생체 외에서 교양된 폐 포 상피 세포에서 할로겐화 가스의 농도 제어 하는 방법
2018년 10월 23일
우리 소설을 테스트 하 고 상피 폐 상해에 관련 된 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 향상 sevoflurane 또는 isoflurane에서 생체 외에서 의 농도 정확 하 고 제어를 도달 하도록 특별히 설계 된 쉬운 프로토콜 설명 급성 호흡 곤란 증후군에 대 한 요법입니다.
이 방법은 폐 상해의 연구 필드에 있는 중요한 질문에 대답하고 급성 호흡 곤란 증후군을 위한 잠재적인 새로운 치료로 할로겐화한 외래를 시험하는 것과 같은 복구를 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포를 배양하고 정확하고 통제 된 농도에 도달하기 위해 할로겐화 된 제제에 노출하는 매우 간단한 방법에 의존한다는 것입니다. 밀폐 챔버를 구성하려면 6.5 리터의 용량의 밀폐 폴리 프로필렌 상자를 사용합니다.
상자의 측면 벽의 하단에 2.5 센티미터 직경 구멍을 드릴. 그런 다음 가스 공기 혼합물 입력 파이프 역할을 하는 녹색 마크가 있는 골판지 튜브를 삽입합니다. 그리고 실리콘으로 밀봉.
다음으로, 반대쪽 측면 벽의 상단에 2.5 센티미터 직경으로 두 번째 구멍을 드릴. 빨간색 마크가 있는 다른 골판지 튜브를 삽입하고 가스 공기 혼합물 출력 파이프역할을 하는 숯 필터와 연결합니다. 그런 다음 실리콘으로 밀봉하십시오.
그런 다음 벽의 중앙에 직경 4mm로 단단한 구멍을 뚫습니다. 회전하는 남성 미끼 잠금 장치로 매니폴드에 연결된 짧은 주입 튜브를 삽입합니다. 가스 분석기에 연결하고 실리콘으로 밀봉합니다.
그런 다음 밀폐 챔버 내부에 디지털 온도계를 배치합니다. 실험실 추출기 후드 아래에서 마취 기계 회로를 사용자 지정하여 이산화탄소로 아산화질소 가스 라인을 전환합니다. 가열된 가습기를 마취기계와 밀폐챔버 사이의 파이프에 삽입하여 가스 흐름 혼합물을 섭씨 약 37도로 데워보겠습니다.
녹색 표시 골판지 튜브와 밀폐 챔버를 사용자 정의 마취 기계 회로에 연결합니다. 다음으로, 37°C로 설정된 핫 플레이트에 밀폐 챔버를 놓습니다. 인간 폐포 상피 세포를 포함하는 6개의 우물 판을 밀폐 챔버에 넣고 뚜껑을 밀봉합니다.
가스 유량을 조절하여 CO2의 5%를 빠르게 얻습니다. 그런 다음 할로겐화 제 증발기와 원하는 백분율을 조정합니다. 목표 값이 달성되면 신선한 가스 유속속도를 분당 1리터로 줄입니다.
밀폐 챔버는 실험에 필요한 한 이 가스 유량으로 유지될 수 있다. 매체에서 세보플루란과 이소플루란 농도의 과정은 시간이 지남에 따라 유사했다. 할로겐화제의 농도가 설정된 직후, 농도는 첫 번째 시간 동안 상승했다.
그런 다음 할로겐화 제의 투여가 중단될 때까지 고원에 도달했습니다. 투여 중단 후, 농도는 1 시간 이내에 감소. 여기에 가스 분석기에 의해 측정된 밀폐 챔버에서 시간이 지남에 따라 할로겐화 제의 분획이 도시되어 있습니다.
이 절차는 상대적으로 저렴하 고 연구원 전에 밀 폐 챔버를 조작 한 적이 있는 경우에 채택 하기 매우 쉽습니다. 이 절차에 따라, 단백질 및 RNA 정량화, 면역 형광, 단백질 투과성 및 무료 수송의 측정과 같은 다른 방법은 상피 폐 손상 및 그 해상도 동안 할로겐화 제의 특정 효과에 대한 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 ARDS 도중 상피 폐 상해에 관련되었던 기계장치를 추가 공부하고 새로운 치료를 시험하기 위하여 급성 호흡 곤란 증후군의 필드에 있는 연구를 위한 도로를 포장할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 in vitro에서 세보플루란(sevoflurane) 또는 이소플루란(isoflurane)의 정밀한 농도를 구현하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 폐 상피 세포 손상 기전에 대한 이해를 높이고 급성 호흡곤란 증후군에 대한 새로운 치료법을 평가하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 호흡기내과
- 약리학
배경
- 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 새로운 치료적 접근 방식이 필요한 위중한 상태입니다.
- 세보플루란(sevoflurane) 및 이소플루란(isoflurane)과 같은 할로겐화 제제는 폐 손상 치료에 잠재적인 가능성이 있습니다.
- 폐 손상 기전을 이해하는 것은 효과적인 치료법을 개발하는 데 필수적입니다.
- 본 연구는 실험실 환경에서 이러한 제제에 대한 노출을 조절하는 방법에 초점을 맞춥니다.
연구 목적
- 폐 손상 및 회복을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발한다.
- ARDS의 잠재적 치료법으로서 할로겐화 보조제의 효능을 테스트한다.
- 상피성 폐 손상 기전에 대한 이해를 높인다.
사용된 방법
- 밀폐 폴리프로필렌 상자를 이용한 기밀 챔버 구축.
- 가스 혼합물 주입을 위한 구멍 천공 및 실리콘 밀봉.
- 할로겐화 제제에 세포를 노출시키기 위한 세포 배양 기술.
- 세보플루란 또는 이소플루란의 제어된 농도 달성.
주요 결과
- 이 방법은 할로겐화 제제의 농도를 정밀하게 제어할 수 있게 합니다.
- 체외(in vitro)에서 폐 손상 기전을 연구하는 것을 용이하게 합니다.
- ARDS에 대한 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
- 해당 프로토콜의 간편함과 효과성을 입증합니다.
결론
- 개발된 프로토콜은 폐 손상 연구를 위한 가치 있는 도구입니다.
- 이는 ARDS의 새로운 치료 옵션을 탐색하기 위한 길을 열어줍니다.
- 연구 결과를 검증하고 임상 적용 가능성을 탐색하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 방법은 ARDS의 상피성 폐 손상 메커니즘을 연구하기 위해 할로겐화 가스 농도를 시험관 내에서 정밀하게 제어할 수 있게 합니다. 이는 폐포 손상 및 염증을 표적으로 하는 새로운 치료제를 평가하기 위한 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 접근 방식은 폐 질환 치료제 개발 단계에서 초기 표적 검증 및 메커니즘의 위험 요소를 제거하는 데 기여합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 폐 손상 경로에서 할로겐화 제제와 관련된 치료 가설의 조사를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 마취제에 대한 상피 세포 반응의 기능적 타겟 검증을 위한 표준화된 시스템을 제공합니다.
- 예측적 가치: 배양액 내에서 정량화되고 시간 분해능을 가진 농도 데이터를 제공함으로써 예측 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 제어된 가스 노출을 통해 하위 화합물 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 재현성: sevoflurane 및 isoflurane의 배지 농도를 일정하게 유지하여 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 가능하게 합니다.
- 확장성: 멀티웰 플레이트 형식 및 반복 실험에 적합한 단순하고 밀폐된 챔버 설계를 사용합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련성: ARDS 병태생리와 관련된 생리적 조건 하에서 폐포 상피 손상 모델을 구현합니다.
- 중개 연구의 연속성: 생물학적 효과와 연계된 노출 임계값을 정의함으로써 in vitro 연구 결과와 전임상 검증 사이의 가교 역할을 합니다.
- 리스크 조정 기반의 진행: 안전성 및 효능 스크리닝을 위한 농도-효과 관계를 설정함으로써 go/no-go 결정에 필요한 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
본 방법은 타겟 결합부터 리드 최적화에 이르는 발견 연속체에 부합하며, 특히 염증 및 손상 경로를 표적으로 하는 폐 치료제 개발에 유용합니다.
- 발견 생물학: 상피 손상 및 회복 기전의 조절제로서 할로겐화 제제의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 시간에 따라 액상 내에서 안정적이고 측정 가능한 가스 농도를 유지함으로써 분석법의 표준화를 가능하게 합니다.
- 분석: 가스 질량 분석법을 통해 정량적인 종속 변수 측정값(예: 배지 농도 mg/L)을 생성하여 조건 간 비교를 수행합니다.
- 중개 연구: 노출 역학과 생물학적 결과 사이의 연관성을 밝혀, 바이오마커에 기반한 전임상 연속성을 지원합니다.
- 기업 내 재사용: 여러 프로젝트에 걸쳐 마취제 또는 가스 기반 치료제의 반복 테스트를 위한 재사용 가능한 저비용 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 제어 가능하고 재현 가능한 가스 노출 조건을 제공함으로써 폐 손상 모델의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 밀폐형 챔버 설계와 실시간 가스 모니터링을 통해 표준화 및 재현성을 제공합니다.
- 전략적 가치: 비용이 많이 드는 in vivo 연구 이전에 할로겐화 보조제의 위험 요소를 조기에 제거함으로써 자본 효율성을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 정의된 노출-반응 프로파일링을 통해 폐 질환 약물 후보 물질의 위험 조정 우선순위 결정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 기-액 계면(air-liquid interface) 세포 배양 및 가스 처리 시스템에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 배지 농도 검증을 위한 마취기 회로, 가스 분석기 및 질량 분석기 사용이 가능해야 합니다.
- 노출 프로토콜, 밀봉 기술 및 환경 제어(37°C, 5% CO2)에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 세포 유형, 플레이트 형식, 그리고 sevoflurane 및 isoflurane 이외의 할로겐화 제제에 대한 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 챔버 부피의 제약과 배지 내 평형 농도에 도달하기까지의 평형 시간(~1 hour)이 있습니다.
