Name: CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: 배우세요 CRISPR-Cas9 기반 게놈 엔지니어링으로 Jurkat 세포에서 HIV-1 프로바이러스 통합 사이트별 기자 모델을 생성하는 방법입니다. 이 기법은 바이러스 통합이 유전자 발현에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리 기술 지원 Britta Weseloh와 베티 아벨 감사합니다. 우리 또한 감사 아르네 두 제 다우와 Jana Hennesen (교류 cytometry 기술 플랫폼, 하인리히 Pette Institut) 기술 지원.

1. 게놈 엔지니어링 및 벡터 (tv) 디자인을 타겟팅에 대 한 전략을 타겟팅
참고: 유전자 공학의 첫 번째 단계는 선택 및 필요한 도구 CRISPR Cas9 중재 하는 대상에 대 한 포함 됩니다. 게놈 통합 사이트 로커 스의 선택, 타겟팅, 셀 형식의 선택 그리고 디자인의 통합에 대 한 HIV 파생 기자가이 단계를 선행 한다. 이 프로토콜은 Jurkat 대상 세포로 HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA 최소한의 취재의 대상으로 설명 합니다. CRISPR-Cas9-기반 타겟팅, 세대, 심사 및 검증을 위한 클론 선의 워크플로의 순서도 그림 1에 묘사 된다. 설명된 대상 전략 S. pyogenes Cas9를 사용 하 여 선택한 통합 사이트에서 gRNA 감독 dsDNA 나누기 생성 하 (SpCas9). 기자 제공 하는 비 오는지 대상 벡터 (tv) 소위 5'과 3' 상 동 팔 (HA)11에 의해 형벌 기자 시퀀스를 포함 하 여 동종 재결합을 통해 선택한 genomic 소재 시에 다음 타겟입니다.
<ol><li>
타겟된 로커 스, gRNA, 및 벡터 디자인 대상의 선택
	<ol>
<li>개별 과학 질문에 따라 타겟이 될 thegenomic 소재 시에 선택 합니다. 에이즈의 재발 통합 사이트의 게시 된 목록에 환자에서 다른 발견 사용 연구2,3,,45,6,7,8 로 지침 서입니다. 실리콘 추출 대상된 ()의 순서는 완전 한 유전자 또는 genomic 순서의 적어도 5 kb 원하는 genomic 소재 시 게놈 시퀀스 UCSC 게놈 브라우저 (http:// genome.edu.ucsc.edu)를 사용 하 여.</li>
		<li>선택 가이드 (gRNAs) 20의 RNAs E-선명 webtool (http://www.e-crisp.org)를 사용 하 여 선택한 genomic 소재 시의 대상에 대 한 nt.<ol>
<li>유기 체로 "호모 사피엔스 GRCh38"를 선택 합니다. 취재 단계 1.1.1에서에서 추출 원하는 genomic 소재 시 게놈 시퀀스의 입력 2000 혈압.</li>
			<li>중간 응용 프로그램 설정 (모든 팸, 어떤 5' 기본, 오프-대상 용납 불일치, 및 introns/CPG 섬 제외)를 사용 하 여 gRNA 검색을 시작 합니다. 가능한 gRNA 디자인 목록이 표시 됩니다, 특이성 그리고 효율성에 대 한 점수를 낮은 높은 순위.</li>
			<li>선호 특이성 그리고 효율성에 대 한 높은 점수를 표시 하 고 타겟이 될 원하는 genomic 소재 시에 최대한 가까이 gRNA를 선택 합니다. 참고: 원하는 genomic 소재 시에 근접 및 특정 하 고 효율적인 gRNA의 디자인 사이 타협 찾을 수 있다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>GRNA 바인딩 사이트의 고유성에 대 한 확인 NCBI 폭발 브라우저 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용 하 여 참조 게놈에 대 한 선택한 gRNA 시퀀스를 폭발.<ol>
<li>게놈으로 "인간"을 선택 합니다. 쿼리 시퀀스로 gRNA 시퀀스를 입력 합니다. "매우 비슷한 시퀀스" 선택 (megablast) 프로그램으로. GRNA 시퀀스 고유한 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 선택 다른 gRNA 단계 1.1.2.3과 폭발에서 다시.</li>
		</ol>
</li>
		<li>일단 gRNA 시퀀스를 선택 따라 5'과 3' 하 단계 1.1.1에서에서 추출한 게놈 시퀀스에서 철에 1000 bp 업스트림과 다운스트림 gRNA 시퀀스를 선택 합니다. 참고: 는 gRNAs 선택한 게놈 통합 사이트 로커 스에 일치 해야 하 고 protospacer 인접 한 모티브에 인접 한 위치 (팸; 예를 들어, SpCas9에 대 한 NGG) (그림 2a). Tv 5'과 3'가 있는 기자 시퀀스를 포함 되어 있습니다. 업스트림 및 다운스트림 gRNA 시퀀스11의 커버 1000 bp를 있다. 전체 gRNA 시퀀스는 HA에 포함 되지 해야 합니다. 최대 5 중첩 nt는 허용 (그림 2a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
GRNA 및 벡터를 타겟팅의 세대 참고: 벡터 구성표, 그림 2b참조.<ol>
<li>SpCas9와 gRNA의 표현에 대 한 벡터를 생성 하는 SpCas9와 단일 가이드 RNA (sgRNA) 표현 될 수 있다 동시에 중추로 서 pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9를 사용 합니다. 등뼈에 gRNA 시퀀스를 복제 하려면 BbsI 제한 사이트12를 사용 합니다.</li>
		<li>Tv를 생성 하려면 백본 (예:, pMK 또는 cDNA3.1)로 높은 사본 플라스 미드를 선택 합니다.<ol>
<li>첫째, 기자를 조립 (이 프로토콜에서: LTR_tdTomato_BGH PA) 깁슨 어셈블리 clong에 의해 구성 등뼈로13 복제 상업 어셈블리를 사용 하 여 키트, 그리고 5'과 3' 측면에 서는 금지 사이트 소개 (예:, 5' 3'과 PacI SmaI) 이후 제한 소화는가의 복제에 대 한.</li>
			<li>타겟이 될 셀 타입의 게놈 DNA (gDNA)에서 단계 1.1.4에서에서 선택한 HA 조각의 1000 bp를 증폭 (이 프로토콜: Jurkat 세포) 활동 교정와 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 ( 표 1 및 2 PCR 재료에 대 한 참조 및 사이클링 조건). 그런 다음, 기자 측면에 서는 각 하 (PacI에 5' 하 양 끝에 3' 양쪽에 HA SmaI)의 5'과 3' 끝에 제한 사이트 소개.</li>
			<li>순차적으로 복제 구문 백본14,15복제 제한 효소에 의해 이미 포함 하는 (단계 1.2.2.1에서에서 생성) 기자로 있다. 첫째, 5' 하에 복제 다음에 3' HA 복제 PacI 제한 사이트를 사용 하 여 SmaI 제한 사이트를 사용 하 여. 참고: Tv 백본 추가 형광 기자 있으면 원치 않는 백본 통합 cytometry에 의해 평가 될 수 있다 (3.2.2, 3.2.3 단계 참조). Tv 백본 아무 형광 기자 있으면 백본 통합 평가 해야 PCR를 사용 하 여 (단계 3.2.8 참조).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58572/58572fig1.jpg"> 그림 1: CRISPR Cas9 중재 하는 대상으로, 생성 및 다양 한 클론 기자에 대 한 워크플로 정의 통합 사이트 선. (A) 대상 벡터 생성 및 transduce 대상 벡터와 Cas9/gRNA 식 플라스 미드 Jurkat T 세포. (B) 리치 transfected 세포 72 h 게시물 transfection FACS에 의해 (C) 하자 셀 10 ~ 14 일에 대 한 성장를 대상으로 PCR에 의해 이벤트의 발생을 확인 하 고 cytometry 흐름. (D) 생성 희석 하 고 클론을 제한 하 여 단일 세포 클론 3 주 동안 성장. (E)는 PCR에 의해 올바른 대상에 대 한 클론 화면 하 고 96 잘 형식에서 cytometry 흐름. 선택 된 클론 확장 합니다. (F) 남쪽 오 점, PCR 및 시퀀싱, 및 Cas9 endonuclease 활동의 대상에서 이벤트의 분석에 의해 선택 된 클론에서 타겟팅 올바른 확인 하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58572/58572fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58572/58572fig2.jpg"> 그림 2: 전략 및 벡터를 대상으로. (한) gRNA 그리고 상 동 팔의 선택. 20 nt gRNA 선택한 게놈 대상 사이트에 동종 이며 무기는 gRNA의 다운스트림 1000 bp까지-보완 하 고 gRNA 시퀀스를 포함 하지 않아야 PAM. 상 동에 인접 한 위치. (b) gRNA/Cas9 벡터와 벡터를 타겟팅의 설계도. 5'과 3' 상 동 팔에 의해 형벌 선택한 기자 시퀀스 대상 벡터에 의하여 이루어져 있다. GRNA/Cas9 벡터 pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 백본 기반으로 합니다. (c) 동종 재결합 하 여 타겟팅의 회로도. 대상 벡터 및 guideRNA/Cas9 벡터 Jurkat 세포로 페는. Cas9 중재 게놈 대상 사이트에서 이중 가닥 휴식 (표시 *) 동종 재결합 기자 시퀀스 게놈 대상 현장으로의 통합을 용이 하 게 하 고. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58572/58572fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
2. CRISPR-Cas9-기반 Jurkat 세포의 대상으로
<ol><li>
Jurkat 세포의 transfection
	<ol>
<li>transfection, 플레이트 1.25 x 106 Jurkat T 이전 24 시간 10% (v/v) 송아지 태아 혈 청 (FCS) 및 4 m m L-글루타민 [라고도 "RPMI w.o. 항생제 (AB)"] 6 음 셀 문화 접시의 당 보충 RPMI 1640의 2.5 mL에 세포. 단일 대상 실험에 대 한 하나의 완전 한 6-잘 접시 준비 (예:, 6 우물 각각 세포 현 탁 액의 2.5 mL).</li>
		<li>다음 날, 공동 원형 tv와 pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA Jurkat 세포의 transfection 시 약 관련 된을 사용 하 여 셀 transfect.<ol>
<li>추가 원형 tv의 2 µ g와 2 µ g pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA 잘 당의 상업 RPMI 매체의 250 µ L에 감소 된 혈 청 농도 transfection (50% 감소 된 혈 청 RPMI)에 대 한 최적화 된 반응 관에 잘 혼합.</li>
			<li>튜브의 벽을 건드리지 않고 DNA/매체에 천천히 transfection 시 약의 12 µ L를 추가 하 고 소용돌이. 혼합물이 15 분 동안 품 어 및 셀의 한 잘에 dropwise 추가 하자. 37 ° C, 5% CO2에서 셀을 품 어. 참고: Transfection 반응의 준비 확장할 수 있습니다. 매체 변화는 transfection 후 필요 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
농축 transfected 셀 형광 활성화 (FACS) 정렬
	<ol>
<li>72 h 후 transfection transfected 세포 그들, 계산 수영장과 FACS에 의해 농축에 대 한 준비. 4 분 50 mL 원뿔 튜브, g 및 실 온 (RT) x 300에서 원심 분리기에 있는 세포를 수집, 셀 PBS에 한 번 씻고, 다시 원심, 1 x 10</li><li></li><li> </li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li></li><li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li><li></li><li><li></li><li></li><li> </li><li><li></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li></li><li> </li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li></li><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><ol><li><li></ol></li><li></li><li><li></li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li>
<li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498(2017).</li>
<li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li>
<li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4%2B+T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li>
<li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li>
<li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li>
<li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li>
<li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li>
<li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li>
<li>ZhangLab. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013).</li>
<li>Moser, F. Addgene. Gibson Assembly Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ ">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ </a> (2013).</li>
<li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCTop%3A+An+intuitive%2C+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+%28PLoS%29+ONE%22%5BJournal%5D)">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li>
<li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li>
<li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294(2016).</li>
<li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li>
<li>Jensen, K. T., Fløe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li>
<li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+CD4+%2B+T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li>
<li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+effects+influence+HIV+latency+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리가 선택한 proviral 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 적용 HIV 1 파생 Jurkat 기자 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다.
프로토콜의 몇 가지 포인트는 계획 단계에서 주의 필요합니다. 첫째, 타겟이 될 장소 선택 해야 신중 하 게, 일부 loci 대상에 다른 사람 보다 쉽게 될 수 있습니다 (예:, 지역 및 대상의 염색 질 상태에 따라 자체 순서). 반복 시퀀스 대상 벡터에 복제 어렵다 고 게놈 내에서 고유 자주 없습니다. 억압 적인 chromatin의 영역은 더 CRISPR-Cas9 시스템19,20대상입니다.
둘째, gRNA의 CRISPR Cas9 중재 하는 대상에 대 한 결정적 이다. 대표적인 통합 사이트와 HIV 감염에 대 한 모델을 생성 하기 위해 하나...

감염 시 호스트 게놈으로 통합 proviral DNA의 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 수명 주기에서 중요 한 단계입니다. 통합에 따라 HIV 메모리 CD4 + T 세포 같은 긴 CD4 + T 세포 부분 집합에서 대기 시간을 설정 하 여 유지 합니다. 에이즈 통합 비 무작위1,2나타납니다. Recurrently 통합 proviral dna 게놈 핫스팟의 숫자 심하게만 성으로 감염 된 개인2,,34 통합 사이트의 시퀀싱을 통해 여러 연구에서 발견 되었습니다. 5,6,,78. 흥미롭게도, 이러한 통합 사이트의 일부에 같은 로커 스 재발 사이트에서 통합 클론 확장1미칠 긍정적으로 생각을 이끌어 감염 된 세포의 큰 분수에서 발견 되었다.
재발 성 통합 사이트의 중요성에 대 한 우리의 이해를 사전에 proviral 통합 사이트 선택 탐구 해야 합니다. 그러나 여러 가지 기술적인 측면 공부 에이즈 통합을 방해 하는, 선택과 결과 사이트. JLat 셀 라인 임상 관련 재발 통합 사이트9를 반영 하지 않습니다 처럼 광범위 하 게 HIV 대기 시간에 대 한 셀 문화 모델 사용. 기본 환자 파생 셀에 대 한 연구 한 한편으로, 통합 사이트 프리의 설명 연속 있지만 기능 분석에 대 한 허용 하지 않습니다. 우리의 지식을 하려면, 아무 적절 한 실험 모델은 선택 된 임상 관련 통합 사이트를 분석 하는 기능을 사용할 수 있습니다.
여기 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 새로운 모델을 생성 하는 자세한 워크플로 선물이. 여기에 설명 된 워크플로 HIV 감염, 선택한 통합 사이트에서 genomically 통합된 proviral 기자를 들고 모델 T 세포 유래 기자 셀 라인을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그들은 따라서 proviral 통합 사이트 에이즈 생물학 영향을 미칠 수 어떻게는 provirus 다른 치료 전략 (예: 대기 시간 역전 에이전트에서, inducibility)에 응답 하는 방법을 탐구 하는 새로운 도구로 봉사는. 우리의 방법은 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링, 기자는 통합에 동종 재결합 하 여 시퀀스는 대상 사이트에서 Cas9 nuclease 유도 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된의 장점을 사용 합니다. 통합에 대 한 대상 사이트는 HIV에 감염 된 개인과 Cas9 중재 게놈 엔지니어링에 대 한 적합 한 PAM 모티프의 존재에 대 한 연구에서 설명된 재발 통합 사이트에 근접에 따라 선택 됩니다.
우리의 훌륭한 결과에서 우리는 BACH2 유전자 소재 시는 BTB와 CNC 상 동 transcriptional 레 귤 레이 터 2에 대 한 코드에 집중 했다. 항 레트로 바이러스 치료에만 성으로 HIV 감염 된 개인, BACH2 통합된 HIV-1 시퀀스3,6,7,,810의 농축을 보여주는 loci 중 하나입니다. 우리는 우리 BACH2 intron 5에서에서 두 개의 특정 사이트를 대상으로 HIV 1 파생 긴 단말기 반복 (LTR), tdTomato 코딩 시퀀스, 소 성장 호르몬 (BGH) polyadenylation 신호 (PA)의 구성 된 최소한의 HIV 파생 기자를 선택 했습니다. 제시 프로토콜 Jurkat 세포 인간의 CD4 + T 세포에서 파생 된 현 탁 액 셀 라인, 하지만 다른 셀 라인을 사용할 수 있습니다, 적절 하 게 적응 하는 프로토콜 최적화 되어 있습니다. 선물이 다양 한 대상 사이트, 대상 상 동 팔, CRISPR-Cas9-중재 선택한 게놈 사이트, 생성 및 클론 라인의 선택으로 취재의 대상으로 하 고 포괄적인 벡터의 건설에 대 한 자세한 워크플로 확인 새로 생성 된, 대상 기자 셀 라인의.

<table><tbody><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>벡터 SpCas9 및 gRNA pMK</td></tr><tr><td></td><td>GeneArt</td><td></td><td>클로닝을 위한 포유류 발현 벡터</td></tr><tr><td>cDNA3.1</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>클로닝을 위한 포유류 발현 벡터</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>NEBuilder Hifi DNA 어셈블리 클로닝 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520S</td><td>타겟 벡터 생성에 사용되는 어셈블리 클로닝 키트</td></tr><tr><td>TaqPlus Precision PCR System</td><td>Agilent Technologies</td><td>600210</td><td>DNA 중합효소(교정 활성) 상동성 암의 증폭(1.2.2.2단계), 통합 부위 및 리포터 염기서열 검증(3.3.3 및 3.3.5단계), 서던 블롯에 대한 게놈 프로브 생성(3.4.1.5단계) 및 off-target 이벤트 분석에 사용됩니다. (단계 3.5.4)</td></tr><tr><td>96웰 조직 배양 플레이트(둥근 바닥)</td><td>TPP</td><td>92097</td><td>희석 도금용 조직 배양 플레이트</td></tr>, <tr><td>Phusion High-Fidelity DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530 L</td><td>DNA 중합효소, 표적 이벤트 검출(2.4.2단계) 및 서던 블롯에 대한 리포터 특이적 프로브 생성에 사용(3.4.1.4단계)</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9170</td><td>디메틸 설폭시드 PCR 첨가제</td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2) 용액</td><td>New England Biolabs</td><td>B9021S</td><td>PCR로서의 MgCl2 용액</td></tr><tr><td>첨가제 데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td>dNTP 혼합물과 PCR 반응에 대한 각 nt당 10mM</td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>5PRIME</td><td>2200400</td><td>즉시 사용 가능한 PCR 혼합물(단계 3.2.11)</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 혈액 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td>DNA 분리 및 정제 키트</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>PCR 정제 키트</td></tr><tr><td>RPMI 1640(글루타민 제외</td><td>) Lonza</td><td>BE12-167F</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>태아 혈청 남아프리카 공화국 Charge</td><td>PAN Biotech</td><td>P123002</td>세포 <td>배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Biochrom</td><td>K 0282</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 10.000 U/mL/ 10.000 &마이크로; g/mL</td><td>Biochrom</td><td>A 2212</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM 저감 혈청 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>세포 배양 배지 transfection에 최적화된 저혈청 농도</td></tr><tr><td>TransIT-Jurkat</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2125</td><td>transfection 시약</td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>주사기 구동 필터 장치, PES 멤브레인, 0,22 &마이크로; </td><td>m 멸균 여과용</td><td>Millex</td><td>SLGP033RB</td> 필터 장치</tr><tr><td>Heracell 150i 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>51026280 조직 배양 인큐베이터</td></tr><tr><td>Amershan Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN1520B</td><td>DNA 및 RNA 블로팅용 양전하를 띤 나일론 멤브레인</td></tr><tr><td>Stratalinker 1800 Stratagene</td><td></td><td>400072</td><td>UV crosslinker</td></tr><tr><td>High Prime</td><td>무작위</td><td>올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 방사성 dCTP로 DNA를 라벨링하기 위한</td>Roche <td>11585592001</td> 키트</tr><tr><td>, illustra ProbeQuant G-50 마이크로 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td>라벨링된 DNA 정제를 위한 크로마토그래피 스핀 컬럼</td></tr></tbody></table>

crispr-cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 jurkat 기자 모델을 생성 하

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 재발 사이트 및 게놈 핫스팟 호스트 세포 게놈으로 비 무작위로 proviral DNA를 통합합니다. 여기 우리가 선택한 게놈 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 소설 체 외 모델의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 이 방법으로 선택의 기자 시퀀스 수 있습니다 통합할 수는 타겟, 선택한 genomic 소재 시, 임상 관련 통합 사이트를 반영.
프로토콜, HIV 파생 기자의 디자인과 대상 사이트 및 gRNA 순서의 선택 설명 합니다. 상 동 팔 대상 벡터 생성 이며 Jurkat T 세포로 페. 기자 시퀀스 선택 된 게놈 사이트에 대상 사이트에 Cas9 중재 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된 동종 재결합 대상 이다. 단일 셀 클론 생성 되며 cytometry 및 PCR에 의해 이벤트 대상에 대 한 상영. 선택 된 클론 확장 다음, 그리고 PCR, 시퀀싱, 그리고 남부 blotting에 의해 확인 된다 정확한 타겟팅. CRISPR Cas9 중재 하는 유전자 공학의 잠재적인 대상에서 이벤트는 분석 했다.
이 프로토콜, 소설 세포 배양 시스템을 사용 하 여 임상 관련 통합 사이트에서 그 모델 HIV 감염을 생성할 수 있습니다. 단일 세포 클론의 생성 및 올바른 기자 시퀀스 통합의 확인은 시간이 걸리는, 결과 클론 라인 proviral 통합 사이트 선택 기능 분석에 강력한 도구입니다.

대표적인 실험에서 LTR, tdTomato 코딩 순서, 및17의 BACH2 유전자 intron 5 두 loci polyA 신호 시퀀스의 구성 된 최소한의 HIV-1 파생 기자를 대상으로 선택 했습니다. 대상에 대 한 loci HIV 감염 환자2,,45,6, 기본 T 세포에 다른 연구에서 발견 된 재발 통합 사이트에 근접에 따라 선정 됐다 7,8 과 팸 모티브 NGG 더블-스트랜드 나누기의 Cas9 중재 유도에 필요한 존재. 대상 벡터 생성 되었고 설명된 프로토콜에 따라 페. T...

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

이 방법은 HIV 프로바이러스 통합이 어떻게 ANDrogynous 유전자 발현에 영향을 미치는지, 그리고 왜 특정 게놈 통합 사이트가 최근 HIV 감염 된 세포에서 선택되는지에 대한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 HIV 감염을 위한 체외 모형이 CRISPR/Cas9 기지를 둔 게놈 공학을 사용하여 선택한 통합 사이트에 표적으로 한 프로 바이러스 성 기자를 전송하는 생성될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 토마스 월터, 박사 과정 학생, 줄리아 비알렉, 내 실험실에서 포스트 독이 될 것입니다.UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 표적화될 원하는 게놈 궤적의 게놈 서열을 실리코 추출물로 사용하여 시작한다. 선택한 게놈 궤적의 표적화를 위한 20개의 뉴클레오티드의 가이드 RNA를 선택하려면 E-CRISP 웹 도구를 사용합니다. 그런 다음, 호모 사피엔스 게놈 참조 컨소시엄 인간 게놈:빌드 38.게놈을 게놈서의 유기체 및 입력 2, 000기쌍으로 참조하여 이전에 추출한 원하는 게놈 궤적을 덮는다. 모든 PAM, 모든 5 프라임 베이스, 오프 타겟과 중간 응용 프로그램 설정을 사용하여 가이드 RNA 검색을 시작 불일치를 허용하고 인트론과 CPG 섬을 제외. 나타나는 가능한 가이드 RNA 설계를 가진 목록에서, 표적화될 원하는 게놈 궤적에 가능한 한 가까운 특이성 및 효율성에 대한 높은 점수를 가진 가이드 RNA를 선택한다.참조 게놈에 대해 선택한 가이드 RNA 서열을 폭발하는 NCBI 블라스트 브라우저를 엽니다. 선택한 가이드-RNA 결합 부위의 고유성을 확인하기 위해 먼저 인간을 게놈으로 선택한 다음 가이드-RNA 서열을 쿼리 서열로 입력한다. 그런 다음 가이드-RNA 서열이 고유한지 확인하기 위해 프로그램으로 매우 유사한 서열 또는 메가 블라스트를 선택합니다.그 후, 처음에 추출된 게놈 서열으로부터 가이드-RNA 서열의 상류 및 하류인 실리코 1, 000염기 쌍을 선택한다. 이러한 선택된 1, 000베이스 쌍, 업스트림 및 다운스트림을 5프라임 및 3프라임 호모로지 암으로 사용하여 벡터 시공을 타겟팅하고 기자 시퀀스를 타겟팅합니다. jurkat T 세포의 변환 24 시간 전에, 단일 표적 실험을 위한 세포의 1개의 완전한 6-웰 플레이트를 준비합니다.시작하려면, 플레이트 1, 250, 000 세포RPMI의 2.5 밀리리터 1640 보충제와 항생제없이, 잘 당. 다음 날, 원형 표적 벡터와 2마이크로그램의 Cas9 및 가이드-RNA 발현 플라스미드를 잘, 트랜스페션에 최적화된 상업용 RPMI 배지 의 250 마이크로리터에 반응 튜브에 추가하고 소용돌이에 의해 잘 혼합한다. 그런 다음 튜브의 벽을 만지지 않고 DNA 매체에 12 마이크로리터의 트랜스펙트 제를 천천히 추가합니다.튜브를 플릭하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 혼합물을 하나의 우물에 드롭와이즈로 추가합니다. 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.그리고 72 시간 후 형질 전환 후, 전감염된 세포를 당겨, 그들을 계산하고 FACS에 의해 농축을 준비. 혼합 표적 세포 집단에서 표적 이벤트를 확인한 후, 건강하고 치료되지 않은 jurkat T 세포로부터 항생제로 RPMI를 수집하여 jurkat 조절 배지를 미리 준비하여 단일 세포 클론생성을 시작합니다. 300G에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 0.22 마이크로미터 필터를 새로운 50밀리리터 원유형 튜브로 사용하여 25 밀리리터 주사기로 수퍼네티를 필터링합니다.이전에 FACS에 의해 농축된 표적 세포를 계산하고, 확장 후 10-14일 후에 항생제로 RPMI에서 희석하여 밀리리터당 100, 000 세포의 농도로 희석합니다. 밀리리터당 1, 000세포를 달성하기 위해 중간 크기의 9.9 밀리리터로 이 세포 희석제 100마이크로리터를 희석시합니다. 그런 다음 밀리리터 당 100 세포의 농도에 매체의 9 밀리리터와 이 희석의 1 밀리리터를 희석.96개의 웰 플레이트를 플레이트에 음파1셀을 함유하고, 밀리리터 당 1밀리리터 1밀리리터를 5밀리리터의 상태 배지와 4밀리리터의 신선한 배지와 부드럽게 혼합하여 멸균 시약 저장소에 놓습니다. 그런 다음 다중 채널 파이펫을 사용하여 새로운 96웰 라운드 하단 플레이트의 웰당 각 세포 희석제 100 마이크로리터를 추가하여 잘 희석당 1개 및 2개의 세포를 달성한다. 96 개의 웰 플레이트를 쌓고 각 스택을 6 웰 플레이트로 덮어 3 밀리리터의 PBS가 들어 있습니다.3주 동안 5%의 이산화탄소를 가진 가습된 인큐베이터에서 37도의 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션을 완료한 후, 4배 배율로 가벼운 현미경 검사를 사용하여 재배된 식민지의 존재를 시각적으로 확인하고, 재배된 식민지로 우물을 표시한다. 파이펫팅으로 잘 표시된 하나의 셀을 부드럽게 다시 중단합니다.이 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 항생제로 RPMI 100 마이크로리터와 함께 갓 준비된 96웰 라운드 하단 플레이트 1개에 옮기고, 모든 표시된 우물에 대해 반복하여 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 플레이트를 복제하려면 이 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 두 번째 빈 96웰 라운드 하단 플레이트로 옮기고 표시된 모든 우물에 대해 이 과정을 반복합니다. 마지막으로, 항생제로 RPMI의 200 마이크로 리터로 빈 우물을 채웁니다.플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 중복 플레이트가 24~48시간 동안 배양한 후 모든 웰에 항생제를 가진 RPMI의 100마이크로리터를 첨가하여 다시 복제합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 부드럽게 혼합하고 100 마이크로 리터를 새로운 96웰 라운드 하단 플레이트의 각 웰에 전송합니다.이 두 개의 중복 플레이트 중 하나를 인큐베이터에 넣습니다. 먼저 잘 당 PMA / 이오노마이신 마스터 믹스의 다섯 마이크로 리터를 추가하여, 유세포 측정에 대한 새로운 중복 플레이트의 두 번째를 사용하여 세포를 자극합니다. 24 시간 동안 배양하고 텍스트에 설명 된 바와 같이 유동 세포 측정에 대한 세포를 준비합니다.전방 및 측면 분산의 크기를 기반으로 실행 가능한 단일 셀을 게이트합니다. 유동 세포측정에 의한 형광 기자 유전자 발현을 분석한다. PCR에 의해 단일 셀 클론을 선별하기 위해, 선택한 리포터 서열에 기초하여 PCR을 선별하기 위한 디자인 프라이머 P5 및 P6, 리포터 시퀀스의 500~800개의 기본 쌍을 증폭한다.양포 제어 PCR의 경우, 설계 프라이머 P7및 P8은 630개의 기본 쌍을 야생형, 비표적 게놈 궤적으로 증폭시다. 타겟팅 벡터 백본 서열의 특이하지 않은 통합을 위한 컨트롤로 타겟팅 벡터 백본의 500~600개의 기본 쌍을 증폭시키는 세 번째 프라이머 쌍을 디자인합니다. 두 번째 중복 플레이트의 클론이 충분히 성장하면 실온에서 300-G에서 10 분 동안 플레이트를 원심분리하여 PCR 스크리닝을 준비하십시오.조심스럽게 상체를 벗고 세포 펠릿을 방해하지 않도록하십시오. 부드러운 파이펫팅으로 PBS 100 마이크로리터로 셀을 세척하고 실온에서 300G에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. PBS를 제거하고 잘 당 200 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.파이펫을 부드럽게 섞고 서스펜션을 새로운 PCR 플레이트로 옮기습니다. 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 열사이클러에서 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다. 10분 동안 최대 속도로 셀 이물질을 원심분리한 후, 상체판을 새로운 PCR 플레이트로 옮긴다.이 셀 용액 10 마이크로 리터를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 110 마이크로리터의 증류된 H2O로 채워 넣습니다. 그런 다음 열순환기에서 섭씨 99도에서 10분 동안 배양하여 이 셀의 단백질Ase K.Use 2 마이크로리터를 템플릿으로 비활성화하고 스크리닝, 제어 및 백본 PCR에 상업용 PCR 마스터 믹스를 사용합니다. PCR을 96웰 형식으로 38~40사이클의 PCR 증폭에 실행합니다.PCR 제품의 5개의 마이크로리터를 사용하고 1.5%의 아가로즈 TAE 젤로 실행하여 유동 세포측정및 PCR 결과를 분석하고 결합하여 단일 세포 클론을 확인합니다. PMA/이오노마이신 유도 후 기자 유전자 발현은 통합 부위에 따라 세포의 4~12%에서 혈류 세포및 PCR 모두에 의해 확인되었다. 5-프라임 및 3-프라임 통합 접합을 위한 프라이머를 사용하여 게놈 DNA의 PCR 분석은 표적 이벤트가 발생했는지 확인합니다.유동 세포측정에 의한 올바른 표적화를 위한 단일 세포 클론의 스크리닝 후, 높은, 낮음 및 형광 기자 유전자 발현이 없는 클론이 관찰되었다. 단일 셀 클론은 또한 리포터 특정 프라이머 및 제어 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인되었다. 클론은 기자 특정 프로브와 기자 외부의 게놈 프로브 바인딩을 사용하여 남부 블롯에 의한 올바른 표적화를 위해 PCR 검사를 양성으로 확인했습니다.남부 블롯 분석에서 올바른 대역 크기만 보였고, 이종수구우스가 기자를 통합하여 남부 블롯에 의해 PCR 결과를 확인하는 것이 중요하다는 것을 보여주었습니다. 클론은 또한 양양성 단세포 클론을 더 확인하기 위해 시퀀싱에 의해 분석되었다. 대상 부위의 시퀀싱:상동성 적선, 기자가 통합되지 않았고, Cas9 유도 돌연변이가 밝혀졌다.일단 마스터되면, HIV 기자 라인의 생성은 2 ~ 3 개월 안에 달성 될 수있다. 타겟팅하기 전에 해결하려는 연구 질문에 따라 통합 사이트와 적절한 리포터를 선택하는 데 충분한 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 기자는 예를 들어 원하는 경우 다른 HIV 규제 요소를 포함할 수 있습니다.이 절차에 따라, 세포주 예를 들어, 통합 부위에 따라 리포터 LTR의 전사 활동에 대한 상이한 대기 시간 상승 제의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 가이드 RNA 를 설계하고 벡터를 타겟팅하고, JUrkat 세포에서 CRISPR/Cas9 기반 게놈 엔지니어링을 수행하고, 단일 셀 클론을 생성하고, FACS 및 PCR 스크리닝에 의해 올바르게 표적화된 클론을 선택하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다. 복제 능력이 있는 HIV 리포터와 함께 일하기로 선택한 경우 BSL3 안전 조건하에서 작업해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

crispr-cas9-based-genome-engineering-to-generate-jurkat-reporter

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현재 HIV - 1 전략은 바이러스 생활주기를 억제하지만, 효과적으로 감염을 근절하지 행동. 여기, 우리는 입증되는 감염된 세포의 게놈에서 설계 recombinase 수 효율적으로 소비세 통합 HIV - 1 proviral DNA.

인터뷰 : 진화 Recombinase을 사용하여 HIV - 1의 DNA 절단 Proviral

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

배우세요 CRISPR-Cas9 기반 게놈 엔지니어링으로 Jurkat 세포에서 HIV-1 프로바이러스 통합 사이트별 기자 모델을 생성하는 방법입니다. 이 기법은 바이러스 통합이 유전자 발현에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

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