 x 축 교차 지점에서 잠재적인 변화 계산 됩니다. 두 전극을 테스트 하려면 x 축 교차점에 변화 (그림 2B; 백색 점) 표준 AgCl 전극과 마이크로-한 천 염 다리 (그림 2B, 검은 점 들)에 대 한 분석 했다. 전압 램프 연속에서 10 번을 기록 했다 하 고 x 축에 평균 근무 시간에 대 한 묘사. MV 측정, 표준 전극의 300 초 후에 최대 30 다양 한 소금 다리 전극 미만 5의 최대 변화를 했다 반면, 무작위, 예측할 수 없는 행동에 mV.
다음, 두 전극 다른 pH 기울기(그림 3)에서 테스트 되었습니다. 표준 전극 0.35와 1.0 (흰색 점)의 pH 기온 변화도 생성 했다; 대 한 한 천 염 다리 전극, 0.35, 0.7, 1.0 (검은 점)의 pH 기울기. 잠재력에 3 개의 독립적인 측정에서 분석 했다. 0.35, 어디 측정된 변화만 달라 약간의 그라데이션 달리 전압 변화는 크게 마이크로-한 천 염 다리의 부재에서 1.0의 pH 기온 변화도에서 변경 합니다. 데이터에 선형 적합에서 함수의 기울기 이며 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH 표준 전극 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH 마이크로-agar 소금 다리 전극에 대 한. Nernst 방정식에 따라 계산 된 잠재적인 변화는 60.7 mV/ΔpH t = 32 ° c.
마이크로-agar 소금 다리, 양성자 회전율 숫자를 사용 하 여 미토 콘 드 리아 UCP1 및 UCP3의 κ 측정 되었고 이전 측정 (그림 3B)에 비해. 그림 3A, ΔpH과 마찬가지로 = 1.0 생성 하 고 역방향 잠재력 측정 되었다. 막에 있는 단백질 양의 지질 비율 4 µ g의 단백질 프로토콜의 섹션 4에서에서 제공 하는 공식에 따라 추정 되었다 / (mg의 지질), 단백질 및 지질, 3.53 x 10 의 막 면적 33000, 및 750 Da의 분자 질량 -4 cm2, 그리고 10-15 cm2x 7.8의 지질 당 지역. 각각 UCP1 및 UCP3, κwas 5.56 ± 0.38의-1 과 4.10 ± 0.71의-1 를 획득 (그림 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> 그림 1 : 마이크로 agar 소금 다리로 electrophysiological 설정. (A)이이 패널 설정의 스케치를 표시 합니다. (오렌지에 묘사 된) 한 소금물을 포함 하는 microcapillary 팁 (블루) (까만) 전극과 포함 하는 버퍼 끝 사이 배치 됩니다. 막 (화살표로 표시) 포함 하는 버퍼 팁의 끝에 표면에 형성 된다. (B)이이 패널 마이크로-한 천 염 다리의 구현 electrophysiological 설정의 이미지를 보여 줍니다. 화살표는 전극, 마이크로-한 천 염 다리, 참조 전극 및 버퍼 솔루션 컨테이너를 가리킵니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> 그림 2 : 마이크로 agar 소금 다리와 표준 AgCl 전극의 비교. 존재 (회색 점)에 1의 pH 기온 변화도의 부재 (흰색 점) (A)이이 패널 쇼 대표 전류 전압 측정. 라인은 교차점 값은 전도성 및 x 축에서 가져온 데이터에 선형 적합을 나타냅니다. 전압 변화는 두 기록의 교차 값의 차이 의해 평가 됩니다. (B)이이 패널 시간에 마이크로-agar 소금 다리 전극 (검은 점)을 표준 AgCl 전극 (흰색 점)의 잠재적인 막의 변화를 보여 줍니다. 10 전류-전압 측정 한 행에 기록 된 고 잠재적인 확산에 의해 평균 전압 변화 시간에 대해 그려집니다. 모든 실험에서 막 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL 1.5 mg/mL의 농도에 15 몰 % 아라키 돈 산으로 재구성 되었다. 버퍼 포함 50 m m 나2등4, 10 mM MES, 10 mM TRIS, 그리고 pH에 0.6 m m EGTA = 7.34와 T = 32 ° c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> 그림 3 : PH 기온 변화도의 역방향 잠재력에서 UCP1 및 UCP3의 양성자 회전율 수 계산. (A)이이 패널 표준 AgCl 전극 (흰색 점)과 마이크로-agar 소금 다리 전극 (검은 점)의 다양 한 pH 기온 변화도의 UCP1 포함 된 막의 잠재력에 변화를 보여줍니다. 라인은 데이터에 선형 적합을 나타냅니다. (B)이이 패널 표시 UCP1 양성자 회전율 수 (첫 번째 데이터 집합) 및 UCP3 (2 차 데이터 세트) 프로토콜의 섹션 4에 있는 수식 따라 Nernst 잠재력을 전압 변화의 비율에서 계산. 각 집합의 첫 번째 막대 마이크로 agar 소금 다리와 함께 측정 하는 이직 률을 나타냅니다. 각 데이터 세트의 두 번째 바 이전 측정을 표준 AgCl 전극을 사용 하 여 나타냅니다. UCP1 및 UCP3 값을 Urbankova그 외 여러분 에서 찍은 3 그리고 Macher 외. 8. 모든 측정에서 막의 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL 15 몰 %AA UCP1/UCP3 재구성 되었다. 지질과 단백질의 농도가 1.5 mg/mL 및 µ g/4mg의 지질, 각각 이었다. 버퍼 포함 50 m m 나2등4, 10 mM MES, 10 mM TRIS, 그리고 pH에 0.6 m m EGTA = 7.34와 T = 32 ° c. 그라데이션 측정에 대 한 버퍼의 pH 7.66, 8.00, 또는 8.33 트리를 추가 하 여 증가 하 고 솔루션에 포함 된 피 펫에서 변경 되었습니다. 값은 3 개의 독립적인 측정의 평균 ± 표준 편차. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Electrophysiological 측정, 유포 잠재력의 존재 전극 전위를 변경 하 여 역 잠재력의 정확한 측정을 방해. 마이크로-한 천 염 다리를 사용 하 여 잠재적인 확산의 영향 최소화 됩니다, 재구성 된 재조합 막 단백질의 기판 회전율 숫자의 더 정확한 측정을 허용 하.

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

이 방법은 수송기 및 채널과 같은 막 단백질의 조사에 도움이 될 수 있습니다. 단백질 활동 및 특이성 및 상이한 생리학적 및 병리학적 조건을 비교하는 기판 이직률 손실에 대한 정보. 이 기술의 주요 장점은 잠재적인 시프트 변화와 염화물 없는 완충 조건을 최소화한다는 것입니다.또한 보다 정확한 멤브레인 전위 측정으로 인해 이직률 결정의 정밀도를 크게 높입니다. 주먹 단계의 요소를 수집합니다. 여기에는 두 개의 마이크로 모세관 파이펫 팁, 날카로운 블레이드 및 슬라이딩 캘리퍼가 포함됩니다.전극의 경우 은철사, 모래 종이 및 3개의 어금니 칼륨 용액을 손에 들고 있습니다. 또한 청소용 에탄올과 물, DC 전원 공급 장치가 있습니다. 두 개의 마이크로 파이펫 팁으로 작업하여 진행합니다.버퍼가 포함된 팁으로 시작합니다. 두 번째 팁을 첫 번째 팁 옆에 놓습니다. 두 번째 팁을 이동하므로, 삽입할 때 좁은 부분이 첫 번째 의 좁은 부분으로 적어도 5밀리미터 연장됩니다.팁이 포함된 첫 번째 버퍼가 연결된 위치를 표시합니다. 그런 다음 캘리퍼를 사용하여 미세 천 소금 브리지 전극의 길이를 측정합니다. 블레이드를 사용하여 팁을 적절한 길이로 자른다.절단된 표면을 에탄올로 청소한 다음 물을 닦습니다. 다음으로, 전극에 대한 은전선의 약 8센티미터길이를 얻을 수 있습니다. 물에 이어 에탄올로 물티슈에 와이어를 청소하십시오.청소 후 모래 종이를 사용하여 한쪽 끝에서 1센티미터 길이의 표면을 부드럽게 합니다. 매끄러운 끝이있는이 와이어는 전기 화학적으로 코팅 될 준비가되어 있습니다. 코팅을 위한 DC 전원 공급 장치에 연결된 다른 쪽 끝으로 염화 칼륨 용액에 매끄러운 끝을 넣습니다.코팅하면 전극을 분리하고 물로 청소하십시오. 건조 한 후, 가능한 한 깊이 마이크로 모세관 팁을 관통 할 수있는 길이를 결정합니다. 전극을 코팅되지 않은 쪽에서 적절한 길이로 자른다.이제 아가로즈와 함께 소금 용액을 준비하십시오. 물을 포함하는 플라스크에서 염화칼륨을 용해시키고 자기 교반기를 사용하여 혼합을 돕습니다. 교반기를 제거 한 후 플라스크에 아가로즈를 추가합니다.플라스크를 전자레인지에 넣고 가열하여 약 섭씨 100도에서 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈가 완전히 용해되어 있는지 시각적으로 확인하려면 꺼내십시오. 아가로즈가 용해되면 기포를 피하기 위해 천천히 마이크로 모세관에 파이펫 10 마이크로 리터가 용해됩니다.특히 높은 천 농도에서 한천 염액을 마이크로 모세관 팁에 조심스럽게 파이펫하는 것이 중요합니다. 제대로 하지 않으면 기포는 팁에서 쉽게 생성되고 전기 흐름을 차단합니다. 파이펫에서 팁을 제거 한 후 전극을 밀어 넣습니다.전극이 소금 용액에 침투하도록 합니다. 전극이 실온에 있을 때 기준 전극을 증폭기로 연결합니다. 1밀리리터의 완충제로 플라스틱 용기로 낮출 수 있도록 기준 전극을 지원합니다.다음으로 소금 다리 전극을 용액에 담급넣습니다. 전압을 적용하고 계속하기 전에 전류 응답이 있는지 확인합니다. 테스트가 성공하면 전극을 분리합니다.필요한 경우 염화물 3개의 대구물에 담그어 소금 다리 전극을 보관하십시오. 다음으로 플라스틱 팁이 포함된 버퍼를 준비합니다. 마이크로 모세관 팁을 가지고 좁은 부분에서 2 센티미터 지점을 식별합니다.가열 와이어를 사용하여이 위치에서 튜브를 90도 구부립니다. 날카로운 칼로 구부러진 튜브를 5밀리미터 잘라냅니다. 에탄올로 절단된 부위를 청소한 다음 물을 닦습니다.진행하기 전에 축척이 있는 광 현미경을 사용하여 끝에 있는 구멍의 직경을 측정합니다. 그런 다음 파이펫을 용매 용기와 다른 버퍼 근처에 이동합니다. 파이펫 은 용매의 마이크로 리터 3 개가 팁 안팎으로 들어갑니다.다음으로 측정 팁을 버퍼 의 세 마이크로 리터로 채웁니다. 이제 염화칼륨 용액에서 소금 다리를 회수하십시오. 측정 팁을 버퍼와 함께 소금 브리지 전극에 연결합니다.염교 전극과 기준 전극을 증폭기와 연결합니다. 이 시점에서, 기준 전극을 가진 완충액에서 염교 전극을 일시 중단한다. 실험에 대한 구성의 표현은 이 회로도에 있습니다.실험 중에 멤브레인은 파이펫을 포함하는 버퍼의 끝에 형성됩니다. 데이터를 수집하여 멤브레인 용량을 찾습니다. 삼각형 교대 전압 신호를 적용하여 직사각형 교대 전류 응답을 생성하여 이 작업을 수행합니다.다음으로, 제로 전류에서 전도도 및 전압을 찾습니다. 마이너스 50에서 50 밀리볼트에 이르는 전압 램프의 적용을 자동화하고 전류를 기록합니다. 선형 함수를 데이터에 맞춥시게 합니다.경사는 전도이며 x-intercept는 0 전류의 전압입니다. 완료되면 소금 다리에서 측정 팁을 제거합니다. 버퍼로 새 측정 팁을 채우고 다른 pH 값으로 조정하여 멤브레인 을 가로질러 양성자 그라데이션을 설정합니다.측정을 반복하기 위해 새로운 측정 팁과 전극으로 실험 설정을 다시 설정합니다. 다음은 pH 그라데이션이 있는 대표적인 전류 전압 기록입니다. 그리고, pH 그라데이션이 없는 경우.선은 데이터에 선형 맞춤을 나타냅니다. 다른 pH 값에 대한 x축 교차점의 변화는 Nernst 방정식에 의해 예측됩니다. 이러한 데이터는 흰색의 표준 은 염화물 전극과 검은 색의 미세 천염 교량 전극에 대한 멤브레인 전세의 변화를 나타냅니다.천소금 다리 전극은 측정 300초 동안 최대 5밀리볼트 미만의 최대 시프트로 더욱 안정되었습니다. pH 그라데이션의 함수로서 잠재적 인 변화의 이 플롯에서 두 전극은 pH 그라데이션이 증가함에 따라 현저하게 다르게 작동하는 것으로 보입니다. 양성자 회전율은 두 전극 유형에 대해 찾아서 비교할 수 있다.다음은 표준 전극에 비해 염교 전극에 의해 측정된 미토콘드리아 분리 단백질 1UCP1을 위해 결정된 양성자 회전수 수이다. 유사하게 준비된 UCP3에 대한 데이터도 있습니다. 이 속도는 천 소금 다리 전극으로 더 정확하게 보입니다.이 절차를 시도하는 동안 전극이 천염 용액에 침투하는지 확인하는 것이 중요합니다. 소금 다리도 버퍼 용액에 담그어야 합니다. 마지막으로, 천소금 용액에 기포가 포함되어 있지 않습니다.

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