재조합 막 단백질의 양성자 회전율을 분석하기 위한 Micro-agar Salt Bridge 전극

이 방법은 수송체 및 채널과 같은 막 단백질을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기질 회전율 손실, 단백질 활성 및 특이성 비교, 다양한 생리학적 및 병리학적 상태에 대한 정보. 이 기술의 주요 장점은 잠재적인 이동 변동과 염화물이 없는 완충액 조건을 최소화한다는 것입니다.

또한 보다 정확한 멤브레인 전위 측정으로 인해 회전율 결정의 정밀도가 크게 향상됩니다. 첫 번째 단계를 위한 요소를 수집합니다. 여기에는 두 개의 마이크로 모세관 피펫 팁, 날카로운 블레이드 및 슬라이딩 캘리퍼가 포함됩니다.

전극의 경우 은선, 모래 종이 및 3 몰 염화칼륨 용액이 있습니다. 또한 청소를 위한 에탄올과 물, DC 전원 공급 장치가 있습니다. 두 개의 마이크로 피펫 팁으로 작업하여 진행하십시오.

버퍼를 포함할 팁부터 시작합니다. 두 번째 팁을 첫 번째 팁 옆에 놓습니다. 두 번째 팁을 움직여 삽입할 때 좁은 부분이 첫 번째 팁의 좁은 부분으로 최소 5mm 확장되도록 합니다.

tip을 포함하는 첫 번째 버퍼가 연결될 위치를 표시합니다. 그런 다음 캘리퍼를 사용하여 마이크로 한천 염교 전극의 길이를 측정합니다. 칼날을 사용하여 팁을 적절한 길이로 자릅니다.

절단면을 에탄올과 물로 청소하십시오. 다음으로, 전극에 대해 약 8cm의 은선 길이를 얻습니다. 물티슈의 와이어를 에탄올과 물로 청소합니다.

청소 후 사포를 사용하여 한쪽 끝에서 1cm 길이의 표면을 매끄럽게 만듭니다. 끝이 매끄러워진 이 와이어는 전기화학적으로 코팅할 준비가 되어 있습니다. 매끄럽게 처리된 끝을 염화칼륨 용액에 넣고 다른 쪽 끝을 코팅용 DC 전원 공급 장치에 연결합니다.

코팅되면 전극을 분리하고 물로 청소하십시오. 건조 후 마이크로 모세관 끝을 가능한 한 깊숙이 침투 할 수있는 길이를 결정하십시오. 코팅되지 않은 면의 전극을 적절한 길이로 자릅니다.

이제 아가로스로 소금 용액을 준비하십시오. 물이 들어있는 플라스크에 염화칼륨을 녹이고 자기 교반기를 사용하여 혼합을 돕습니다. 교반기를 제거한 후 플라스크에 아가로스를 첨가합니다.

플라스크를 전자 레인지에 넣고 가열하여 약 섭씨 100도에서 아가로 로즈를 녹입니다. 꺼내서 아가로스가 완전히 녹았는지 육안으로 확인합니다. 아가로스가 용해되면 기포를 피하기 위해 10마이크로리터를 마이크로 모세관에 천천히 피펫합니다.

특히 높은 한천 농도에서 한천 염 용액을 마이크로 모세관 팁에 조심스럽게 피펫으로 넣는 것이 중요합니다. 제대로 수행하지 않으면 팁에서 기포가 쉽게 생성되어 전기 흐름을 차단합니다. 피펫에서 팁을 제거한 후 전극을 밀어 넣습니다.

전극이 염 용액을 관통하는지 확인하십시오. 전극이 실온에 있을 때 기준 전극을 증폭기에 꽂습니다. 기준 전극을 지지하여 1ml의 버퍼가 있는 플라스틱 용기로 내릴 수 있습니다.

다음으로 염교 전극을 용액에 담그십시오. 전압을 인가하고 계속하기 전에 전류 응답이 있는지 확인하십시오. 테스트가 성공하면 전극을 분리하십시오.

필요한 경우 염교 전극을 3몰 염화칼륨 용액에 담가 보관하십시오. 다음으로 플라스틱 팁이 들어있는 버퍼를 준비합니다. 마이크로 모세관 팁을 잡고 좁은 부분에서 2cm 떨어진 지점을 식별합니다.

전열선을 사용하여 이 위치에서 튜브를 90도 구부립니다. 날카로운 칼로 튜브를 구부러진 곳에서 5mm 자릅니다. 에탄올로 자른 부분을 청소한 다음 물로 청소하십시오.

진행하기 전에 스케일이 있는 광학 현미경을 사용하여 끝에 있는 구멍의 직경을 측정합니다. 다음으로, 피펫을 용매 용기와 다른 완충액 용기 근처로 옮깁니다. 3 마이크로 리터의 용매를 팁 안팎으로 피펫으로 만듭니다.

다음으로, 측정 팁에 3마이크로리터의 버퍼를 채웁니다. 이제 염화칼륨 용액에서 소금 다리를 회수합니다. 버퍼가 있는 측정 팁을 소금 다리 전극에 꽂습니다.

소금 다리 전극과 기준 전극을 amp리퍼. 이 시점에서 염교 전극을 기준 전극과 함께 완충 용액에 현탁합니다. 실험에 대한 구성의 표현은 이 회로도에 있습니다.

실험하는 동안 멤브레인은 피펫을 포함하는 버퍼의 끝에 형성됩니다. 멤브레인 용량을 찾기 위해 데이터를 수집합니다. 삼각형 교류 전압 신호를 적용하여 직사각형 교류 응답을 생성하면 됩니다.

다음으로 제로 전류에서 컨덕턴스와 전압을 찾으십시오. 마이너스 50에서 50밀리볼트 범위의 전압 램프의 적용을 자동화하고 전류를 기록합니다. 선형 함수를 데이터에 피팅합니다.

기울기는 컨덕턴스이고 x-절편은 제로 전류에서의 전압입니다. 완료되면 소금교에서 측정 팁을 제거합니다. 새 측정 팁에 버퍼를 채우고 다른 pH 값으로 조정하여 멤브레인 전체에 양성자 구배를 설정합니다.

측정을 반복하기 위해 새로운 측정 팁과 전극으로 실험 설정을 다시 설정합니다. 다음은 pH 구배가 있는 경우의 대표적인 전류 전압 기록입니다. 그리고 pH 구배가 없는 경우.

선은 데이터에 대한 선형 피팅을 나타냅니다. 서로 다른 pH 값에 대한 x축 교차점의 이동은 Nernst 방정식에 의해 예측됩니다. 이 데이터는 표준 염화은 전극은 흰색으로, 마이크로 한천 염교 전극은 검은 색으로 된 멤브레인 전위의 변화를 나타냅니다.

한천 염교 전극은 300초 동안 최대 5밀리볼트 미만의 이동으로 더 안정적이었습니다. pH 구배의 함수로 전위 이동에 대한 이 그래프에서 두 전극은 pH 구배가 증가함에 따라 크게 다르게 동작하는 것으로 나타났습니다. 두 전극 유형에 대해 양성자 회전율을 찾아 비교할 수 있습니다.

다음은 표준 전극과 비교하여 소금 다리 전극으로 측정한 미토콘드리아 분리 단백질 1 UCP1에 대해 결정된 양성자 회전율 수치입니다. 유사하게 준비된 UCP3에 대한 데이터도 있습니다. 속도는 한천 염교 전극에서 더 정확한 것 같습니다.

이 절차를 시도하는 동안 전극이 한천 염 용액을 관통하는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 소금 다리도 완충 용액에 담가야 합니다. 마지막으로 한천 염 용액에 기포가 없는지 확인하십시오.