Name: 신생아 Polymicrobial 패 혈 증에 대 한 제어 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: 배우세요 신생아 패혈증 연구를 위한 cecal slurry 모델 제작 및 마우스 투여법. 표준화된 절차와 데이터 기반 안락사 종점 판정법으로 재현성 있는 실험 결과를 얻을 수 있습니다.

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그들의 지도 동물 모니터링 및 복지에 입력에 대 한 특별 클레어 해리슨과 동물 케어 시설에 브리티시 컬럼비아의 아동 병원 연구 연구소 (BCCHR) 그들의 지원에 대 한 일 뿐만 아니라 닥터 포 연 청에 감사 합니다.

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<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mortality+and+altered+immunity+in+neonatal+sepsis+produced+by+generalized+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis.</a> Shock. 28 (6), 675-683 (2007).</li>
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<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+innate+immunity+predisposes+murine+neonates+to+poor+sepsis+outcome+but+is+reversed+by+TLR+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists.</a> Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CXC+ligand+10%2FCXC+receptor+3+signaling+in+the+murine+neonatal+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+and+defects+in+the+neonatal+and+elderly+immune+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis.</a> Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1%2F11+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li>
<li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).</li>
<li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li>
<li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li>
<li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).</li>
<li>Hansen, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+milk+fat+globule-epidermal+growth+factor-factor+8+exacerbates+organ+injury+and+mortality+in+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).</li>
<li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li>
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</ol>

닥터 제임스 윈에서는 국립 보건원 (NIH) / 국가 지원을 받는 일반 의료 과학 (R01GM128452)의 연구소와 NIH /유 니스 케네디 슈 라이버 국립 아동 건강과 인간 발달 (NICHD) (연구소 R01HD089939)입니다.

출생 후 신생아 마우스는 매우 제한 된 이동성 및 도전 받지 않은 경우에 그들의 뒤에 배치 되 고 이후 자신을 바로 실패. 돌 7이 모델에 도전 하는 쥐 세 FTR 모바일 권한 모바일에서 스패닝 하는 움직임의 범위에서에서 관찰 되었다 중요 한 차이와 당된 쥐, 즉이 나이에 당된 마우스 FTR 기 면 동작을 표시 하지 않았다. Polymicrobial 패 혈 증으로 도전 하는 마우스만 되 관찰 되었다 FTR 기 면; 따라서,이 응답 질병 심각도의 표시 될 수 있습니다. 엉덩이 운동에 대 한 수평 90 ° 각도의 구분에 세심 한 되 쥐에서 엉덩이 운동 기 면 또는 모바일의 일관 되 고 정확한 할당 수 있습니다. 4의 시간 프레임 볼 경우 마우스 자체 마우스 오른쪽 수 있습니다 s 당된 쥐 일관 되 게이 기간 내 자신을 바로 할 수 있기 때문에 선정 되었다. 반복 되는 동일한 마우스의 측정 피 했다 오른쪽으로 스스로 시간 동안 엉덩이 이동성의 측정 4 제한 되었다 s, 그렇지 않으면 음식 및 온 하는 기능에 영향을 미칠 수 있는 영향을 미칠 수 마우스를 지나치게 피곤 하지 않도록 하는 더 나은 예 후 모두 왼쪽과 오른쪽에서 자체 righting 관찰 했다, 그리고 높은 점수 사용 마우스 인간적 끝점에서 결정, 일부 마우스 FTR-Nonmobile 1 개의 측에 표시 하는 것을 발견 했다 때문에 아직 다른 측면과 b에 높은 이동성 e 결국 복구할 수 있습니다.
마우스 상태를 평가 하는 데 사용 하는 채 점 시스템 범주 차단의 적용 이란 운동의 스펙트럼에 의존 그리고, 그러므로, 개별 바이어스 하는 경향이 있을 수 있습니다. 직원은 각 사람이 득점 쥐 같은; 되도록 함께 훈련 그러나, 아마 변화를 선도 하는 주관의 수준을 유지 됩니다. 득점의 일관성 7 함으로써 평가 되었다 이전 신생아 마우스 모니터링 수행 하지 했다 연구자가 프로토콜 및 비디오에서 설명한 요구 사항을 배울, 독립적으로 동작을 할당 하 고 자비 롭 결정 끝점입니다. 97%의 정확도 60 도전된 쥐, 개별 바이어스가이 모델의 행동 할당에 상당한 역할을 재생 되지 않습니다 제안에 수행 점수와 관찰 되었다. 제시 행동 모니터링 프로토콜, 돌 7에 도전 하는 동물의 관찰에 따라 아직 당된 건강 한 상태에서 6 일 보다 젊은 쥐 일관 되 게 자신을 마우스 오른쪽 수 없습니다. 따라서, 설명된 인간적 끝점 기준 젊은 쥐에 직접 적용 되지 않을 수 있습니다. 젊은 쥐가 실험 모델에 사용 되는 또는 다른 질병 활동을 사용 하 여 다른 도전 모델을 적용 하는 경우 다음 적당 한 인간적 끝점 기준 개발 하 고 해야 합니다 그렇지 않으면, 결국, 그는 쥐의 안락사를 피하기 위해 조종 하는 경우 복구할 수 있습니다. 채 점 시스템 인간적 끝점 분류, 확인, 테스트와 적용할 수 있는 잠재적으로 다른 모델에 개선 하는 강력한 방법을 표시 합니다.
Cecal 슬러리의 각 준비 또는 신형 마우스를 사용 하 여 비슷한 치명적인 복용량을 달성 하기 위해 관리 cecal 슬러리 복용량의 retitration이 필요 합니다. 각 준비 관심, 즉 생존의 판독에 의해 표준화 되었다 같은 세균 수 보다. 각 cecal 슬러리 준비 가능한 세균 농도 때문에 기증자의 공생 박테리아 또는 무게에 차이가 약간, 잠재적으로 다양 한 cecal 슬러리 재고 postfiltration의 셀 스 트레이너에서 남아. Cecal 슬러리의 적정 동안 처음 두 새끼 두 그룹으로 분할 되었다 고 각 복용량의 두 새끼에 테스트 되도록 쓰레기의 각 반 두 복용 중 도전. 결과 생존 율에는 필요한 수준 일치 하지 않았다 도전 복용량 증가 또는 5%-10%로 감소 했다 그리고 실험을 반복 합니다. 여러 새끼 쓰레기 쓰레기 차이 저항 발생할 수 또는 쓰레기에 걸쳐 패 혈 증에 대 한 민감성을 증가 대 한 계정에 사용 되었다. 그것은 정확 하 게 titer cecal 슬러리의 새로운 적정 이전 cecal 슬러리 준비에 비교 했다 되도록 각 새로운 준비 cecal 슬러리 재고 하는 것이 중요 했다. 과잉 소음 및 진동, 아스팔트와 주변 건물 및도, 건설의 압축 하는 동안 특히 댐에서 스트레스 증가를 관찰 했다. 이 cannibalization의 증가 속도와 상관 하 고도에 대 한 통제 될 필요가 있는 신생아 생존에 외부 영향 있을 수 있음을 알리는 당된 쥐에 영향을 미치는 생존 실험의 사망률에 영향을.
Cecal 슬러리 재고 준비를 위한 이전 방법 신선한 cecal 슬러리를 사용 하 여 또는 냉동된 cecal 슬러리, 필연적으로 도전 하는 동안 하지 전송 될 것 이다 글리세롤에 저장소를 포함 하 여 방법의 다양 한을 사용 하 여 준비에 포함. 신선한 cecal 슬러리를 사용 하 여 세균성 구성 원래 cecal 내용에 가장 가까운 데의 이점을 제공 한다, 동안 공생 박테리아의 변형으로 인해 개별 기증자 쥐 해 위험이 있다. 이 시간을 최소화 하면서 실험의 진행 및 사이 동일한 공급 업체에서 cecal 기증자를 사용 하 여 최소화 했다, 하는 동안 일부 실험실에 대 한 비용 옵션 될 수 이와 데에서 또 다른 타이밍 물류 과제를 제시 나이 일치 마우스 cecal 슬러리를 개시 하는 때 사용할 수 있는 7 일 된 신생아 쥐에 있는 실험. 여러 성인 기증자의 cecal 내용이 풀링된 했다, D5W, 글리세롤, 없이-80 ° C에서 냉동에 resuspended 및 실험에 대 한 한 번에 한 약 수 동 신선한 cecal 슬러리를 사용 하 여 다른 방법 이용 되었다. 성인 기증자 cecal 슬러리 신생아 패 혈 증 연구의 활용 가능성이 종의 박테리아 신생아 마우스, 노출 되지 않은 cecal 슬러리에 전송할 수 하지만 그것은 신생아 쥐에 있는 패 혈 증의 연구에 대 한 허용 하는 전략 및 지난13,,1415에서 신생아 마우스 생물학을 공부 하는 데 사용 되었습니다. Cecal 슬러리 박테리아 주입 했다 고 necrotizing 동안 복 막 구멍에 있는 양분의 가용성을 모방 하기 위해 적극적인 감염의 설립을 허용 박테리아에 영양을 제공을 D5W에 희석 했다 enterocolitis입니다. 글리세롤은 부작용 때문에 잠재적인 부정적인 글리세롤 주입 혼자에서 발생할 수 있는 박테리아에 안정 시키는 대리인으로 포함 되지 않았습니다. 글리세롤 cecal 슬러리 준비 포함 되었습니다, 경우 다음 잠재적인 피해는 글리세롤 혼자 수 유도 것 필요한 글리세롤 전용 (부족 cecal 슬러리)를 포함 하 여에 대 한 테스트를 증가 했는 쥐에 주입 마우스 사용. Cecal 슬러리의 박테리아 생존 글리세롤 없이 cecal 슬러리 재고 동결 후 테스트 하 고 발견 했다 6 통해-80 ° C에 저장 된 동일한 cecal 슬러리 준비의 별도 aliquots에 박테리아 농도에 변화 없이 일정 달 기간입니다. 이 글리세롤 없이 저장 가능한 일관 된 생물학적 결과 제공 하는 것을 제안 합니다. 대량-준비 cecal 슬러리 재고 냉동의 사용 또한 쥐 사내, 사육 비용 절감 및 마우스 소모를 줄이고 따라서 번 식에서 초과 수 컷 쥐를 이용 하 여의 사용 허용.
쥐에서 실패 한 과제의 식별 시스템에 여분의 노이즈를 추가 하지 않도록 하는 것이 중요 했다. Cecal 슬러리의 복 주사를 받은 후 쥐 표시 실제로 피하는 실패 한 주사를 피부 밑에 볼록한의 존재에 대 한 관찰 되었다. 마우스 바늘 제거 직후와 마우스 가끔 것 때문에 그들은 주입 후 걸음을 허용한 후 주사 사이트에서 누수에 대 한 관찰 했다 단계를 취 함으로써 주사 부의 사지를 이동 후 (거의) 새. 돌출 또는 주입에 따라 누설의 존재는 분석에서 마우스를 제거 결과. 결국, 이러한 도전 복용량에 5% 차이 이후의 생존에 영향을 미치는 관찰 되었습니다로 주입 cecal 슬러리의 잘못 된 금액으로 인해 다른 결과 초래할 수 있습니다.
Cecal 슬러리 도전 무게 조정 복용량을 변화 자주 필요한 다양 한 대상 치명적인 복용량 실험. 이 때문에, 사출 볼륨 만큼 적게 20 µ L에서 및 100 µ L까지 배열할 수 있다. 관련 된 비례 실험 오류 죽은 바늘 볼륨 변경 주입 볼륨, 다른 복용량을 직접 비교 하는 데 어려움을 증가 함께. 사출 볼륨 표준화의 간단한 수정, 차이의이 소스는 실험에서 제거 됩니다.
이 프로토콜에 사용 되는 신생아 마우스의 행동 모니터링 시스템 그것의 종류의 첫번째 이다. 신생아 쥐와 윤리적인 연구에 연구원 의도 자주이 나이에 동물의 복지를 평가 하기 위해 자원의 도전적인 부족으로 직면 된다. 제시 직관적이 고 일관 된 모니터링 시스템이 지식 격차를 해결 하기 위해 시작 합니다. 중요 한 것은,이 증거 기반 접근 뿐만 아니라 획득 한 실험 데이터의 품질을 증가 하지만, 같은 시간에도 실험 동물의 고통을 감소.

패 혈 증은 인간의 신생아 감염 사망자1의 주요 원인입니다. 신생아 패 혈 증을 제대로 이해 하 고, 때문에 작은 진행 위험 신생아 질병 동안 일찍 식별 및 효능 치료 또는 prophylaxes의 개발 했다. 이 프로세스 및 테스트 가능한 개입을 더 잘 이해 하는 패 혈 증의 동물 모델의 사용을 필요로 합니다. 또한, 성인 설치류는 패 혈 증, 신생아2비교 결과 호스트 응답에 차이와 같은 치 사 량 (LD)를 관리 하는 박테리아의 수에 통계적으로 유의 한 차이를 다르게 응답. 따라서, 신생아 패 혈 증 신생아에서 공부 될 수 있다. 여러 성인 패 혈 증 모델 패 혈 증 연구에 사용 되었습니다. 특정 유기 체 성인 인간의 패 혈 증 또는 cecal 결 찰과 펑크 (CLP)에 연루 된 정 맥 도전 포함 됩니다. CLP 결국 미생물과 그들의 제품3의 체계적 보급에 이어지는 어디 맹 수술 절연, 출혈, 이며, 복 막으로 장 내용의 누설 수 있도록 구멍이 생 도전 모델입니다. 그러나, CLP를 설정 하는 데 필요한 수술은 치명적인 신생아 동물; 따라서, 다른 방법 polymicrobial 도전 CLP 신생아 패 혈 증 유발을 모방 하는 데 필요한입니다. Polymicrobial 신생아 패 혈 증에 대 한 cecal 슬러리 모델에 의하여 동물의 cecal 내용을 수확, 물 (D5W)에 메 마른 포도 당 5%에 그리고 intraperitoneally 신생아 쥐2에 주입이 필요를 해결 하기 위해 개발 되었다. 이, 이후, 패 혈 증 신생아 및 성인 동물을 공부 하는 점점 인기 있는 모델 고 실질적으로 질병의 과정4,,56,7 기계적 통찰력을 전진 했다 ,8,9,10,11,12,13,,1415.
이 모델의 증가 사용 및 게시 결과 직접 비교할 연구자의 욕망을 감안할 때, 연구에서 잘 설명 하 고 표준화 하도록 기술적 측면에 대 한 필요가 있다. 표준화에 적용 모델의 세 가지 측면 즉, i) cecal 슬러리 주식, ii) 실험 동물에 주입에 대 한 도전 aliquots의 준비 및 iii) 인간적 끝점의 정의의 준비에 의하여 동물 도전 실험에서 nonsurvivors 간주 됩니다. 특히, cecal 슬러리 재고를 준비 하는 방법은 모델2를 소개 하는 원래 기사에 자주 참조 됩니다. 그 모델에 대 한 간단한 요약이입니다 성인 쥐에서 cecal 내용을 했다 수확, 80 mg/mL의 농도에 살 균 D5W에 실험 동물 주사를 2 시간 이내 사용. 이 원래 모델 cecal 내용을 수확 전에 2 주 미만 대 한 그들의 각각 연구 시설에서 지 내게 했다 동일한 공급 업체 위치에서 같은 나의 마우스를 사용. 사내 자란된 쥐를 사용 하 여 일반 공급 업체 납품 및 광범위 한 성별과 나이의 초과 마우스의 사용에 대 한 허용에서 비용을 줄이고 있지만 또한 실질적으로 기증자 기증자 가변성 증가. 이 여러 마우스에서 cecal 내용을 aliquoted 다음 되었고13-80 ° C 저장 된 큰 주식 준비 하 함께 풀링된 했다 그것에 의하여, 대체 기술의 개발 동기. 이 대체 방법은 여러 그룹14,15적응 했다. 그러나, 그 적응 결과 저장 매체 사용 (10% 또는 15% 글리세롤 또는 D5W 혼자) 및 미 립 자를 제거 하 여과의 전략에 몇 가지 기술적인 변화 (860 µ m와, 그럼, 190 µ m을 통해 다단계 여과 필터, 또는 개인 100 µ m 또는 70 µ m 필터를 통해 filtrations)13,,1415. 글리세롤 혼자의 주입 입힐 수 있는 잠재적으로, 그 25%-50% 글리세롤 주사 신장 상해16,17,,1819의 설치류 모델으로 사용 되었습니다. 20. 글리세롤의 의도 하지 않은 부작용을 피하기 위해,이 연구는 쥐에 대 한 cecal 슬러리 재고 준비에에서 얼 D5W 글리세롤, 없이 그리고-80 ° C에 저장에서 세균 생존 능력의 테스트가 수행 됩니다. 이 연구에 사용 된 여과 전략 나열 된 다른 여과 전략을 직접 비교 하지는 70 µ m 필터를 통해 패스입니다.
치명적인 무게 조정 복용량 주입된 cecal 슬러리의 시설에서 시설 다를 수 있습니다 고 개별 그룹에 대 한 원하는 치에 밖으로 titered 이어야 한다. 다른 도전 복용량과 함께 도전 볼륨 필요성에 의해 변경. 그러나,이 방법론 세부 되지 전에 보고 되었습니다. 또한, 복 주입 등의 표준 절차를 위한 전략 거의 문학, 내에 정교 하지만 개별 기술 여부 신생아 마우스 주입 했을 때 누설 하 고 그들의 최종 결과 영향을 영향을 미칠 수 있습니다.
동물 복지, 인간적 끝점의 정의 포함 하 여이 모델의 및 설치류21염증과 감염의 어떤 모형 든 지에 중앙 측면 이다. 1998 년에 캐나다 위원회 동물 케어 (CCAC)에 "어떤 실제 또는 잠재적인 고통, 고통, 또는 불편 최소화 하거나 해야 초기 선택 하 여 완화로 인간적 끝점 정의 인간적 끝점 선택에 대 한 광범위 한 지침 게시 끝점을 연구의 과학적 목표와 호환 은"22. 다른 또한 주의 자비 롭 끝점을 설정 해야 합니다 그 동물의 상태 혼자21의 주관적 해석 보다 과학적인 정당화에 기반. 그러나 거기에 다양 한 리소스에 대 한 임상, 행동, 그리고 감염 및 염증에도 인간적 끝점에 대 한 신체 조건 로그인 기반 기준 특히21,,2324, 이러한 신생아 쥐 언급 인간적 끝점22, CCAC 지침을 포함 하 여. 따라서, 객관적으로, 과학적으로 정당화 인간적 끝점은 체중 감소, 성인을 위해 일반적으로 사용 되는 같은 기준에서 그들의 제한 된 행동 기능 및 증거의 부족을 주어 신생아 동물에 대 한 설정 하기가 훨씬 더 어렵습니다. 쥐입니다. 현재, 모델2를 도입 하는 원래 원고를 다시 참조 하는 모든 cecal 슬러리 문학에서 5에 12-일 된 신생아 쥐에 대 한 사용 하는 인도적인 끝점 조건입니다. 이 원래 종이에 신생아 동물에 대 한 인간적 끝점의 정의 두 기준;에 근거 했다 즉, 둥지 (산란) 외부 마우스의 위치와 우유 명소의 부족 했다 죽음 시간 이내에 결과를 보아 왔다. 인간적 끝점을 할당 복잡 문제는 우유 명소 아픈 동물 생활 (DOL)의 14 날까지 모니터링 하는 동안, 생활의 첫 번째 주 후 일반적으로 고용된 C57BL/6J 스트레인 같은 어두운 모피와 마우스 긴장에서 볼 어려워 합니다. 또한, 죽은 동물 찾을 수 있습니다 postchallenge 이러한 기준을 적용 하는 때 (자신의 관찰; 미 출판); 따라서, 인간적 끝점의 더 엄격한 정의 실험 동물에 게 고통을 완화 하 고 어디 결과 수 정확 하 게 분별 수 이전 상황에서 사망률을 방지 하는 데 필요한.
Cecal 슬러리 모델의 모든 세 가지 방법론적 측면 cecal 슬러리의 준비 적 표준 운영 절차에 제공 됩니다, 복용량 사이 주입 볼륨 상수 계속 실험 동물에 주입 하는 방법 및 누수, 위험과 행동 모델링의 시스템에 따라 7-를 12-하루-오래 된 마우스에 대 한 인간적 끝점의 정의 줄일 수 있습니다. 마우스 건강 점수 240 실험 동물에서의 행동 정보 수집 되었고 결과별 최종 생존, 인간적 끝점의 증거 기반 정의 보여주는. 생물학적으로 중요 한 생존 결과 주요 변수를 관찰 하 여 유추 하실 수 있습니다 하는 동안 초기 가능한 시간 시점에서 죽어가는 신생아 쥐를 식별 하 여 실험 동물의 고통을 감소 된다. Cecal 슬러리 준비와 신생아 마우스 동작의 시각적 패 혈 증 또는 신생아 도전 모델 동물을 공부 하 고 어떤 그룹에 우수한 자원으로 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>0.1 - 20 & L 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>732-0799</td><td></td></tr><tr><td>1.8 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Costar</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1000 &mu; L 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>732-0801</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; L 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>732-0800</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-25</td><td></td></tr><tr><td>23G1 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305145</td><td>주사기가 아닌 바늘만 사용하여 마우스를 스티로폼</td></tr><tr><td>28G 0.5 mL 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 극저온 바이알</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 피펫</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>6-10 주 된 C57BL / 6J 성인 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>7 + 일 된 C57BL / 6J 신생아 마우스</td><td>집에서 자란</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Defibrinated Sheep's Blood</td><td>Dalynn</td><td>HS30-500</td><td></td></tr><tr><td>덱스트로오스 5% 물 (D5W)</td><td>Baxter</td><td>JB0080</td><td></td></tr><tr><td>해부 펜치</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-386</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위, 날카로운 팁</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-592</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위, 날카롭고 뭉툭한 팁</td><td>VWR</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(HistoPrep 95% 변성 에틸 알코올)</td><td>Fisherbrand</td><td>HC11001GL</td> 이중 증류수 에탄올 방지 마커<td>로 70%로 희석;</td></tr><tr><td> 실험실 마커</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>EZ 마취 기화기</td><td>EZ 마취</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500, 건식 살균 수술기구 (핫 비드 살균기)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td>Chemglass</td><td>CG-1983-12</td><td></td></tr><tr><td>파이펫 에이드</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic 파이펫 PR-1000</td><td>Rainin</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic 파이펫 PR-20</td><td>Rainin</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic 파이펫 PR-200</td><td>Rainin</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Sartorius</td><td>BL 150 S</td><td></td></tr><tr><td>표본 집게</td><td>VWR</td><td>82027-440 / 82027-442</td><td></td></tr><tr><td>정사각형 1000 mL 저장 병</td><td>Corning</td><td>431433</td><td></td></tr><tr><td>스티로폼 보드</td><td>Any</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal Mouse/Rat 안락사 챔버</td><td>Euthanex</td><td>EZ-178</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22091-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>VX-200 Lab Vortex Mixer</td><td>Labnet International</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>weigh 종이</td><td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 polymicrobial 패 혈 증에 대 한 제어 마우스 모델

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

신생아 패 혈 증에는 글로벌 부담이 남아 있다. 전 임상 모델 화면 효과적인 예방 또는 치료 개입을 필요 합니다. 신생아 마우스 polymicrobial 패 혈 증은 생활 7 쥐의 날에 intraperitoneally cecal 슬러리를 주입 하 고 다음 주에 대 한 그들을 감시 하 여 유도 될 수 있다. 여기에 제시 하는 것은이 신생아 패 혈 증 모델의 구현에 필요한 자세한 단계입니다. 이 체중 및 쓰레기 조정 복용량, 모니터링 일정의 개요와 인간적 끝점을 정의 하는 데 사용 하는 관찰 된 건강 카테고리의 정의에 그것을 diluting 균질 cecal 슬러리 재고를 만드는 포함 됩니다. 균질 cecal 슬러리 주식 풀링된 기증자에서의 세대 시간이 지남에, 기증자, 사이의 편차를 줄이고 잠재적으로 유독한 글리세롤의 사용을 방지 많은 새끼로 관리 할 수 있습니다. 사용 되는 모니터링 전략은 생존 결과의 기대와 죽음, 자비 롭 끝점의 이전 id에 대 한 수 있도록 진행 나중 것이 쥐의 식별에 대 한 수 있습니다. 두 가지 주요 행동 기능 건강 점수, 즉, 그들의 뒤 및 이동성의 그들의 수준에 둘 때 스스로 오른쪽 신생아 쥐의 기능을 정의 하는 데 사용 됩니다. 이 기준은 적용할 수 있습니다 잠재적으로 쥐, 신생아 질병의 다른 연구에 인간적 끝점 주소에 파일럿 연구 정확도 확인 하기 위해 수행. 결론적으로,이 방법은 도전된 동물에 대 한 초기 인간적 끝점을 정의 하는 데 사용 하는 동물 복지를 평가 하기 위해 자원을 제공 하는 동안 모델 생쥐, 신생아 패 혈 증에는 표준화 된 방법의 제공 합니다.

Cecal 슬러리 생존-80 ° C에 저장 시간이 지남에 직렬 diluting 및 도금 aliquots cecal 슬러리 주식의 5% 양 혈액 tryptic 간장 한 37 ° c.에 에어로빅 외피의 24 시간 뒤에 시험 될 수 있다 Culturable 콜로 니 형성 단위 (CFU) 콘텐츠 cecal 슬러리 준비의 계산 발견 하지 6 개월 기간 동안, 변경 및 생존 능력은 영향을 받지 않습니다-80 ° C (그림 2)에서 장기간된 보관 이어서이 일어난 각 기증자 마우스 결과, 평균, 충분 한 cecal 슬러리 도전 3 ~ 4 새끼 (데이터 표시 되지 않음).
Polymicrobial 패 혈 증을 유도 하 cecal 슬러리 돌 7에 도전 하는 쥐의 도전, 12 h 이내 인간적 끝점에 도달 하기 시작 했다 및 polymicrobial 패 혈 증은 주로 확인 48 h postchallenge에서 결합 하는 카 플 란-마이어 생존 곡선 관찰 (그림 1A)의 도전된 쥐 200 개 이상의 데이터입니다. 치 사 율은 도전 복용량 인 5% 변화 관리 도전 복용량에 의존 한 생존 율 (그림 1B)에 약 15% 차이. 마우스 몸 무게는 각 모니터링 방문에서 측정 했다. 체중 감소는 살아남은 결국 쥐와 않았다 하지 초기 24 시간 동안 postchallenge (그림 1C) 그 사이 차별적 되 고 모든 도전된 동물에서 보였다. 24 시간 후 가장 살아남은 동물 모든 nonsurvivors 체중을 계속 하 고 그들의 인간적 끝점으로 이동 하는 동안 그들의 체중을 회복 하기 시작 했다. 그러나, 작은 동물을 자신의 righting 반사는 또한 체중을 계속 유지 또는 실험, 도전 40 h 이내 초기 체중의 20% 정도 잃고 심지어 말까지 체중을 실패 했다 생존의 비율은. 살아남은 결국 쥐와 하지 않은 체중 감소의 오버랩 되면서 체중 또는 체중 감량의 임계값 변경 사용할 수 없습니다 조건으로 인간적 끝점에 대 한 유지 하면서도 정확 하 게 나누어 생존자의 목표 nonsurvivors에서.
프로토콜에는 표 2에 설명 된 대로 마우스의 동작 모니터링 했다. 스냅샷 카테고리는 건강의 표시 (그림 3A-C). 이 사진 보여 쥐의 다른 건강 카테고리 누가 그들의 뒤에 배치 되 고 이후 자신을 바로 개요 FTR-모바일과 FTR 기 면의 차이 중요 한 구별 하지 못했습니다. 이 시대의 당된 건강 한 쥐 FTR 기 면 활동을 표시 하지 않습니다. 따라서,이 건강 카테고리 질병 및 도전 하 응답의 표식입니다. 아픈 마우스 FTR 기면증 증상 (그림 3B)를 표시 하 고 FTR-Nonmobile (그림 3C), 위쪽 다리 아래쪽 다리와 평행 하 게 남아 있는, 향해 복귀 수 거의 0 엉덩이 운동, 락 중 하나입니다에 대 한 기준 자비 롭 끝점입니다. 쥐 수 있습니다 또한 복구 증가 엉덩이 움직임을 얻고 고 FTR-모바일 (그림 3A). Righting 반사 및 이동성 점수 왼쪽 및 오른쪽 각 마우스의 결정 그리고 높은 점수 마우스 인간적 끝점에 도달 했다 여부를 결정 하기 위해 이용 되었다. Cecal 슬러리의 치명적인 복용량 60 (LD60) 도전 240 동물에서 행동 정보 수집 하 고 (그림 3D-F 및 표 1) 144 인간적 끝점 관찰 했다. 이 증거 기반 접근 정의 하 고 생존자와 nonsurvivors 사이 두 행동 차이에 따라 경험에 의해 고 인간적 끝점에 도달의 분수에 의해 분류 된 4 개의 질병 단계에 걸쳐 자비 롭 끝점을 수정 하는 데 사용 했다 동안 각 시간 프레임. 초기 실험을, 동안 엉덩이 운동 했다 FTR Nonmobile 쥐 일관 되 게 관찰 되 고이 동작의 4-6 h 이내 죽은 발견 됐다. 제시 정보의 수집, FTR Nonmobile 건강 점수는 인간적 끝점에 대 한 기준으로 사용 되었다. 12 월 21 일 h postchallenge에서 FTR Nonmobile 마우스 안락사 했다 하는 동안 살아남은 및 nonsurviving 동물 표시 매우 비슷한 행동 패턴 고 다른 방법으로 (그림 3D) 고유 수 없습니다. 21-48 h postchallenge에서 마우스를 살아 나 기의 대부분을 자신의 righting 반사 회복, FTR 행동 관찰의 1% 미만에 갈 것 이라고 동물에 동안 생존 실험 (3E 그림). 따라서, 양쪽 모두에서 자신을 바로 하지 못한 쥐가이 시간 동안 인간적 끝점에 대 한 추가 조건을 되었다. 12 및 20 h postchallenge, 사이 인간적 끝점의 총 수의 12.5% 관찰 되었다, 20과 48 h, 사이 80.5%와 7% 대 후 48 h (표 1). 쥐 사이 구별 기능을 살아남은 결국 하 고 결국 인간적 끝점에 악화 righting 반사, 엉덩이 이동성 (그림 3 층)의 독립의 손실 했다. 사실, 도전 후 20, 48 h, 사이 총 121 쥐 결국 인간적 끝점 (복구 하지 것이 마우스를 식별에 96%의 정확도 나타내는)에 진행이 쥐의 116와 자신 양쪽 모두에서 마우스 오른쪽을 실패 했다. 도전 후 48 h, 넘어 인간적 끝점 (91% 정확도)에 자신을 측면, 그리고 이러한 진행의 10에서 오른쪽 실패 11 마우스 관찰 되었다. 도전 후 20 h, 넘어 양쪽 righting 반사 손실 된 쥐의 수 예측 정확도 90% 이상; 최종 결과 따라서,이 이전 nonrecovering 마우스를 식별 하 여 마우스 (표 1) 고통을 줄일 인간적 끝점 기준에 추가 되었습니다.
쥐 모니터링 필요 주파수의 죽음 postchallenge, 다른 속도로 인해 시간이 지남에 따라 변경 하 고 표 1에 설명 되어. 마우스 자체 오른쪽 실패 했다 언제 든 지 그것의 인간적 끝점에서 것 여겨졌다 비모바일 엉덩이 운동 양쪽 모두 표시 마우스는 둥지에서 흩어져 발견 하는 경우 또는 자체, 오른쪽 하지 못했습니다 그리고 기 면 엉덩이 운동을 했다. 이러한 조건 중 하나에 있는 쥐 하지 쓰레기를 다시 도전 후 4-6 h. 시작 20 h 내 FTR-Nonmobile 수를 관찰 되었습니다 수 있을 것으로 예상 했다, 새로운 인간적 끝점 추가 되었습니다 제시 정보를 표시 하는 광대 한 때문에 양쪽에서 FTR 질병에 굴복 당했던 결국 쥐의 대부분.
비디오, 테이블, 및 리소스가이 원고에 도전된 쥐의 올바른 행동 지정을 위한 효과적인 교육 리소스를 있습니다. 7 경험 훈련 비디오를 감상 하 고 60 도전 동물 동작을 할당 하기 전에 프로토콜 및 테이블을 읽기를 요청 했다. 인간적 끝점 지정의 식별은 모두 다른 동작 (그림 4A) 표시는 마우스에서 구별 FTR Nonmobile 마우스 및 허용 기간 (내 자신을 바로 수 있었다 쥐에서 FTR 생쥐에 대 한 정확한 그림 4B)입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig1.jpg"> 그림 1 : 카 플 란-마이어 생존, cecal 슬러리 복용량 적정 곡선과 무게 변화 cecal 슬러리 도전 다음. (A) 돌 7 복 cecal 슬러리 분사와 함께 도전 하는 신생아 C57BL/6J 쥐의 생존 결과. 이 그림에 대 한 데이터는 여러 도전 복용량, 0.7에서 1.3 밀리 그램 그램 체중 당 cecal 슬러리에 이르기까지 이러한 마우스에 투여를 사용 하 여 독립적인 실험에서 결합 했다. (B) 신생아 쥐 한 cecal 슬러리 준비에서 0.80에서 0.95 밀리 그램 그램 체중 당 cecal 슬러리의 도전 주어진 cecal 슬러리의 양과 생존의 비율 사이 복용량 의존 관계를 표시 합니다. (C) 도전의 시간에서 체중의 20% 감소를 나타내는 점선으로 도전 무게에 비해 무게에 있는 변화의 비율. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig2.jpg"> 그림 2 :-80 ° C에 저장 하는 cecal 슬러리 재고 CFU 농도 6 개월 기간 동안 변경 되지 않습니다. CFU 농도에 cecal 슬러리 나이의 효과 선형 회귀를 사용 하 여 테스트 했습니다. 각 포인트는 같은 cecal 슬러리 준비, 순차적으로 희석 하 고 6 개월 동안 도금의 한 약 수를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig3.jpg"> 그림 3 : 이동성 종류 스스로 오른쪽에 실패 하는 쥐의 및 postchallenge 시간 다양 한에서 동물성 행동의 엉덩이. 그들의 뒤에 배치 하면 패 혈 증과 도전을 받고 있다 쥐 엉덩이 움직임의 정도 의해 측정 될 수 있는 병의 징후를 표시 됩니다. 오른쪽 (FTR) (A) A 실패-모바일 마우스 수평에서 90도 각도 초과 하는 그들의 위 다리의 엉덩이 흔드는 움직임을 보여줍니다. (B)는 FTR-기 면 마우스 쇼 엉덩이 운동 락 하지만 가로 4 기간 동안 어떤 시점에서 90도 각도 초과 하지 않는 모니터링의 s. (C) 일부 FTR-Nonmobile 마우스는 무릎에 구 부리는 그들의 다리를 확장할 것입니다 하지만 운동과 다리 락 0 엉덩이에 아주 작은 (미만 10 ° 각도) 표시 됩니다 서로 평행 하 게 유지 됩니다. (D) 동물 행동 12 월 21 일 h postchallenge 쇼 FTR Nonmobile 행동만 nonsurvivors에서 생존자를 분리 합니다. (E)에서 48 h postchallenge 21, 592 관찰된 FTR 동작 (0.67%)으로 4만 생존자는 righting 허용에 속하는 최종 결과 예측 하 고 자비 롭 끝점에 대 한 새로운 표준으로 사용 하는 반사. (F) 넘어 48 h 바람직합니다, 6 중 131 쥐 (4.55%)을 righting 반사 FTR 그룹의 일부가 될에 갔다 고 복구의 과정을 통해 지속적인 모니터링을 정당화 하는 실험의 끝에 의해 희생 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig4.jpg"> 그림 4 : 교육 리소스 독립적인 경험에 의해 정확한 행동 분류에 결과. 이 프로토콜을 동반 하는 비디오를 보면서 훈련 경험 다른 건강 그룹으로 60 신생아 쥐의 동영상 분류. (A) 인간적 끝점을 구별 하는 기능을 결정 했다 고 동작의 97%의 평균 정확 하 게 분류 되었다 FTR-Nonmobile로, FTR Nonmobile 쥐의 1%만 오인 했다 하는 동안. 쥐의 2% 거짓 FTR-Nonmobile로 확인 되었다. 올바르게 FTR 쥐 또는 그 능력 4 내 자신을 바로 하는 것 사이의 구별의 (B) 두 번째 인간적 끝점의 식별 표준 그들의 뒤에 배치 되 고의 s scorings, 동안 유일한의 97%에서 올바르게 할당 된 쥐의 0.96% 스스로 righting로 올바르게 할당 되었다 고 쥐의 2 %FTR 올바르게 할당 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>질병 단계</td>
			<td>A: 높은 사망률, 아니 사망률</td>
			<td>B: 높은 사망률, 낮은 사망률</td>
			<td>C: 높은 사망률, 높은 사망률</td>
			<td>D: 낮은 병 적 상태, 낮은 사망률</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간 게시 도전</td>
			<td>0−12</td>
			<td>12−20</td>
			<td>20−48</td>
			<td>&gt; 48</td>
		</tr>
<tr>
<td>주파수를 모니터링</td>
			<td>2 h 게시물 도전</td>
			<td>모든 4−6 h</td>
			<td>모든 4−6 h, 8h, 하룻밤 무인된</td>
			<td>1−2 시간 매일, 더 필요한 경우</td>
		</tr>
<tr>
<td>관찰 총 인간적 끝점의 비율</td>
			<td>0/144</td>
			<td>18/144</td>
			<td>116/144</td>
			<td>10/144</td>
		</tr>
<tr>
<td>관찰 하는 인간적 끝점의 비율</td>
			<td>0%</td>
			<td>12.5%</td>
			<td>80.5%</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">자비 롭 끝점 기준</td>
			<td colspan="2">1입니다. 양쪽에 FTR−Nonmobile</td>
			<td colspan="2">1입니다. 양쪽에 FTR−Nonmobile</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2. 둥지에서 뿌려 지 고 FTR−Lethargic은</td>
			<td colspan="2">2. 둥지에서 뿌려 지 고 FTR−Lethargic은</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">3. FTR 둘 다 왼쪽 또는 오른쪽에 (와 어떤 이동성 점수)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 질병의 다른 단계에서 모니터링 하 고 자비 롭 끝점 기준 주파수. 주파수를 모니터링, 인간적 끝점 관찰, 인간적 끝점 및 자비 롭 끝점 기준 비율 질병의 서로 다른 단계.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Righting 반사</td>
			<td>이동성</td>
			<td>바로 뒤에 배치 되 고 후에 시간 제한</td>
			<td>(모바일 / 기면증 / 비모바일) 운동의 측정 금액 시간 제한</td>
			<td>이동성 채 점 기준</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">권리</td>
			<td>모바일</td>
			<td rowspan="6">4 s</td>
			<td rowspan="3">추가 8 s</td>
			<td>마우스 앞으로 기세를 유지 하는 행의 여러 단계를 소요 하 고 그것의 환경 탐구. 강아지 떨어지지 않습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>기 면</td>
			<td>마우스 수 한 걸음 하지만 것입니다 중지 하 고 다른을 복용 하기 전에 일시 중지. 강아지가 있습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile</td>
			<td>마우스 자체를 righting 후 모든 단계를 고려 하지 않습니다. 강아지가 있습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">오른쪽에 실패</td>
			<td>모바일 엉덩이</td>
			<td rowspan="3">같은 4 righting 반사를 측정 하는 데 사용 하는 s</td>
			<td>4 시간 적어도 한 번 수평 90 ° 이상 회전 위쪽 다리와 엉덩이 운동 에너지는 s.</td>
		</tr>
<tr>
<td>기 면 엉덩이</td>
			<td>엉덩이 운동까지 하지만 수평에서 90 ° 저쪽에 아닙니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>비모바일 엉덩이</td>
			<td>팔 다리를 확장 및 축소 하 여 이동할 수 있습니다 하지만 엉덩이 회전 하지 않습니다. 강아지는 매우 병 약한 보인다.</td>
		</tr>
</tbody></table>테이블 2: 테이블 및 쥐의 건강 점수 결정 기준을 모니터링. 제공된 기준 마우스, 건강 카테고리 그룹을 정의 하 고 건강 점수 할당의 개별 차이 줄이기 위해 사용 되었다.

이 프로토콜 설정 하 고 평가 하는 신생아 패 혈 증 7-하루-오래 된 쥐에 필요한 단계를 제공 합니다.

신생아 Polymicrobial 패 혈 증에 대 한 제어 마우스 모델

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

poly균 패혈증을 위한 세칼 슬러리 모형은 독특한 신생아 병리 생리학을 해부하는 강력한 공구입니다. 변수가 될 수 있으며 인도적 끝점은 잘 설명되지 않습니다. 여기서 우리는 세칼 슬러리를 준비하고 실험 동물에 주입하기 위해 매우 표준화 된 절차를 제시합니다.또한 데이터 기반 접근 방식을 사용하여 가능한 한 빨리 moribund 새끼를 식별합니다. 먼저 냉동 세칼 슬러리 스톡을 준비합시다. 이것은 적어도 5 명의 성인 마우스에서 세칼 콘센트를 풀링하고, 멸균 덱스트로스 물에 중단하고, 나중에 사용하기 위해 마이너스 80에서 저장하여 수행됩니다.당신은 남성 또는 여성을 사용할 수 있습니다, 하지만 섹스, 나이, 당신의 실험에 대 한 마우스의 배경 일정 유지 해야. 먼저, 해부를 위해 도구를 준비합시다. 여기에는 피부를 위한 가위와 집게 세트와 내부 장기를 위한 두 번째 세트가 포함됩니다.사용 30분 전에 뜨거운 비드 소독제를 켭니다. 공구를 70%에 담근 다음 뜨거운 비드 소독기에 1분 이상 담급드세요. 70%에탄올로 종이 타월 매트를 뿌린 다음 공구의 멸균 된 부분을 다른 도구의 멸균 되지 않는 손잡이에 건드리지 않고 소독기에서 도구를 제거합니다.식히기 위해 종이 타월에 놓습니다. 생물학적 안전 캐비닛에 마우스를 해부합니다. 마우스의 다리를 23 게이지 바늘을 사용하여 스티로폼 보드에 고정하여 마우스가 복부를 위로 합니다.70%에탄올로 복부를 스프레이합니다. 멸균 집게와 가위를 사용하여 피부를 잘라 가위로 간막 안감에서 피부를 느슨하게하고 사타구니에서 흉골과 왼쪽에서 오른쪽으로 직사각형 영역을 엽니 다. 복막 주위의 털을 제거합니다.복막을 잘라 멸균 도구의 새로운 쌍으로 전환, 또한 직사각형 개방을 만들기. 신체를 가로 질러 오른쪽으로 왼쪽으로 실행해야하는 cecum을 식별합니다. 내관 에서 cecum 가지를 식별 하 고 창 자에서 멀리 cecum을 잘라 결합 조직을 중단.살균된 계량 용지에 놓습니다. 멸균 도구를 사용하여, cecum의 양쪽 끝을 잘라. 집게로 cecum의 중간을 잡고 평평한 금속 주걱을 사용하여 롤링 모션을 사용하여 cecal 내용물을 끝에서 부드럽게 밀어 냅니다.콘텐츠를 수집하고 미리 계량된 15밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 최대 5마리의 마우스에서 동일한 튜브로 세칼 함량을 풀. 모든 내용이 추가되면 튜브의 가중치를 다시 사용합니다.각 튜브의 세칼 함량에 추가하는 덱스트로스 수의 양을 계산하려면 밀리리터당 밀리그램으로 원하는 농도로 튜브내 의 세칼 함량의 무게를 나눕니다. 세칼 내용물의 재정지를 위해 덱스트로스 물의 알리쿼트가 얼음 위에 보관하십시오. 세칼 함량을 포함하는 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 필요한 양의 덱스트로스 물을 추가합니다.튜브를 수직 및 수평으로 약 30초 동안 소용돌이시다. 직경이 몇 밀리미터 이상 미립자의 존재를 관찰하고, 존재하는 경우, 모든 미립자가 눈에 띄게 사라질 때까지 소용돌이를 계속합니다. 50 밀리리터 원심분리기를 얼음 위에 놓고 여과물을 수집하고 멸균 70 마이크로미터 세포 여과기를 위에 설치합니다.파이펫 4 밀리리터는 세포 스트레이너를 통해 수집 튜브에 15 밀리리터 튜브에서 다시 중단 된 슬러리. 2~3회 위아래로 피펫을 하여 미립자를 다시 중단합니다. 더 이상 액체가 여과되지 않을 때까지 파이펫 끝으로 내용을 교반하는 동안 부드럽게 거품을 돌출하여 필터링 속도를 증가시킵니다.이 정도는 약 30초가 소요됩니다. 세칼 슬러리의 각 튜브 사이에 세포 스트레이너를 변경하지만 모든 내용내용을 동일한 50 밀리리터 수집 튜브로 풀을 냅니다. 재고가 40 밀리리터를 초과하면 15초 동안 소용돌이를 가하고 20밀리리터를 새로운 원심분리기 튜브에 넣습니다.슬러리를 각각 500 마이크로리터 알리코의 극저온 바이알로 나눕니다. 세 개의 바이알 마다 슬러리를 소용돌이. 얼음에 바이알에 마스터 스톡을 유지합니다.알리쿼트를 마이너스 80에 저장함으로써, 세칼 슬러리 제제에 에어로빅 콜로니 형성 단위 농도는 6개월 동안 변하지 않는다. 이제 세칼 슬러리가 준비되었으므로, 우리는 체중 조절 용량의 세칼 슬러리로 7~8일 된 쥐의 쓰레기에 도전하는 데 사용할 수 있습니다. 슬러리의 치사성은 복용량에 따라 달라집니다.새로운 용량 적정으로 모든 새로운 주식에 대한 시설에서 원하는 치명적인 복용량을 결정해야합니다. 1 개의 세칼 슬러리 주입 알리쿼트는 쓰레기 당 준비됩니다. 우리는 100 마이크로 리터 부피로 접종을 정상화하고, 쓰레기에 있는 각 동물에 대해 가장 가까운 10 마이크로 리터로 반올림합니다.도전 알리쿼트에 도전 을 준비하는 것은 세 가지 계산이 필요합니다, 필요한 슬러리 재고의 볼륨, 덱스트로스 물의 추가 볼륨, 그리고 쓰레기의 각 새끼에 대한 둥근 볼륨. 각 계산을 수행하는 방법에 대한 세부 정보는 프로토콜의 섹션 3에서 찾을 수 있습니다. 모든 실험에 대해 이러한 계산을 수행하면 시간이 많이 소요될 수 있으며 실험 오류에 기여할 수 있으므로 스프레드시트는 재고 농도, 원하는 용량 및 쓰레기의 무게를 입력하는 프로토콜과 함께 다운로드할 수 있으며 슬러리 재고의 양, 덱스트로스 워터의 양 및 새끼 당 실제 볼륨이 자동으로 반환됩니다.이 시트를 인쇄하고 동물에 도전할 준비가 되면 함께 가져갈 수 있습니다. 생물학적 안전 캐비닛에 주사 알리쿼트를 준비하고 얼음위에 보관하십시오. 주사기를 로드하기 전에 마이크로 센심 분리기 튜브를 20 번 가볍게 섞습니다.새끼는 28 게이지 인슐린 주사기로 도전한다. 슬러리를 그리기 전에, 영감을 하고 마이크로 센심 분리기 튜브 안팎에서 도전 알리쿼트의 300 ~ 500 마이크로 리터를 배출하여 알리쿼트를 혼합합니다. 그런 다음, 도전 알리 쿼트의 약 150 마이크로 리터를 그립니다.이것은 어떤 7 8 일 오래 된 강아지에 대 한 주사 볼륨 보다 더 큰 해야 합니다. 주사기를 쓸어 떨어 세면에서 플런저에서 거품을 빼내고 주사기에 약간 다시 그려기 위해 기포를 추방합니다. 이 과정에서 바늘이나 플런저 샤프트를 만지지 마십시오.마우스에 대한 계산된 양의 세칼 슬러리가 주사기에 로드될 때까지 과량의 세칼 슬러리를 마이크로센심분리기 튜브에 다시 분배합니다. 세칼 슬러리는 복막 주사로 투여된다. 동물 보호 기관의 프로토콜에 따라 수행하십시오.누출을 최소화하기 위해 새끼를 아래쪽으로 기울여 다리와 생식기 사이에 바늘을 삽입하여 바늘을 얕고 피하상태로 유지합니다. 약 1센티미터에 대한 바늘을 삽입 한 후, 바늘이 심폐 소에 구멍을 느낄 때까지 아래쪽으로 누르고 앞으로, 다음 천천히 플런저를 우울. 당신이 들어갔을 때와 같은 경로를 따라 조심스럽게 바늘을 철회하고, 당신이 그렇게할 때 가운데 손가락을 이완시하십시오.실험실 노트북의 누출을 기록하고 최종 결과에서 상당한 누출이있는 동물을 생략하는 것이 좋습니다. 이 섹션에서 우리는 우리가 다편성 패혈증과 그들의 해당 인도적인 끝점으로 도전마우스에서 관찰하는 건강의 다른 수준을 설명합니다. 신생아 마우스와 관련된 모든 절차에 대해 침구 재료를 새 케이지로 옮기습니다.이것은 당신의 장갑에 여자의 냄새를 전송하고 그녀의 케이지에 반복 입력에서 여자의 스트레스를 줄일 수 있습니다. 우리는 새로운 케이지에 두 번째 둥지를 만들어 전체 쓰레기가 여자의 우리에 반환 할 준비가 될 때 절차 또는 모니터링이 끝날 때까지 모니터링 된 새끼를 개최합니다. 마우스를 뒷면에 놓고 4초 이내에 바로 사용할 수 있도록 모니터합니다.맞을 수 있다면 8초 더 기다렸다가 이동성 수준을 결정합니다. 도전하지 않거나 복구하는 마우스는 여러 단계를 연속으로 수행하여 해당 환경을 바로 탐색할 수 있습니다. 자신을 바로 잡을 수있는 마우스를 다시 그룹화하고 권리 무기력으로 환경을 탐구하기 위해 몇 가지 단계를 수행.이 마우스는 단계를 복용 하는 동안 넘어질 수 있습니다 하 고 그들의 발에 흔들리는 보이는. 오른쪽에서 우측할 수 없는 마우스는 수평으로부터 90도를 초과하는 엉덩이 움직임을 가지며, 우측 이동에 실패하여 그룹화합니다. 이 마우스는 결국 오른쪽으로 하지만 4 초 이내에 할 수 없습니다.엉덩이 움직임 때문에 오른쪽 모바일에 실패로 그룹화됩니다. 오른쪽에서 오른쪽과 수평에서 90도 이하 엉덩이 움직임을 가지고 새끼는 오른쪽 무기력에 실패로 그룹화된다. 이것은 엉덩이가 수평에서 90도를 초과하지 않고 오른쪽 무기력에 실패로 그룹화되는 마우스의 또 다른 예입니다.오른쪽 비 이동 강아지에 실패 흔들거나 진동 하지만 엉덩이 움직임이 없는 다리를 가질 것 이다. 사지는 연장및 후퇴할 수 있지만 측면 이동이 없습니다. 강아지는 눈에 띄게 아프고 인도적 종점에 도달했습니다.이것은 오른쪽 비 모바일 강아지에 실패의 또 다른 예입니다. 엉덩이는 왼쪽에서 오른쪽으로 흔들리지 않지만 발은 진동합니다. 여자의 새장을 다룰 때, 새끼는 간호 여자가 실행하는 경우 둥지밖으로 드래그 할 수 있습니다.우리는 이것을 교체한 다음 둥지 에서 멀리 떨어진 다른 흩어진 새끼를 확인합니다. 흩어진 새끼들이 무기력하게 맞지 않으면 인도적인 끝에 있습니다. 패혈증 모델의 카플란 마이어 서바이벌 곡선은 다음과 같습니다.모니터링 시간 점은 연결된 SOP에서 찾을 수 있습니다. 마우스가 오른쪽 비 이동에 실패하는 것으로 판명되면 생존 곡선을 따라 어느 시점에서, 그것은 인도적 종점에 안락사. 12 시간에서 21 시간 사이, 마우스는 아프게 나타나고 마우스의 대략 반은 한쪽에 바로 수 있을 것입니다, 다른 반은 그들의 측의 양쪽에 바로 실패하는 동안.이것은 마우스가 건강 점수에 있는 digress를 시작하고 오른쪽 비 이동에 실패의 인도적인 종점에 도달하는 기간입니다. 이들은 이 기간에 관찰된 건강 점수의 대표적인 결과입니다. 생존자와 비 생존자 그룹은 건강 점수에 따라이 시점에서 차별화 할 수 없습니다.질병의이 단계에서, 21 48 시간 도전 후, 우리는 인도적 종점의 가장 높은 비율을 관찰. 우리는 또한 양측에 바로 잡을 수 없는 마우스의 대다수가 질병에서 회복되지 않을 것이라는 점을 관찰했습니다, 따라서 오른쪽 비이동 기준에 실패 이외에 인도적인 종점에 대한 새로운 기준이 됩니다. 질병의이 단계에서 관찰 된 건강 점수는 비 생존자에서 생존자의 분리 결과.양쪽에서 바로 할 수없는 마우스의 대다수는 질병에서 회복되지 않았다. 이 데이터는 도전 후 21시간부터 시작되는 인도적 종말점에 대한 새로운 기준이 양측모두에 제대로 맞지 않는 모든 쥐를 안락사시키는 것이어야 한다는 것을 뒷받침합니다. 48 시간 이상 도전 후 많은 마우스는 더 많은 활동과 더 나은 오른쪽 반사를 표시하기 시작합니다.인도적 종점의 비율이 이 기간에 더 낮더라도, 마우스는 아직도 더 이상 파고 들고 아프게 될 수 있고, 인간적인 끝점에 대한 감시가 필요합니다. 이 기간 동안, 결국 비 생존자로 그룹화 된 그 마우스중 일부는 한 지점에서 증가 활동을 표시했지만 나중에 악화하고 인도적 종점에 도달했습니다. 이것은 더 나쁜 건강 결과를 표시하기 시작하면 증가된 주파수를 가진 아픈 동물의 지속적인 감시를 필요로 합니다.대면 교육을 받지 못하고 이 교육 용 비디오만 관찰한 독립 실험자는 녹화된 테스트 비디오를 사용하여 조사자와 동일한 점수를 할당하는 능력으로 테스트되었습니다. 이 교육 비디오는 정확한 행동 분류를 초래합니다. 인도적 종점의 척도인 오른쪽 비이동 신생아 마우스에 실패하는 올바른 점수를 할당하는 능력은 60마리의 신생아 마우스 중에서 결정되었으며, 평균 97%의 행동이 정확하게 구별되었으며, 3%만이 잘못 식별되었다.다음으로, 오른쪽에 실패하거나 4초 이내에 바로 할 수 있었던 신생아 마우스를 구별하는 능력이 시험되었다. 이것은 인도적인 끝점의 또 다른 측정이고 정확하게 신생아 마우스의 97%에 할당된 반면, 새끼의 3%는 권리로 잘못 할당되었습니다. 다음은 도전 의 시간에 비해 마우스의 퍼센트 체중 변화에 대한 대표적인 결과입니다.생존자와 비 생존자 사이의 평균 체중 변화는 도전 후 24 시간에서 분리되기 시작했지만 그룹 사이에는 많은 중복이 있습니다. 20% 이상 체중을 잃었지만 여전히 질병에서 회복된 생존자도 있었습니다. 체중 변화는 마우스가 인도적 종점에 있는지 여부를 결정하는 기준으로 사용되지 않는 이유인 건강 점수의 차이와 비교하여 결과를 예측하는 데 효율적이지 않았습니다.결론을 내리기 위해, 당신은 지금 냉동 세칼 슬러리의 주식을 준비 할 수 있어야합니다, 무게 조정 복용량을 계산. 그리고 인간적인 끝점에 대한 신생아 마우스를 주입하고 모니터링합니다. 우리는이것이 당신의 마우스 연구를위한 귀중한 자원이 될 수 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Seman, B. G. 외 그람 음성 세균성 패혈증의 신생아 영상 모델. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 캡슐화된 생물발광 박테리아를 이용한 신생아 마우스 모델을 시연하여 전신 감염을 연구합니다. 신생아 새끼들은 고용량 또는 저용량 박테리아 현탁액을 주사한 후 산후 관리를 위해 어미에게 돌려보냅니다. 캡슐화된 박테리아는 조기 면역 검출을 피하고 전신적으로 퍼지며, 발광 영상을 통해 시간이 지남에 따라 시각화됩니다. 이 모델은 신생아 쥐에서 감염 진행을 비침습적으로 추적할 수 있게 합니다.

캡슐화된 생물발광 박테리아를 이용한 신생아 쥐 감염 모델링

여기에, 절차는 대장균 K1의 문화와 신생아 쥐에 전신 감염의 설립을 설명합니다. 이것은 비 침습성 절차 맥락총에서 위장관 식민 전신 순환에 병원균의 전위, 및 중추 신경계의 침입을 허용한다.

Neuropathogenic의 비 침습 모델 대장균 신생아 쥐에 감염

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

이 연구는 gavaging 정확한 양의 신생아 쥐에 probiotics의 과정을 자세히 설명합니다. 실험 설정 포함 하도록 최적화 되었다 하지만 probiotic 주입, 관리의 방법 및 내장에 있는 박테리아의 정량화에 국한 되지 않습니다.

Gavage를 사용 하 여 신생아 쥐에 있는 Probiotic 연구

우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

생체 발광 대장균 O1:K1:H7을 가진 신생아 마우스의 감염은 중요한 폐 염증 및 폐 병리를 가진 패혈증 감염을 초래합니다. 여기서는 전신 세균성 부담, 염증 성 프로파일링 및 폐 조직 병리학의 열거와 병행하여 세로 내 인트라비셔널 이미징을 사용하여 신생아 패혈증을 모델링하고 추가로 연구하는 절차를 설명합니다.

그람 음성 세균 패혈증의 신생아 화상 진찰 모형

괴사 장염 (NEC)은 미숙아, 특히 매우 낮은 출생 체중 유아에서 자주 발생하는 가장 심각한 위장 (GI) 질병이며 사망률이 높고 불분명한 병인. NEC의 원인은 염증성 면역 규제 시스템 이상과 관련이 있을 수 있습니다. NEC 동물 모델은 NEC 질병 면역 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 동물 모델은 일반적으로 C57BL/6J 신생아 마우스를 사용; BALB/c 신생아 마우스는 거의 사용되지 않습니다. 관련 연구는 마우스가 감염될 때, Th2 세포 분화는 C57BL/6J 마우스에 비해 BALB/c 마우스에서 우세하다는 것을 보여주었습니다. 연구 결과는 NEC의 발생 그리고 발달이 T 도우미 타입 2 (Th2) 세포의 증가와 연관되고 일반적으로 감염을 동반한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 본 연구는 신생아 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC를 가진 아이들에서 관찰된 것과 유사한 임상 적 특성 및 장 병병리학적 변화를 가진 NEC 모델을 유도하였다. 추가 연구는 이 동물...

괴사 장염의 신생아 BALB/c 마우스 모델

조산(37주 분만)은 최적이 아닌 예방 및 치료 옵션이 있는 긴급한 글로벌 건강 문제&lt; 있습니다. 우리는 상행 질 세균 감염으로 인한 조산의 마우스 모델을 제시하고 그 결과 신생아 이환율과 사망률을 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

마우스의 상승하는 질 감염, 조산 및 신생아 이환율 모델링

이 프로토콜은 괴사성 소장결장염(NEC)의 신생아 마우스 모델 및 신생아 쥐 소장에서 고유판 면역 세포의 후속 분리를 설명합니다.

면역 세포 프로파일링을 위한 괴사성 소장결장염 및 Lamina Propria 분리의 신생아 마우스 모델

콜론은 (CASP) 복막염 스텐트은 설치류에 polymicrobial 복부 패혈증에 대한 높은 표준 모델입니다 Ascendens. 이 문서는 CASP의 수술에 대해 설명합니다. CASP 모델 및 그 변종은 패혈증의 주제에 관한 다양한 문제의 체계적인 조사를 허용합니다.

콜론은 (CASP) 복막염 스텐트 Ascendens - Polymicrobial 복부 패혈증에 대한 표준 모델

배우세요 신생아 패혈증 연구를 위한 cecal slurry 모델 제작 및 마우스 투여법. 표준화된 절차와 데이터 기반 안락사 종점 판정법으로 재현성 있는 실험 결과를 얻을 수 있습니다.

신생아 Polymicrobial 패 혈 증에 대 한 제어 마우스 모델

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