Name: N 맨끝 도메인의 Ryanodine 수용 체 이용한 배 xylostella 에서 결정 구조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 Plutella xylostella의 ryanodine 수용체 N-말단 도메인 결정 구조를 X-선 결정학으로 분석하는 방법입니다. 이 연구는 살충제 내성 메커니즘 규명과 종특이적 살충제 개발에 중요한 템플릿을 제공합니다.

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이 연구에 의해 제공 된에 대 한 자금: 국가 주요 연구 개발 프로그램의 (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31320103922, 31230061)와 중국의 프로젝트의 국가 기초 연구 (973) 프로그램 중국 (2015CB856500, 2015CB856504)입니다. 우리는 beamline BL17U1 상해 싱크 로트 론 방사선 시설 (SSRF)에서 직원에 게 감사입니다.

1. 유전자 복제, 단백질 표정과 정화
<ol><li>PCR 증폭 관심사의 단백질에 해당 하는 DNA (DBM RyR, 은행의 잔류물 1-205 없음 acc.. AFW97408) 및 결 찰 독립적인 복제 (LIC)25애완 동물-28a-HMT 벡터에 클론. 이 벡터 포함 히스티딘 태그, MBP 태그와 N-말단에 TEV protease 분열 사이트15.
	<ol>
<li>LIC 호환 5' 확장명을 가진 대상 유전자의 증폭에 대 한 디자인 LIC 뇌관: LIC 뇌관을 전달: 5 ' 3' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 역방향 LIC 뇌관: 5 ' 3' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC</li>
		<li>결합 반응 구성 요소 (50 μ): DNA 템플릿 (100 ng/μ), 앞으로 뇌관 (10 μ M), 역방향 뇌관 (10 μ M), DNA 중 합 효소 (코), 10 x 반응의 5 μ의 0.5 μ의 1 μ의 1 μ 1 μ 버퍼, dNTP (25 mM)의 1 μ RNase의 40.5 μ 무료 ddH2o.<ol>
<li>PCR 기계에 반응 혼합물을 놓고 다음 프로그램을 실행 합니다.</li>
			<li>3 분 동안 95 ° C에서 품 어와 다음의 30 주기 실행 (95 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 15에 대 한 s, 1 분에 72 ° C). 5 분 동안 72 ° C에서 품 어와 다음 4 ° c.에서 개최</li>
			<li>2 %agarose 젤에 전체 반응 혼합 (50 μ)을 실행 하 고 젤 추출 키트와 함께 추출. 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>결 찰 독립적인 복제 (LIC)<ol>
<li>SspI 소화 (60 μ)를 수행: 벡터 DNA의 20 μ (50 ng/μ), 반응 버퍼, SspI, 4 μ 그리고 ddH2오 품 전체 반응 실행 3 h. 위해 37 ° C에서 30 μ x 10의 6 μ 1 %agarose 젤에 혼합 하 고 젤 추출 키트와 함께 추출. 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.</li>
			<li>벡터의 T4 DNA 중 합 효소 처리를 수행 하 고 DNA를 삽입 합니다. 다음 결합: 벡터 또는 삽입 DNA의 5 μ (50 ng/μ), 10 x T4 DNA 중 합 효소 버퍼, 벡터 또는 삽입 dna, DTT (100 m m), 0.4 μ의 T4 DNA 중 합 효소 (LIC 한정)의 1 μ dCTP (25 m m)의 1 μ에 대 한 dGTP (25 m m)의 1 μ의 2 μ 그리고 20 분 동안 75 ° C에서 40 분 열 비활성화 효소에 대 한 실 온에서 ddH2오 품 반응의 9.6 μ. 참고: LIC 벡터 및 삽입 DNA는 별도 반응에서 처리 되어야 합니다.</li>
			<li>LIC 반응 어 닐 링을 수행 합니다. 다음 결합: T4 치료 삽입 DNA, LIC T4 치료의 2 μ의 2 μ 벡터 DNA. 10 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>변환 BL21 (DE3) E. 콜라 이 재조합 플라스 미드와 셀.<ol>
<li>유능한 세포 (마이크로 원심 튜브에서 50 μ) 얼음에 녹여</li>
		<li>추가 약 1 μ (50 기) 튜브에 플라스 미드의. 부드럽게 터치 튜브 2-3 번 하 여 세포와 DNA를 혼합. 20 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>다시 2 분 추가 1 mL 튜브에 실내 온도 파운드 미디어에 대 한 얼음에 튜브 40 s. 위 42 ° C에서 충격을 열.</li>
		<li>장소는 250 rpm 흔드는 37 ° C에서 45 분에 혼합 튜브 150-200 µ L 선택 접시에 혼합물의 확산. 접시를 반전 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일 식민지와 문화 100 mL 2YT 매체 하룻밤 37 ° C에서 50 µ g/mL 대를 포함 하는 셀 선택 합니다. 다음날 아침, 접종 1 L 2YT 매체의 숙박 문화 10 mL와 함께 50 µ g/mL 대를 포함 하 고 OD600 ~ 0.6에 도달할 때까지 250 rpm에서 37 ° C 흔드는 인큐베이터에서 품 어. 그 후 0.4 m m의 최종 농도에 IPTG로 문화를 유도 하 고 또 다른 5 h 30 ° c.에 대 한 성장</li>
	<li>4 ° C에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수확, 셀을 수집 하 고 모든 10 g 셀 40 mL 세포의 용 해 버퍼 (10 mM HEPES pH 7.4, 250 m m KCl, 10mm β-mercaptoethanol, 25 μ g/mL lysozyme, 25 μ g/mL DNase resuspend 1 밀리미터 PMSF).<ol>
<li>1 8 분 65% 진폭에서 쥡니다에 의해 방해 s에서 및 1 s. 4 ° c.에 30 분 동안 40000 x g 에서 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거 0.22 μ m 필터를 통해 전달 하 여는 상쾌한 필터 및 샘플 루프에 그것을 로드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>융해 단백질 정화, 태그를 쪼개 고 다시 대상 단백질 정화.<ol>
<li>Ni NTA 열을 사용 하 여 융해 단백질 정화 (바인딩 버퍼: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 m m KCl; 차입 버퍼: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 m KCl, 500mm 이미 m) 20-250 m m 이미의 선형 그라데이션으로 정화 시스템에 의해 정화.</li>
		<li>TEV protease와 eluted 대상 단백질을 쪼개 다 (1시 50분 비율) 4 ° c.에서 하룻밤</li>
		<li>Amylose 수 지 열을 사용 하 여 분열 반응 혼합물을 정화 (바인딩 버퍼: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 m m KCl; 차입 버퍼: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 m m KCl, 10mm 糖)과 Ni NTA 열 태그 및 TEV protease 제거 하. 대상 단백질이 두 열 흐름을 통해 일부 있을 것입니다.</li>
		<li>투 석 버퍼 (10 mM Tris HCl 산도 8.8, 50 m KCl, 10mm β-mercaptoethanol을 소금 농도 줄이기 위해 m에 대 한 샘플 dialyze. 음이온 교환 칼럼에 샘플을 정화 (바인딩 버퍼: 10 mM Tris HCl pH 8.8, 10 m m β-mercaptoethanol; 차입 버퍼: 10 mM Tris HCl pH 8.8, 1 M KCl, 10mm β-mercaptoethanol) 차입 버퍼에 20-500 m m KCl의 선형 그라데이션에 의해.</li>
		<li>정화 과정에서 마지막 단계로, 원심 집중 (10 kDa MWCO) 장치를 사용 하 여 단백질을 집중 하 고는 동질성을 확인 하는 Superdex 200 26/600 젤 여과 열을 삽입 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 %SDS 페이지에 그것을 실행 하 여 단백질의 순도 확인 합니다. 참고: 모든 열 바인딩 유량 2 mL/min, 및 4 mL/min 1 mL/min에서 젤 여과 제외에 차입 유량 단백질 정화 시스템에서 실행 됩니다.</li>
</ol>2. 단백질 준비 및 결정 화
<ol><li>순화 된 단백질 샘플 10 mg/ml-80 ° c.에 저장 하기 전에 원심 집중 (10 kDa MWCO) 및 결정 화 버퍼를 버퍼 exchange를 사용 하 여 집중</li>
	<li>결정 화 심사 수행 (1:1 비율, 200 단백질 및 200의 nL 저수지 버퍼의 nL) 기에 의해 드롭 증기 확산 방법 96 잘 형태로 로봇 시스템을 처리 하는 자동화 된 액체를 사용 하 여 여러 결정 화 장비 295 K에서. 참고: 우리 분자 크기와 햄튼 연구에서 키트를 사용 하 고 Gryphon 자동 액체 처리 시스템.</li>
	<li>증발을 방지 하기 위해 활성화 단백질 드롭 저수지 버퍼의 평형 96 잘 결정 화 접시를 봉인. 다음 18 ° c.에 크리스탈 인큐베이터에 접시를 유지</li>
	<li>96 잘 접시 크리스탈 형성 및 성장 모니터링 하 가벼운 현미경을 사용 하 여 주기적으로 확인 합니다.</li>
	<li>소금 결정에서 단백질 결정을 차별화, 단백질 염료를 사용 합니다. 대상 드롭 염료의 1 µ L를 추가 합니다. 약 1 시간 기다립니다 고 현미경 관찰 합니다. 단백질 결정 블루 돌 것 이다.</li>
	<li>긍정적인 결정 화 조건 (황산 암모늄 1.5 M, 0.1 m M Tris pH 8.0)를 사용 하 여 교수형을 사용 하 여 결정을 더욱 최적화 증기 확산 방법 24-잘 접시에 놓습니다.<ol>
<li>PH 7.0에서 0.5 pH 단위 간격 8.5 모든 단계를 최적화 합니다. 모든 단계 0.1 M 간격 1.2 M에서 1.7 m 황산 암모늄의 농도 최적화 합니다. (우리의 경우 대형 접시 모양의 크리스탈 생산 최고의 조건이 0.1 m M HEPES pH 7.0 및 1.6 M 황산 암모늄)</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 크리스탈 장착, x-선 데이터 수집 및 구조 결정
<ol><li>cryoloop에서 결정과 플래시-멋진 곳을 알아내는-막는으로 20% 글리세롤을 포함 된 저수지 솔루션을 사용 하 여 액체 질소에 탑재 합니다. 저장과 수송에 대 한 unipuck에 크리스탈을 놓습니다.</li>
	<li>전 단백질 결정 리가 사내 x 선 diffractor를 사용 하 여 화면. (우리의 데이터 집합 상해 싱크 로트 론 방사선 시설에서 BL17U1에서 수집 된) 싱크 로트 론 시설에서 데이터 컬렉션에 대 한 높은 해상도 함께 최고의 것 들을 선택 하십시오.<ol>
<li>BluIce26 beamline 제어 소프트웨어를 사용 하 여 탑재 하 고 자동 또는 수동 중심 기능에 의해 결정 가운데. 시작 각도, 노출 시간, 검출기 거리, 프레임 너비와 숫자를 포함 하 여 데이터 수집 전략을 결정 하기 위해 테스트 노출 수행 합니다.</li>
		<li>따라서 데이터 집합을 수집 (우리가 수집 1 s 노출 시간, 1 ° 프레임 폭 350 mm의 발견자 거리와 180 프레임).</li>
	</ol>
</li>
	<li>색인, 통합 및 HKL2000 스위트27을 사용 하 여 데이터 집합을 확장. 먼저 찾을 회절 반점, 피크 검색 기능을 수행 하 고 관광 명소 다음 색인 오른쪽 공간 그룹을 선택 합니다. 피크 통합 후 적절 한 오류 모델과 데이터 집합을 확장 하 고 출력.sca 파일을 저장 합니다.</li>
	<li>분자 교체 피닉스29페이저28 을 사용 하 여 위상 문제를 해결.<ol>
<li>Xtriage30여 비대칭 단위에서 단백질 분자의 가능한 복사본 수를 계산 합니다.</li>
		<li>문학 또는 Phyre231 같은 구조 예측 서버에 의해 생성 된 모델에서 알려진된 구조를 사용 하 여 대상 단백질으로 정체성과 구조적 유사성을 높은 시퀀스와 적절 한 구조 서식 파일에 대 한 보고 (토끼 RyR1 NTD 사용으로 검색 모델, PDB ID 2XOA).</li>
		<li>페이저는 해결책을 찾기 위해 회절 데이터 파일, 서식 파일 구조 파일 및 단백질 시퀀스 파일을 사용 하 여 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>빌드32 피닉스29 페이저에서 출력 파일에서 대상 단백질 시퀀스 파일을 사용 하 여 초기 모델을 생성 하기 위해 수행 합니다.</li>
	<li>수동으로 쿳33 를 사용 하 여 수정 된 실험적인 전자 밀도에 구조를 구축 하 고 반복 되는 주기에서 phenix.refine34 를 사용 하 여 수정.</li>
	<li>피닉스18에서 유효성 검사 도구를 사용 하 여 최종 모델을 확인 합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이 문서에서 우리는 recombinantly 익스프레스, 정화, 구체화 및 DBM RyR NTD의 구조를 결정 하는 절차를 설명 합니다. 결정 화에 대 한 중요 한 요구 사항이 높은 용 해도, 순도와 균질 단백질을 얻을 것입니다. 우리의 프로토콜에서 우리는 hexahistidine 태그와 MBP, 둘 다 더 높은 배 순도를 정화에 대 한 활용 될 수 포함 되어 애완 동물-28a-HMT 벡터를 사용 하기로 결정 했다. 또한,는 MBP 태그 에이즈 대상 단백질의 용 해도에. 우리는 매우 순수 하 고 결정 화를 위해 적당 한 단백질이 나왔고 5 연속 단계에 의해 단백질 정화. 결정 화 심사 자동된 액체 처리 시스템을 사용 하 여 수행 되었다. 수동 드롭 설정 하 여 전통적인 심사에 비해, 자동화 시스템 매우 작은 양의 샘플을 사용 하 여, 시간 및 에너지를 절약 한다. 그것은 또한 액체 처리의 정확도 때문에 재현성을 향상 시킵니다. 결정 했다 diffracted 자체 심사 및 데이터 수집에 대 한 싱크 로트 론에서 높은 강도 가진 x...

Ryanodine 수용 체 (RyRs)은 근육 세포에 sarcoplasmic 그물 (SR) 세포 막에 걸쳐 캘리포니아2 + 이온의 투과 중재 하는 특정 이온 채널입니다. 따라서, 그들은 흥분 수축 연결 과정에서에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 기능 형태의 RyR의 분자 질량을 가진 호모 tetramer로 조립 > ~ 5000 아미노산 잔류물의 구성 하는 각 소 단위와 2 MDa. 포유류에서 3 개의 isoforms는: RyR1 골격 근육 형, RyR2-심장 근육 유형 및 RyR3-다른 조직1편 표현.
곤충에는 근육과 신경 조직2에서 표현 RyR의 한 유형이 있다.입니다. 곤충 RyR 비슷합니다 더 약 47%의 시퀀스 id 가진 포유류 RyR23. 타겟팅 RyR의 나비목과 딱정벌레목 Diamide 살충제를 개발 하 고 바이엘 (flubendiamide), 듀 폰 (chlorantraniliprole) 및 Syngenta (cyantraniliprole) 같은 주요 기업에 의해 판매 되었습니다. 비교적 최근 출시 이후, diamide 살충제 살충제의 급성장 클래스 중 하나가 되고있다. 현재, 매년 이러한 세 가지 살충제의 판매는 2009 (Agranova) 이후 50% 이상의 성장 율을 가진 2 십억 미국 달러를 넘어 있다.
최근 연구 결과 이러한 살충제4,,56,,78의 사용의 몇 세대 후에 곤충 저항 개발을 보고 있다. 저항 막 횡단 영역에서의 변이 RyRs 다이아몬드 나 방 (DBM), 이용한 배 xylostella (G4946E, I4790M)와 토마토 leafminer에 해당 위치에서 Tuta absoluta (G4903E, I4746M) 표시 하는 지역 로이 지역 채널4,,89의 게이팅에 대 한 중요 한 것으로 알려져 있다 diamide 살충제 바인딩에 참여 수 있습니다. 이 지역에 광범위 한 연구에도 불구 하 고 diamide 살충제의 정확한 분자 메커니즘 애매 남아 있습니다. 또한, 그것은 하지 분명 여부 저항 돌연변이 영향을 diamides와의 상호 작용 또는 allosterically입니다.
포유류 종에서 여러 RyR 도메인의 구조와 전장 포유류 RyR1 및 RyR2의 구조 엑스레이 결정학 그리고 cryo 전자 현미경 검사 법, 각각10,11에 의해 이전 연구 보고가 12,13,14,15,,1617,18,19,20,21 . 하지만 지금까지, 아니 구조 곤충 RyR의 보고 되었습니다,이 이해는 분자의 복잡 한 수용 체 기능 뿐만 아니라 살충제 행동의 분자 메커니즘 및 살충제 저항의 개발에서 우리를 금지.
이 원고에서 선물이 다이아몬드 나 방, 파괴적인 해충 감염 십자화과 작물 전세계22에서 ryanodine 수용 체의 N 맨끝 β-개미 자리의 도메인의 구조적 특성에 대 한 일반화 된 프로토콜. 게시 된 토끼 RyR1 NTD 크리스탈 구조23,24및 곳을 알아내는-그들 구조 모델16,17,,1819, 는 구조 설계 되었다 20 , 21. 이것은 최초의 고해상도 구조 곤충 RyR 채널 게이팅 메커니즘을 밝혀 고 구조 기반 약물 설계를 사용 하 여 종의 살충제의 개발에 대 한 중요 한 서식 파일을 제공 합니다에 대 한 보고. 구조 설명, 우리 사용 엑스레이 결정학, 원자 해상도 근처에서 단백질 구조 결심을 위한 ' 골드 표준 '으로 간주 됩니다. 결정 화 과정은 예측할 수 없는 노동 집약, 비록이 단계별 프로토콜 표현, 정화 및 곤충 RyR 또는 다른 단백질의 다른 도메인의 일반적 특성 연구를 도울 것 이다.

<table><tbody><tr><td>pET-28a-HMT 벡터</td><td></td><td></td><td>이 변형된 pET 벡터는 N-말단에서 헥사히스티딘 태그, MBP 융합 단백질 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함합니다(Lobo and Van Petegem, 2009)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) 균주</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>HisTrapHP 컬럼(5mL)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>Amylose 수지 컬럼</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose 고성능 컬럼&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 농축기 (10 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 26/600 겔 여과 컬럼&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>자동 액체 처리 로봇 시스템&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>Gryphon</td><td></td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>분자 치수</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>장착 CryoLoop - 20 미크론</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>분자 치수</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Puck dewar 로딩 도구</td><td>분자 치수</td>: <td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>나노 드롭</td><td>, Thermo Scientific</td><td>NanoDrop, 단결정</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>, 분자 치수</td>: <td>MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>X-Ray 회절기</td>, <td>Rigaku</td><td>FRX,</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td>, <td>Eppendorf</td><td>Nexus GX2</td><td></td></tr>, <tr><td>플라스미드 미니 준비 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr>, <tr><td>젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>SspI 제한 엔도뉴클레아제</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>노바겐</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>과학 화학 25389940</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview</td><td>367931</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall LYNX 6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonnicator</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>단백질 정제 시스템</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta 순수</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>IzIt 결정 염료</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>전기 영동 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>셰이커 인큐베이터</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>인덱스 크리스탈 스크린</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>구조 크리스탈 스크린</td><td>분자 치수</td><td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>ProPlex 크리스탈 스크린</td><td>분자 치수</td><td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>PACT 프리미어 크리스탈 스크린</td><td>분자 치수</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus 크리스탈 스크린</td><td>분자 치수</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

n 맨끝 도메인의 ryanodine 수용 체 이용한 배 xylostella 에서 결정 구조

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

곤충 ryanodine 수용 체 (RyRs)를 대상으로 하는 강력 하 고 효율적인 살충제의 개발 농업 해충의 영역에 큰 관심의 되었습니다. 까지, 몇몇 diamide 살충제 RyRs 상용화 되었습니다 해충을 대상으로는 2 십억 미국 달러의 연간 수익을 생성 합니다. 그러나 RyR 타겟팅 살충제의 행동의 모드의 이해 구조 정보 곤충 RyR의 부족에 의해 제한 된다. 이 차례로 해충에 살충제 저항 개발의 이해를 제한합니다. 다이아몬드 나 방 (DBM) diamide 살충제에 저항을 표시를 보고도 전세계, 십자화과 작물 파괴 엄청난 해충 이다. 그러므로, DBM RyR, 특히 전통적인 diamide 바인딩 사이트에서 다른 영역을 대상으로 타겟팅 새로운 살충제를 개발 하는 실용적인 중요성의 이다. 여기, 선물이 구조적 특성 DBM에서 RyR의 N 맨끝 도메인 프로토콜. X 선 결정 구조 분자 교체는 해상도에 의해 해결 되었다 Å는 2.84의 베타-개미 자리의 접는 모티브와 측면에 서 알파 나선 보여줍니다. 이 프로토콜은 일반적으로 식, 정화와 다른 도메인 또는 단백질의 구조적 특성에 대 한 적응 될 수 있다.

정화
DBM RyR의 N 맨끝 도메인 TEV protease 분열 사이트, MBP 태그와 hexahistidine 태그 융합 단백질으로 표현 했다. 우리는 매우 순수한 단백질 결정 화 목적에 적합을 얻기 위해 5 단계 정화 전략을 따 랐 다. 처음에, 융해 단백질 Ni NTA 열 (HP HisTrap)에 의해 세포 lysate의 녹는 분수에서 순화 했다. 다음으로, TEV protease 분열 융해 단백질은 대상 하 고 hexahistidine MBP moiety amylose 수 지 열 Ni NTA 열 뒤에 의해 삭제 되었습니다. 또한, 단백질 음이온 교환 열 (Q Sepharose HP)에 의해 순화 되었다 그리고 마지막으로 젤 여과 열 (Superdex 200 26/600). 2YT 미디어를 사용 하 여 1 L 세균성 문화에서 순화 된 단백질의 최종 수익률 ~ 4...

이 문서에서는, 우리는 다이아몬드 나 방 (이용한 배 xylostella)에서 ryanodine 수용 체의 N 맨끝 도메인의 단백질 식, 정화, 결정 화 및 구조 결정의 프로토콜 설명합니다.

N 맨끝 도메인의 Ryanodine 수용 체 이용한 배 xylostella 에서 결정 구조

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

리모딘 수용체 도메인의 구조를 해결하면 단백질 기능, 살충제 작용 및 살충제 저항 발달의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해에 도움이 될 수 있습니다. 이 측정은 거의 원자 분해능에서 단백질 구조 측정을 위한 금본위제로 간주되는 구조 일러스트레이션을 위한 X선 결정학의 사용을 의미합니다. 곤충 리모딘 수용체 도메인의 이러한 고해상도 구조는 채널 게이팅의 메커니즘을 드러내며 구조 기반 약물 설계 접근법을 사용하여 종별 살충제의 개발을 위한 중요한 템플릿을 제공한다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 투쟁할 것입니다, 예비 단백질 결정학자는 생화학, 생물 물리학, 컴퓨터 과학 및 수학에 능숙해야 하기 때문에. 먼저 중합효소 연쇄 반응에 의한 관심 단백질에 대응하는 DNA를 증폭시킴으로써 시작한다. 반응의 끝에서, 2%아가로즈 젤에 반응 믹스의 전체 50 마이크로리터를 실행하고, 표준 프로토콜에 따라 젤 추출 키트로 DNA를 추출한다.다음으로, 벡터 DNA의 20마이크로리터와 10X 반응 완충제 6마이크로리터, SspI 제한 효소 4개소와 이중 증류수 30마이크로리터를 혼합하여 LIC 벡터 DNA를 선형화한다. 이 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 제조 업체의 지시에 따라 젤 추출 키트와 선형 벡터 DNA의 추출 다음, 1 % 아가로즈 젤에 전체 반응 믹스를 실행합니다.다음으로, 표준 프로토콜에 따라 선형화된 벡터 DNA및 PCR 증폭 삽입 DNA의 5마이크로리터에 별도의 T4 DNA 폴리머라제 치료를 수행한다. 실온에서 40분 동안 배양하고, 75도에서 효소 열이 20분간 비활성화됩니다. T4 처리된 삽입 DNA의 마이크로리터 2개와 실온에서 10분 동안 배양을 위해 T4 처리된 LIC 벡터 DNA의 마이크로리터 2를 결합하여 결찰 독립적 복제 어닐링 반응을 수행한다.BL21(DE3)E. Coli 세포를 재조합 플라스미드로 변환하려면 얼음 위에 유능한 세포의 50마이크로리터를 해동하고, 관에 아너드 플라스미드의 약 1 마이크로리터를 첨가한다. 튜브를 2~3회 가볍게 쓸어 세포와 DNA를 섞고 튜브를 얼음에 다시 20분 간 놓습니다.인큐베이션이 끝나면 세포를 섭씨 42도에서 40초 동안 열 충격을 받은 다음 얼음 위에서 2분 뒤로 다시 가열합니다. 다음으로, 실내 온도 LB 배지 1 밀리리터를 튜브에 넣고, 세포는 섭씨 37도에서 45분 동안 250 RPM 셰이커에 놓습니다. 흔들리는 인큐베이션의 끝에서, 플레이트 150 받는 번째 200 마이크로 리터 선택 플레이트에, 그리고 37 섭씨에서 하룻밤 플레이트를 반전.다음 날, 하룻밤 37도의 셰이커 인큐베이터에서 카나마이신으로 보충된 2-YT 배지 100밀리리터의 단일 식민지를 문화합니다. 다음 날 아침, 카나마이신으로 보충된 2-YT 배지 1리터를 접종하고, 10밀리리터의 하룻밤 문화를 보충하고, OD600 독서가 약 0.6에 도달할 때까지 37도에서 배양합니다. 이어서, IPTG를 통해 배양을 0.4 밀리머의 최종 농도로 유도하고, 섭씨 30도에서 5시간 동안 세포를 성장시한다.인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 리시스 완충제 농도의 40 밀리리터 당 박테리아의 10 그램에 펠릿을 다시 중단. 65%의 진폭으로 세포벽을 방해하고, 1초는 8분 동안 중단됩니다. 원심분리로 세포 이물질을 제거합니다.그런 다음 22 마이크로미터 필터를 사용하여 상체를 필터링하고 솔루션을 샘플 루프에 로드합니다. 융합 단백질을 정화하기 위해 샘플 루프에서 여과된 상체를 20 내지 250 밀리머 이미다졸의 선형 그라데이션을 가진 정화 시스템에 5밀리리터 니켈-니트로트리아세틱 컬럼에 주입한다. 담배 에칭 바이러스 프로테아제와 함께 eluted 대상 단백질을 cleave, 1-50 비율로, 하룻밤 4섭씨에서, 아밀로스 수지 컬럼에 분열 반응 혼합물을 정화하고, 니켈-니트로트리아제컬 컬럼, 태그 및 담배 에칭 바이러스 프로테아제를 제거한다.투석 버퍼에 대한 니켈-니트로트리아세아틱 컬럼으로부터의 흐름을 투석하여 염분 농축액을 감소시키고, 용출 완충제에서 20 내지 500밀리알륨의 선형 그라데이션에 의해 음이온 교환 컬럼의 샘플을 정화한다. 그런 다음 단백질을 원심 농축기에 농축합니다. 농축 단백질을 Superdex 200 26/600 젤 여과 컬럼에 주입하여 균질성을 확인하고 단백질의 순도를 15% SDS-PAGE로 평가합니다.결정화를 위한 단백질을 준비하기 위하여는, 원심 농축기에 밀리리터 당 10 밀리그램에 정제된 단백질 샘플을 농축하고, 80°C의 저장 전에 결정화 완충에 완충 교환을 농축한다. 결정화 스크리닝을 수행하려면 295 켈빈의 착착 낙하 증기 확산 방법을 여러 결정화 키트와 96웰 형식으로 자동 액체 처리 시스템을 사용하십시오. 낙하 설정의 끝에서, 증발을 방지하기 위해 96-잘 결정화 플레이트를 밀봉하고, 저수지 버퍼 내에서 단백질 강하의 평형을 가능하게한다.플레이트를 크리스탈 인큐베이터에 섭씨 18도에 놓습니다. 경현미경하에서 주기적으로 플레이트를 확인하여 결정 형성과 성장을 모니터링합니다. 단백질 결정을 소금 결정과 구별하려면 단백질 결정 염료 1마이크로리터를 목표 낙하에 넣고 1시간 후에 현미경으로 결정을 관찰합니다.단백질 결정은 파란색으로 나타납니다. 결정을 더욱 최적화하려면 24웰 플레이트에 양성 결정화 조건과 매달려 있는 낙하 증기 확산 방법을 사용하고, 그 다음에 는 18°C의 크리스탈 인큐베이터에서 배양합니다. 단백질 구조를 결정하기 위해 액체 질소의 플래시 냉각을 위한 가벼운 현미경 아래에 저온루프에 결정을 장착하고, 저장 및 운송을 위해 결정을 유니벅에 놓습니다.수동 센터링 기능을 사용하여 크리스탈을 장착하고 중앙에 설치하여 내부 X선 디머액터로 크리스탈을 사전 검사합니다. 그런 다음 X 선 회절 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집합니다. HKL-2000 제품군을 사용하여 데이터 집합을 인덱싱, 통합 및 확장하려면 먼저 검출기를 선택하고 데이터 집합을 로드합니다.그런 다음 피크 검색 기능을 수행하여 회절 지점을 찾습니다. 스팟을 인덱스하고, 올바른 공간 그룹을 선택하고, 최대 통합을 수행합니다. 다음으로 데이터 집합을 확장합니다.오류 모델을 조정하고 다시 배율을 조정합니다. 출력 sca 파일을 저장합니다. Phenix 소프트웨어 제품군을 사용하여 구조를 확인하려면 새 프로젝트를 만듭니다.먼저, 비대칭 단위에서 가능한 복사 수의 단백질 분자를 계산하기 위해 sca 파일로 대칭을 실행한다. 다음으로, 분자 대체에 의한 위상 문제를 해결하기 위하여, 페이서를 실행하여, 회절 데이터 파일을 이용하여, 표적 단백질과 같은 고서열 정체성 및 구조적 유사성을 가진 템플릿 구조 파일, 및 단백질 서열 파일, 해결책을 찾아내다. 페이서의 출력 파일과 대상 단백질의 서열 파일을 사용하여 Phenix에서 자동 빌드를 수행하여 초기 모델을 생성합니다.COOT를 사용하여 수정된 실험 전자 밀도로 구조를 수동으로 구축하고 반복 사이클에서 페닉스 정제를 사용하여 정제합니다. Phenix의 유효성 검사 도구를 사용하여 최종 모델의 유효성을 검사합니다. 본 대표적인 실험에서, 다이아몬드백 나방 라리오딘 수용체 단백질의 최종 단말 도메인의 정제는, 입증된 바와 같이, STS-PAGE 분석에 의해 약 21킬로톤에서 단일 대역을 산출하였다.겔 여과 컬럼으로부터의 용출 부피는 정제된 리야노딘 수용체 말단 도메인을 단량체로 확인하였다. 결정화를 위해 고품질 판모양 결정이 형성된 가장 최적의 조건은 pH 7의 1개의 어금니 헤페와 1.6개의 어금니암암모늄황산염이 존재했다. 입증된 바와 같이 소프트웨어를 활용한 회절 데이터 세트에서 단백질 구조의 결정은 잔류물 1에서 205까지 를 커버하는 다이아몬드백 나방 라야노딘 수용체 말단 도메인을 드러냈다.큰 무질서, 유연한 지역, 또는 약한 친화력을 가진 단백질은 결정화하기 어렵습니다. 이러한 시나리오에서 표면 엔트로피 감소, 루프 트런션 및 교차 연결과 같은 단백질 엔지니어링 전략은 더 나은 단백질 결정을 얻을 가능성을 증가시킬 수 있습니다. 고해상도 단백질 구조를 밝히는 것 외에도 X선 결정학은 구조 기반 살충제 설계에 도움이 될 수 있는 단백질-살충제 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

crystal-structure-n-terminal-domain-ryanodine-receptor-from-plutella

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 논문은 거의 네이티브 상태의 거대분자의 고품질 현미경 이미지를 얻는 데 사용되는 초저온 전자 현미경 검사 방법론에 대해 설명합니다. 이 방법은 거대분자의 3D 재구성을 생성하기 위해 고안된 단일 입자 접근 방식을 사용하여 추가 컴퓨터 처리에 적합한 이미지를 생성합니다.

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 매개하는 호모-테트라머 이온 채널인 리아노딘 수용체의 올리고머화는 골격근 및 심장 근육 수축에 중요합니다. 여기에서는 단백질 자가 결합을 감지하고 호모올리고머 화학량론을 결정하기 위한 상호 보완적인 in vivo 및 in vitro 방법을 제시합니다.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1)은 인간 병원균 Clostridium difficile에서 분비되는 metalloprotease 및 유망한 약물 표적입니다. 여기에서는 이 단백질의 생산 및 구조 결정에 필요한 모든 방법을 설명합니다.

생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; C. 남과 어울리지 않는</em&gt; PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

우리는 X 선 결정학에 의하여 NEMO의 IKK 결합 도메인의 구조 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 단백질 발현, 정제 및 특성화뿐만 아니라 단백질의 성공적인 결정 최적화 및 단백질의 구조 측정을 위한 전략을 포함합니다.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

이 프로토콜은 구조 수준에서 M42 아미노펩티다아제인 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 연구하기 위해 개발되었다. 단백질 정제에서 X선 데이터 처리에 이르기까지 간단한 파이프라인입니다. 결정발생, 데이터 세트 인덱싱 및 분자 교체는 연구의 경우, TmPep1050H60A H307A 변이체를 통해 강조되었다.

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

여기서 엡스타인 바 바이러스에서 내인적으로 발현된 RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 연구하는 데 사용되는 방법은 인간 B-림프구및 근육 생검 유래 위성 세포가 심투로 분화되어 설명된다.

내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

이 프로토콜은 거대분자의 CryoEM 맵에서 소분자 리간드를 모델링하는 데 사용할 수 있는 도구를 소개합니다.

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

배우세요 Plutella xylostella의 ryanodine 수용체 N-말단 도메인 결정 구조를 X-선 결정학으로 분석하는 방법입니다. 이 연구는 살충제 내성 메커니즘 규명과 종특이적 살충제 개발에 중요한 템플릿을 제공합니다.

N 맨끝 도메인의 Ryanodine 수용 체 이용한 배 xylostella 에서 결정 구조

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