Name: Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 학습하세요 항체 매개 타우 단백질 섭취를 정량화하는 BV-2 소교세포 기반 분석법을 통해 알츠하이머병 치료 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 Fc 수용체 매개 내재화 과정을 규명하는 데 활용됩니다.

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우리는 그의 귀중 한 기술 지원을 알베르토 Carpinteiro Soares 감사 하 고 싶습니다.

1. BV-2 셀 문화
참고: 핸들 BV-2 셀 Biosafety 수준 2 포함에서. BV-2 셀 라인 생산는 엔벌로프된 재조합 ecotropic 레트로 바이러스 (murine 세포만 감염 가능)12. 이러한 바이러스는 그들의 생체 외에서 vivo에서 tumorigenic 잠재력과 능력에 대 한 알려져 있다.
<ol><li>높은 포도 당 Dulbecco의 문화 BV-2 셀이 글 중간 (DMEM) 4 x 104 셀 시드 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스와 2 mM L-글루타민 (라고도 자란 매체에서)와 보완 수정 셀/mL.</li>
	<li>37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 문화를 유지 참고: 셀 성장 느슨하게 연결 된 서 스 펜 션에.</li>
</ol>2. 레이블 재조합 타우 집계 pH에 민감한 형광 염료
참고: 타우 집계 Apetri 외 에 설명 된 대로 준비 했다 13 차이 없음 Thioflavin T (ThT) 반응 버퍼에 추가 되었습니다. 집계 된 샘플은 원심 분리기 튜브 1.5 mL에서에서 수집 되었습니다. 최종 형광 신호를 50 µ M ThT 솔루션의 12 µ L로 풀 샘플의 118 µ L를 혼합 하 여 확인 했다. 집계에서 20000 x g 1 h 4 ° c.에 대 한 집계 반응 혼합물 centrifuging 구분 했다 상쾌한 초-MALS 모든 단위체 타우 집계로 변환 되었습니다 확인 하 여 분석 했다. 펠 릿 (타우 집계) 스냅 냉동 고-80 ° c.에 냉동 고에 저장 되었다
<ol><li>1 mg/mL의 농도에 pH 8.5에서 타우 집계 0.1 M 탄산 버퍼 (NaHCO3)에서 resuspend (~ 20 µ M). 참고: 타우의 농도 280에서 타우 단위체의 흡수에 의해 평가 초기 단위체 농도에 따라은 nm 0.31 mLmg-1c m-1의 소 광 계수를 사용 하 여.</li>
	<li>과열을 피하기 위해 얼음에 유지 하는 동안 프로브 sonicator를 사용 하 여 resuspended 집계 sonicate<ol>
<li>(전력 250 W sonicator)와 65%의 진폭을 사용 합니다.</li>
		<li>3의 8 펄스 수행 s 15의 일시 중지로 과열 방지를 위해 펄스 사이 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 제조업체의 명령 다음에 pH에 민감한 염료 (이제부터 참조 pH 염료로)의 8.9 m m 재고 솔루션을 준비 합니다. 참고: 항상 새로운 솔루션을 준비 하 고 그것은 준비 하는 날에만 그것을 사용 하 여.</li>
	<li>0.2 m m의 최종 염료 농도에 단백질의 두더지 당 염료의 10 두더지를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>실내 온도, 빛에서 보호에 45-60 분에 대 한 반응 혼합물을 품 어.</li>
	<li>한편, 제조업체의 지침에 따라 열 담 복사해올된 dextran 젤 조립.</li>
	<li>25 mL의 0.1 M NaHCO3 버퍼 pH 8.5 포함 3 %DMSO 열 equilibrate 삭제를 통해 흐름.</li>
	<li>타우 집계 라벨 2.5 mL의 총 볼륨에 열에 반응의 제품을 추가 합니다. 샘플은 2.5 mL 미만, 2.5 mL의 총 볼륨 달성 될 때까지 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>샘플 포장된 젤을 완전히 입력, 흐름을 통해 삭제 하자.</li>
	<li>0.1 m M NaHCO3 버퍼 pH 8.5 포함 3 %DMSO 3.5 mL와 함께 elute 고 4 해당 분수 2 mL 튜브에에서 eluate 수집 합니다.</li>
	<li>Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 의해 4 분수의 단백질 농도 결정 합니다.</li>
	<li>-20 ° C 냉장고에 레이블이 지정 된 단백질을 저장 합니다.</li>
</ol>3. 통풍 관 분석 결과 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 읽기
<ol><li>
제 1 일 – 씨 셀
	<ol>
<li>워시 BV-2 세포 배양 매체 및 추가 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x를 제거 하 여 플라스 크에. 참고: 사용 하는 셀 플라스 크의 크기에 따라 달라 집니다 볼륨을 세척. 예를 들어 T175 플라스 크에 대 한 1 x PBS의 10 mL로 씻어.</li>
		<li>플라스 크에서 PBS를 제거 하 고 세포를 플라스 크 (약 5 분)에서 분리 될 때까지 트립 신-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 0.05%에서 37 ° C, 5% CO2 배양 하 여 세포를 분리. 참고: 트립 신-EDTA 0.05%의 볼륨 사용 셀 플라스 크의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어 T175 플라스 크에 대 한 트립 신-EDTA 0.05%의 2 개 mL를 사용 합니다.</li>
		<li>3-5 번 위아래로 pipetting으로 매체를 경작에 셀 resuspend 주: 매체를 경작의 볼륨 사용 셀 플라스 크의 크기 및 따라서 플라스 크에 세포의 총 수에 따라 다릅니다. 예를 들어 T175 플라스 크 배양 매체의 8 mL 사용.</li>
		<li>셀 하 고 200 μ g/mL 헤 파 린을 포함 하는 문화 매체에 1 x 105 셀/mL의 최종 농도와 세포 현 탁 액을 만듭니다.</li>
		<li>세포 현 탁 액 (2.5 x 104 셀) 당 96 잘 조직 문화 플랫 바닥 접시에 잘의 250 µ L 플레이트.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 플레이트를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제 1 일 – 준비 Immunocomplexes
	<ol>
<li>PH 염료-타우 얼음에 녹여</li>
		<li>혈 청 무료 매체 (SFM) (높은 포도 당 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스와 200 µ g/mL 헤 파 린 보충 DMEM)에 염료-타우 집계 pH의 500 nM 솔루션의 조건 당 65 μ를 준비 합니다.</li>
		<li>항 체 희석 65 µ l에 SFM의 고 농도에 마지막 한 두 번 준비 합니다. 믹스 pH 염료-타우 집계, 96-잘 u-하단 플레이트에 항 체. 마지막 볼륨 상태 당 지금 130 µ l 이며 pH 염료-타우 집계 농도 250 nM. 희석 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제 2 일 – Immunocomplexes 통풍 관
	<ol>
<li>BV-2 세포에서 자란 매체를 제거 합니다. 셀 100 µ L 실내 온도 1 x PBS로 한 번 씻는 다.</li>
		<li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀에 immunocomplexes의 125 µ L를 전송 합니다. 2 h 37 ° C, 5% CO2에 대 한 immunocomplexes 셀을 품 어.</li>
		<li>셀에서 인큐베이션 매체를 제거 하 고 그것을 폐기. 셀 100 µ L 실내 온도 1 x PBS로 한 번 씻는 다.</li>
		<li>1 x PBS를 제거 하 고 치료 셀 50 µ L 37 ° C에서 20 분에 대 한 트립 신-EDTA 0.25%와 5 %CO2.
</li>
		<li>자란 매체의 200 µ L을 추가 하 고 셀을 분리 하려면 아래로 pipetting에 의해 잘 resuspend. 96-잘 U-아래쪽 셀 전송 접시. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 플레이트</li>
		<li>얼음에 접시를 넣어, 150 µ L 얼음 감기 1 x PBS에 셀 알 약 resuspending에 의해 두 번 매체 및 세척 세포 배양을 제거 합니다. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 플레이트</li>
		<li>얼음에 셀, PBS와 resuspending에 의해 그들 150 µ L 찬 FACS 버퍼 (1 x PBS, 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 2 mM EDTA) 펠 릿 세포 세척 추가 1 제거. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 플레이트</li>
		<li>얼음에 셀을 넣어, 추가 FACS 버퍼를 제거 하 고 셀 200 µ L 찬 FACS 버퍼에 resuspend.</li>
		<li>2 × 104 이벤트 라이브 셀 게이트에서 인수 FACS에 의해 즉시 샘플을 분석 (단계 4.1 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. FACS 분석
참고: 제어 전략에 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.
<ol><li>앞으로 분산형 영역을 사용 하 여 (FSC-A) 쪽 지역 (SSC-A) 밀도 점도, 낮은 앞으로 분산형 수준 (즉, 파편 및 죽은 세포)와 함께 이벤트를 제외 하 여 라이브 셀에 게이트 대.</li>
	<li>사용 하 여 살아있는 세포 인구 FSC-A 앞으로 살포 높이 (FSC-H) 셀 남자 및 집계 제외 하 대. 이것은 내의 게이트 이다.</li>
	<li>이벤트를 사용 하 여 내의 게이트, pH 염료 단일 매개 변수 히스토그램을 생성 합니다.</li>
	<li>말은 형광 강도 결정 합니다. 로 부정적인 셀을 제외 하 여 pH 염료-타우 긍정적인 세포의 비율 결정 BV-2만 컨트롤을 사용 하 여 결정 합니다.</li>
</ol>5. Immunocomplexes 현미경 읽기와 이해
<ol><li>
제 1 일 – 씨 셀
	<ol>
<li>3.1.1 3.1.2, 3.1.3 단계에 설명 된 대로 BV-2 셀을 준비 합니다.</li>
		<li>셀의 개수 및 매체 104 셀/mL의 최종 농도에 경작에 그들을 resuspend.</li>
		<li>세포 현 탁 액의 150 µ L 플레이트 (1.5 x 103) 폴 리-D-리 신에 잘 당 96 잘 검정 분판으로 분명 평면 바닥 코팅.</li>
		<li>48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제 3 일 – 준비 Immunocomplexes 참고: 이전에 항 체를 가진 외피 이라는 타우의 가벼운 쥡니다 현미경 결과 개선 하기 위해 수행 되었다.<ol>
<li>PH 염료-타우 얼음에 녹여 고 프로브 sonicator를 사용 하 여 얼음에 유지 하면서 sonicate. 15% (250 W의 sonicator 힘)의 진폭을 사용 합니다. 2 s와 펄스 사이 대기 20 s 30 펄스를 수행.</li>
		<li>SFM에 pH 염료-타우의 500 nM 솔루션의 조건 당 65 μ를 준비 합니다.</li>
		<li>마지막 한 두 배 농도에 SFM의 65 µ l에 항 체 희석. 믹스 pH 염료-타우 집계, 96-잘 u-하단 플레이트에 항 체. 마지막 볼륨 상태 당 지금 130 µ l 이며 pH 염료-타우 집계 농도 250 nM. 희석 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>셀 접시에서 매체를 제거 하 고 자란 매체 200 µ g/mL 헤 파 린으로 보충의 150 µ L를 바꿉니다. 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 플레이트를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제 4 일-Immunocomplexes 통풍 관
	<ol>
<li>BV-2 세포에서 자란 매체를 제거 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀에 immunocomplexes의 125 µ L를 전송 합니다.</li>
		<li>1 h 45 분 5% CO2와 37 ° C에서 immunocomplexes 셀을 품 어. 세포 핵 DNA 특정 염료와와 산 성 세포는 프로브는 낮은 pH 세포 구획을 선택적으로 얼룩 얼룩. 셀 5% CO2와 37 ° C에서 15 분을 품 어. 참고: SFM에 염료 희석.</li>
		<li>라이브 셀 이미징 사용 하 여 높은 콘텐츠 confocal 시스템 심사를 수행 합니다. 37 ° C, 5% CO2온도 설정 합니다. 높은 품질의 이미지에 대 한 63 X 물 침수 목표를 사용 하 고 이미지 필드 당 0.5 µ m 평면 (Z-스택 당 20) 취득.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Microglia, 거주 뇌의 면역 세포, 항 체 중재 치료 접근 tauopathies10,11에 대 한 중요 한 선수로 최근 확인 되었습니다. Microglia 차단 신경 통풍 관9, 억제 또는 fibril 형성13,14 의 불안 및 intraneuronal 소 통해 의 클리어런스는 lysosomal 함께 의해 항 체 중재 타우 클리어런스 통로15, 모든 tauopathy5,6,7,,89의 마우스 모델에서 안티 타우 항 체 효능에 기여할 수 있습니다.
우리 여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.
이 분석 결과, 펑크 외. 에서 적응 11, 불멸 하 게 murine microglial 셀 BV-2 세포를 사용 합니다. 그들은 완전히 기본 microglial 셀에 비교 될 수 없다, 그러나 그들은 많은 기능이 기본 microglia 특성의 Aβ와 타우 소11,,1617 phagocytose 견고의 기능을 포함 하 여 ,1819. 또한, 그들은를 재현할 동작에서 보여주었다 생체 외에서 분석 결과 개발 및 최소한의 실험적인 변화를 요구 하는 양적 연구에 매우 적합 한 그들을 만든. 이 옆에 불멸 하 게 셀 라인 높은 분석 결과 처리량을 허용 하 고 기본 microglia의 사용에 비해 동물 희생에 대 한 필요성을 제거.
우리는이 분석 결과에서 사용 하는 타우 집계 높은 재현성 생체 외에서 집계 설명 하는 절차는 우리가 최근13및 쇼에 유사한 형태학 짝 나선형 필 라 멘 트 (PHFs) 광고의 두뇌에서 격리를 사용 하 여 얻은 했다 환자입니다. 우리 타우 집계 준수 플라스틱이 나 유리 표면에 의해 발생 했을 수 있습니다 어떤 예기치 않은 결과 관찰 하지 않았다, 그러나 안정적이 고 잘 특징이 타우 집계를 사용 하 여가 분석이 결과의 재현성에 중요 한 역할을 했다.
또 다른 측면을 크게 시험의 재현성은 셀 밀도. 프로토콜에서 설명 잘 당 셀의 숫자 설명된 조건에서 최적의 셀 밀도를 나타냅니다.
다르게 무엇 보다 펑크 외. 11 설명, 우리가 분류는 크게 산 성 세포에서 국제화에는 형광 증가 pH 민감한 염료와 타우 집계 되므로 세포내 정량화에 대 한. 이, 표면의 트립 신 소화 함께 immunocomplexes 및 타우, 보장 그 형광 신호 측정 cytometry 타우 이해 보다는 세포 표면에 바인딩의 결과 이다. 또한, pH 민감한 염료 부드럽게 표면 소화의 필요성 없이 현미경 실험에서 내 면된 타우의 탐지 바인딩된 다음 것이 immunocomplexes/타우 집계를 사용 하 여 셀이 다시 도금 및 복구 필요 합니다.
우리는 또한 더 설명된11했던 이전에 비해, 우리의 분석 결과의 현미경 읽기 최적화, 산 성 세포는 안 봐도 우리의 현미경 실험에 대 한 매우 선택적인 염료를 사용 하 여 확인 하는 유일한 항 체-중재 타우 통풍 관, 아니라 endolysosomal 구획에 타우의 지역화.
우리가 개발 하 고, 분석 결과 긍정적이 고 부정적인 샘플 사이 강한 별거를 허용 하는 좋은 실험 창 최적의 특이성이 있다. 흥미롭게도, 분석 결과 직접 감지 하지 따라서 안티 타우 항 체 효과 기 기능을 공부 하는 강력한 도구를 대표 하는 항 체 선호도에 차이.

Alzheimer의 질병 (광고)은 병 적인 집계에 아 밀 로이드 β 펩 티 드와 타우 단백질의 구조적 변화에 의해 및 자기 조립 특징 진보적인 신경 퇴행 성 조건. 비정상적으로 phosphorylated 타우 올리고 neurofibrillary tangles1,2로 축적 하는 동안 정상적인 성 아 밀 로이드 β 펩 티 드 oligomeric 및 원 아 밀 로이드 β로 변환 됩니다. 이러한 단백질 집계 발생할 메모리 손실 및 연속적인 진보적인 인식 쇠퇴에 지도 하는 신경 죽음. 비 생산적 neuroinflammation를 misfolded 단백질 감소 능력 등 다른 요인 악화 하 고 질병을 가속 수 있습니다. 현재, 주로 징후 기복을 제공 하는 광고에 대 한 개입 전략 하지만 질병 수정 치료 또는 예방.
증거를 증가 광고의 병리학에서 hyperphosphorylated 타우의 중요 한 역할을 건의 한다. 비 병 적인 상태로 타우 microtubules에 바인딩하고 촉진 신경 세포 골격에 해당 어셈블리는 기본적으로 펼쳐진된 단백질입니다. 타우 된다 hyperphosphorylated, 골격에서 분리 하 고는 대부분 광고3와 관련 된 병 리 현상의 원인으로 신경, 타우 집계에 클러스터. 처음 침, 축적 하는 타우 시작 되지만 질병 진행에서 그것은 채택 될 수 있다 인접 또는 synaptically 연결 된 건강 한 신경에 의해 세포 외 공간으로 영향 받은 신경에서 출시 될 가정에 " 프리온과 같은 방식으로 ". 내 면, 일단 타우 집계 추가 타우 집계를 통해 템플릿 기반 구조적 변화4을 유도 합니다.
이 가설에 따르면 타우 시드 중단 수 요법 감속 하거나 타우 중재 신경 질환의 과정을 반전 수 있습니다. 이, 지원 쥐 유전자 변이 의해 tauopathy에 취약 하 고 수 동적으로 안티 타우 항 체 주사 쇼 감소 타우 병리학과 향상 된 인지 기능5,6,7,8 ,9. 그러나, 치료 항 체 병 리를 줄일 메커니즘은 여전히 애매 남아.
항 체 중재 통풍 관 및 병 적인 집계 형태의 microglia, 두뇌의 주민 면역 세포에 의해 타우의 제안 된 메커니즘 중 하나입니다. 최근 간행물 microglia 수 효율적으로 내 면화 하 고 병 적인 타우 종족 저하 안티 타우 항 체를 통해 Fc-종속 메커니즘의 표면에 Fc 수용 체를 포함 하 여이 능력은 향상 하 고 좋습니다. microglia 및 수용 체 중재 먹어서10,11. 이러한 데이터는 치료 항 체의 잠재적으로 중요 한 이펙터로 microglia를 식별합니다.
여기 타우 글귀 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 사용 하 여 생성 하는 데이터 사전 방지 타우 항 체 잠재적인 광고 치료로 그들의 발달의 더 단계에 유용한 도구를 대표 하는 따라서 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 elucidating 도울 수 있다.

<table><tbody><tr><td>BV-2 세포</td>, <td>ICLC Interlab 세포주 수집</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr>, <tr><td>트립신-EDTA 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5g/dL 포도당</td>, <td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr>, <tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>EasYFlask</td><td>Nunc</td><td>156499 / 159910</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green STP ester</td><td>Life Technologies</td><td>P35369&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이트 pH 8.5 100 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PD10 열</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&nbsp; 멀티웰 배양 플레이트</td><td>Greiner</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96-Well Assay 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 0.25%</td><td>시그마</td><td>T4049-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 m, pH8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 용액 (20 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L12492</td><td></td></tr><tr><td>오페라 피닉스</td><td>퍼킨 헬머</td><td>HH14000000</td><td></td></tr></tbody></table>

microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Alzheimer의 질병 (광고)는 진보적인 신경 상태 집계 타우 이며 녹말 체 단백질 인지 감소를 이끌어 결국 신경 장애를 일으키는 두뇌에 축적. Hyperphosphorylated 타우 집계 신경에서 광고와 관련 된 병 리의 대부분을 일으키는 것으로 추정 된다. 이러한 집계는 extracellular 구획에 나올 생각 하 고 어디 그들은 유도 타우 집계 추가 인접 한 건강 한 신경에 의해 촬영. 이 "프리온-같은" 확산 항 체 바인딩 및 "중화" 광고의 전 임상 마우스 모델에서와 같이 extracellular 타우 집계에 의해 중단 될 수 있습니다. 항 체 중재 통풍 관 및 병 적인 집계 형태의 microglia에 의해 타우의 치료 항 체 병 리를 줄일 제안 된 메커니즘 중 하나입니다. 여기, 우리 타우 글귀 microglia 평가를 양적 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 마우스 microglial 셀 라인 BV-2를 사용 하 여, 높은 특이성, 낮은 변동성 및 중간 처리량에 대 한 수 있습니다. 이 분석 결과 함께 생성 된 데이터는 안티 타우 항 체 effector 기능 더 나은 특성화에 기여할 수 있다.

집계 된 재조합 타우 pH에 민감한 녹색 염료와 covalently 이라는 했다. 이 염료는 극적으로 그것의 형광 세포내 정량화에 대 한 수 있도록 산 성 세포에서의 국제화에 따라 증가 합니다. 레이블이 지정 된 타우 집계 했다 안티 타우 단일 클론 항 체와 알을 품을. 특히, 우리는 CBTAU 28.1의 공상 버전 (마우스 IgG1 Fc 영역)를 사용합니다. 이 인간 항 체의 N 맨끝 삽입 영역에 한다 생체 외에서 생성 된 타우 소13바인딩할 수 있습니다. 이 분석 결과에서 우리는 또한 CBTAU-28.1-dmCBTAU-28.1의 선호도 향상 버전 테스트. 보호자 및 높은 선호도 돌연변이에서 CBTAU-28.1, fab 조각 서식 하 고 제어 하는 마우스 IgG1 isotype 제어로 사용 되었다.
BV-2 셀 미리 형성 된 immunocomplexes와 incubated 했다 또는 헤 파 린 항 체 독립적인 타우 통풍 차단 하 면 전에 서 2 시간 동안 혼자 타우를 집계. 부 화, 이후 세포 세포 외 막에 바인딩된 타우를 제거 하려면 trypsinized 했다 고 cytometry 타우 통풍 관에 대 한 분석 했다. 우리는 최근에13설명, 복용량 의존 방식으로 그 CBTAU 28.1 변종 승진 통풍 관 BV-2 셀에의 관찰 합니다. 글귀 Fc CBTAU 28.1 팹 조각 기저 타우 통풍 관 (그림 2)를 증가 하지 않았다 때문에 중재 했다. 또한, 높은 선호도 dmCBTAU 28.1 항 체 야생 형 항 체 (그림 2) 보다 더 높은 정도로 BV-2 셀으로 타우 글귀를 중재.
항 체 중재 타우 통풍 관 및 endolysosomal 구획에 타우의 지역화 confocal 현미경 검사 법 (그림 3)에 의해 확인 되었다 어디 산 성 세포질 구획은 낮은 pH 세포에 대 한 선택적 프로브를 사용 하 여 스테인드. 세포내 puncta 녹색 pH 염료의 분류 타우 집계와 CBTAU 28.1 incubated 했다 셀 안에 관찰 되었다. 낮은 pH 구획 선택적 붉은 염료와 산 성 세포에 타우의 존재를 제안 하는 따라서 세포내 타우 집계 자주 colocalized 또한, CBTAU-28.1 팹 조각 다시 Fc 수용 체 중재 국제화 메커니즘 (그림 3)를 나타내는 타우 통풍 관을 증가 하지 않았다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig1.jpg"> 그림 1: 타우 국제화 BV-2 셀에 의해 감지 흐름 cytometry 분석에 사용 되는 전략 게이팅. BV-2만 제어 (A C) isotype 제어 (D-F), dmCBTAU-28.1에서 데이터 샘플 (G-난) 표시 됩니다. BV-2 셀 인구 파편과 죽은 세포 (A, D, G)를 제외 하 고 금감위 A vs SSC-A 밀도에 문이 되었다. BV-2 셀 추가 셀 남자 및 집계 (B, E, H)를 제외 하 FSC-A vs FSC-H 밀도에 문이 다음 했다. 단일 셀 게이트 pH 염료 (이 대표 결과에 FITC) 단일 매개 변수 히스토그램을 생성 하는 데 사용 되었다 (C, F, 난)은 형광 강도 결정 하 고. 또는 pH 염료-타우 긍정적인 세포의 백분율 BV-2만 컨트롤을 사용 하 여 결정으로 부정적인 세포를 제외 하 고 계산 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig2.jpg"> 그림 2: CBTAU 28.1 중재 microglial BV-2 셀으로 타우 집계의. 집계 된 재조합 타우 covalently 녹색 형광 pH에 민감한 염료와 분류 그리고 incubated 인간의 안티 타우 항 체의 선호도 향상 된 포맷, dmCBTAU-28.1, CBTAU-28.1의 마우스 공상 버전 해당 팹 조각, 한 마우스 IgG1 isotype 제어 항 체 또는 아무 항 체 (타우 혼자 집계). Immunocomplexes 헤 파 린 항 체 독립적인 타우 통풍 차단 하 면 전에 서 2 시간 동안 BV-2 셀 이후에 incubated 했다. Immunocomplexes의 cytometry에 의해 평가 되었다 고 셀 (B) 형광 강도 (A) 또는의 긍정적인 (타우 +) 비율의 기 평균 (GM)으로 표시. 오차 막대 (A)에서 두 개의 독립적인 실험의 표준 편차, (B) 쇼 동안 단일 실험. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig3.jpg"> 그림 3: 타우 집계 BV-2 세포에 의해 내 면화 및 셀룰러 산 성 세포에서 지역화. 미리 형성한 타우-항 immunocomplexes 항 체 독립적인 통풍 관을 차단 하는 헤 파 린 존재 2 시간 동안 BV-2 셀 incubated 했다. 외피, 후 핵 DNA 특정 파란색 염료와 낮은 pH 구획 선택적 붉은 염료와 산 성 세포질 구획 얼룩이 있었다. 라이브 셀 이미징 28.1 CBTAU와 dmCBTAU-28.1, 하지만 하지 isotype 컨트롤 incubated 했다 셀 안에 레이블된 타우 집계 (녹색)의 세포내 puncta를 밝혔다. 또한, 세포내 타우 집계 자주 빨간색으로 colocalized 염료 (노란색) 따라서 산 성 세포질 구획에 타우의 존재를 제안. CBTAU-28.1 팹 조각 국제화 하는 Fc 수용 체 중재 메커니즘을 나타내는 타우 통풍 관을 증가 하지 않았다. 이미지는 63 X 물 침수 목표 획득 20 비행기 Z-스택 (비행기 0.5 µ m)의 최대 강도 계획을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.

Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

치료 항 타우 항체가 알츠하이머 병의 병리학을 감소시키는 제안 된 메커니즘 중 하나는 microglia에 의해 병리학적으로 집계 된 전 타우의 정리에 대한 섭취입니다. 여기서, 우리는 microglia에 의하여 타우 섭정을 평가하기 위하여 세포 기지 분석체를 제시합니다. 이 분석은 항타우 항체의 작용 메커니즘을 더 잘 특성화하는 유용한 조사 도구를 나타낸다.실험 첫날에는 BV-2 세포를 배양한 플라스크에서 1x PBS로 먼저 세척하여 준비합니다. 그런 다음 05%의 트립신 EDTA를 섭씨 37도, 5%C02로 배양하여 플라스크에서 분리합니다. 3~5회 위아래로 배관하여 배양 배지에서 세포를 다시 중단한다.셀을 카운트하고 밀리리터 헤파린 당 200 마이크로그램을 함유하는 배양 배지에서 밀리리터당 100, 000 세포의 최종 농도로 세포 현탁액을 준비한다. 96 개의 잘 조직 배양 플랫 하단 플레이트에 잘 당250 마이크로 리터를 추가하십시오. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 5%C02로 플레이트를 배양합니다.이전에 준비된 pH 염료-타우 응집체를 얼음에 해동한 후, 혈청 프리 배지의 조건당 65마이크로리터로 희석하여 500 나노몰라 용액을 만듭니다. 원하는 농도의 두 배를 달성하기 위해 혈청 프리 배지의 65 마이크로 리터에서 항체를 희석. pH 염료-타우 골재 및 항체를 96웰 U-바닥 플레이트에 혼합한다.이 희석 판을 밀봉하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날에는 BV-2 셀을 가진 96 웰 플레이트에서 배지를 제거한다. 실온 1x PBS의 100 마이크로리터로 각 우물의 세포를 씻으시다.BV-2 세포판에서 PBS를 제거합니다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 희석 플레이트에서 96웰 BV-2 셀 플레이트의 각 웰으로 125 마이크로리터를 전송하고 5%CO2로 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 세포로부터 아미노 복합체를 제거하고 실온 1x PBS의 100 마이크로리터로 각각 의 세포를 잘 씻는다.1x PBS를 제거한 후 25%의 트립신 EDTA의 50마이크로리터를 추가하고 5%CO2로 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 그 후, 배양 매체의 200 마이크로 리터를 추가하고 세포를 분리하기 위해 위아래로 파이프하여 우물을 다시 중단합니다. 세포를 96개의 U-바닥 플레이트로 옮기고 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 400 x g로 전달합니다.접시를 얼음 위에 놓고 매체를 제거합니다. 150 마이크로리터의 얼음 차가운 1x PBS 및 원심분리기를 섭씨 4도에서 5분간 400g에 다시 넣습니다. 이전에 추가된 1x PBS를 제거하고 150 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 추가하여 다시 씻어 주세요.같은 조건에서 다시 원심 분리기. 이전에 추가된 PBS를 제거하고 우물당 150개의 마이크로리터 FACS 버퍼를 추가하여 접시를 얼음 위에 놓고 세포를 세척합니다. 섭씨 4도에서 5분간 400g으로 다시 원심분리기.접시를 얼음 위에 놓고 이전에 추가된 FACS 버퍼를 제거하고 우물당 200마이크로리터 FACS 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다. 즉시 FACS에 의해 분석을 진행하여 라이브 셀 게이트에서 20, 000 이벤트를 획득합니다. FACS 분석의 경우 전방 산란 영역 또는 FSCA 대 측면 산란 영역 또는 SSCA 밀도 플롯을 사용하여 이물질 및 죽은 세포와 같은 낮은 전방 산란 수준이 있는 이벤트를 제외하여 라이브 셀에 게이트를 사용합니다.그런 다음 라이브 셀 인구 내에서 FSCA를 사용하여 전방 산란 높이 또는 FSCH를 사용하여 단일 게이트를 만들고 셀 더블및 집계를 제외합니다. 그런 다음 단일 게이트의 이벤트를 사용하여 pH 염료 단일 매개 변수 히스토그램을 생성합니다. 생성된 히스토그램을 사용하여 먼저 평균 형광 강도를 결정합니다.그 후 BV-2의 유일한 대조군을 사용하여 결정된 음성 세포를 제외하여 pH 염료-타우 양성 세포의 백분율을 결정한다. CBTau-28.1 항체는 혈류 세포측정에 의해 도시된 바와 같이 용량 의존적인 방식으로 BV-2 세포에서 타우의 섭취를 촉진한다. 높은 친화도 이중 돌연변이 CBTau-28.1 항체는 BV-2 세포에서 타우 섭취량을 야생형 항체보다 더 높은 정도로 중재하였다.CBTau-28.1 팹 단편은 FC 수용체 중재 내화 메커니즘을 나타내는 기저 타우 섭취량을 증가시키지 않았다. 공초점 현미경 검사는 타우 섭취량의 항체 중재 증가를 확인했습니다. 녹색 pH 염료 라벨 타우 응집체는 종종 리소트래커 붉은 염료 스테인드 산성 세포기관과 공동 국화되어 내침엽 구획에서 타우 골재의 존재를 암시합니다.CBTau-28.1 팹 파편은 타우 의 섭취량을 다시 증가시키지 않았으며, 이는 실제로 FC가 중재되었음을 나타냅니다. 우리가 방금 설명한 분석법은 microglia에 의해 타우 섭취를 중재한 항체를 구체적으로 일관되게 정량화할 수 있게 해줍니다. 이 분석기로 생성된 데이터는 항타우 항체의 작용 메커니즘을 해명하여 잠재적인 AD 치료로서 그들의 발달에 더 나아가항타우 항체를 발전시키는 유용한 도구를 나타내는 데 도움이 될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Microglia은 중추 신경계의 방어 및 면역 감시의 첫번째 라인을 제공 macrophages를 거주하고 있습니다. MicroRNAs는 활성화 및 macrophages의 차별화 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을 규제 분자입니다. 이 문서에서는 microglia에서 microRNAs의 측정을위한 방법을 설명합니다.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

이 동영상은 pH 민감성 형광 표지 타우 응집체를 사용하여 쥐 미세아교세포의 Tau 흡수를 정량화하는 세포 기반 분석을 보여주며, 정량적 평가를 위해 형광 활성화 세포 분류를 통해 분석됩니다.

미세아교세포에 의한 타우 단백질 흡수를 평가하기 위한 세포 기반 분석

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Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

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