Name: 캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 학습하세요 CARIC 방법을 통해 HeLa 세포에서 RNA 결합 단백질을 포착하는 기술을. 이 프로토콜은 전사 후 유전자 조절 연구에 필수적인 RNA-단백질 상호작용을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 보조금 91753206, 21425204, 21521003 그리고 국가 주요 연구 및 개발 프로젝트 2016YFA0501500에 의해 지원 됩니다.

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li>
<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

공정한 RNA 무결성의 유지 관리는 성공적인 CARIC 실험 키 중 하나입니다. Cu(I) 및 주의 적절 한 ligands와 RNA 저하 줄일 수 있습니다 상당히, 비록 부분 저하 관찰 했다. EU와 실험 샘플에서 4SU의 대체 비율은 1.18%와 0.46%, 각각 (데이터 표시 되지 않음). 2000의 길이 그대로 RNAs에 대 한 nt, RNAs의 ~ 90% 이상의 EU 및 한 4SU 포함. 부분적으로 저하 RNAs의 길이 대 한 nt, RNAs의 ~ 70% 포함 하나 이상 EU와 한 4SU. 따라서, RNAs의 부분 저하는 극적으로 감소 하지 CARIC의 효율성 동안 심각한 저하 허용 되지 않습니다.
또 다른 중요 한 단계는 단계 1.4, 클릭 반응에 대 한 준비입니다. Cu (I)-촉매 클릭 RNAs에 반응이 LDS 농도에 민감 하다. LDS의 높은 농도 (> 0.1%)는 라벨 EU 포함 된 RNAs에 신호와 배경 신호 단백질 (데이터 표시 되지 않음)에 한 증가의 감소를...

인간 게놈은 코딩 및 noncoding RNAs (ncRNAs), mRNAs, rRNAs tRNAs, 작은 핵 RNAs (snRNAs), 작은 nucleolar RNAs (snoRNAs), 그리고 긴 비 코딩 RNAs (lncRNAs)1의 다양 한 형식으로 복사할 수 있습니다. 대부분 이러한 RNAs의 RBPs의 의류를 보유 하 고 ribonucleoprotein 입자 (RNPs)2로 작동. 따라서 RBPs의 포괄적인 식별 다양 한 인간 질병3,,45에 연루 RNAs 사이의 RBPs, 규제 네트워크를 이해 하기 위한 전제 조건입니다.
지난 몇 년 동안 다양 한 진 핵 시스템2,6, 인간의7,,89,10,11를 포함 하 여 발견 RBPs의 큰 향상을 목격 했다 마우스12,,1314, 효 모9,,1516, zebrafish17, 초파리 melanogaster18,19 , 꼬마 선 충16, 애기 thaliana20,,2122, 그리고 인간의 기생충23,24,25 . 이러한 진보 카스텔로 연구진이 개발한 RBP 캡처 전략에 의해 촉진 되어 있다 7 , Baltz 외. 8 2012 년에 RNA와 단백질 상호 작용, 많은 RNAs의 oligo(dT) 캡처 및 질량 분석 (MS)의 cross-linking vivo에서 UV-proteomic 프로 파일링 기반. 그러나, 그 많은 계정에 대 한 3%-5%만 진 핵 transcriptome26의 성숙한 mRNAs에 주로 존재 하는 사실을 감안할 때이 널리 사용 되는 전략은 RBPs non-poly(A) RNAs, 대부분 ncRNAs를 포함 한 상호 작용을 캡처할 수 그리고 사전 mRNAs입니다.
여기, 우리는 많은 non-poly(A) RBPs27transcriptome 전체 캡처에 대 한 최근 개발 된 전략의 세부 절차를 보고합니다. CARIC 되 나,이 전략 결합 vivo에서 UV cross-linking 및 photoactivatable 및 "클릭" nucleoside 유사 체 (는 클릭 반응에 참여할 수는 bioorthogonal 기능 그룹 포함)와 RNAs의 대사 라벨 4- thiouridine (4SU), 그리고 5-ethynyluridine (유럽 연합). CARIC 전략 이상적인 결과 얻기 위해 중요 단계는 효율적인 대사 라벨, UV cross-linking 및 클릭 반응, 그리고 RNA 무결성의 유지 관리 합니다. 클릭 반응에서 촉매로 사용 하는 Cu(I)는 RNAs의 조각화를 발생할 수 있습니다, 때문에 RNA 조각화를 줄일 수 있는 Cu(I) ligand 필수적 이다. 우리는 심각한 RNA 저하를 유발 하지 않고 세포 lysates의 효율적인 클릭 반응을 수행 하는 방법을 설명 합니다.
RBP 캡처만 HeLa 세포에서 식별이이 프로토콜에서 설명 하는 있지만 다양 한 세포 유형으로, 그리고 아마도 생물 CARIC 전략을 적용할 수 있습니다. RBP 캡처, 게다가이 프로토콜 또한 MS 샘플 준비, 단백질 식별 및 정량화, proteomic 실험에 익숙하지 않는 사람들을 위해 도움이 될 수 있는 효율적인된 단계별 절차를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin & 스트렙토마이신</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>EU (5-에티닐 우리딘)</td><td>Wuhu Huaren Co.</td><td>CAS : 69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU (4- 티오 우리딘)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10 회; PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td>365nm UV 램프 장착</td></tr><tr><td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>물을 처리합니다. 독성이 강합니다!</td></tr><tr><td>트리스&미드닷; HCl, pH 7.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88265</td><td>50mL 용해 완충액용 1정.</td></tr><tr><td>LDS (리튬 도데실 설페이트)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 한외여과 튜브(10 kDa 컷오프)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0.5-mL 한외여과 튜브(10 kDa 컷오프)</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 마그네틱 비드Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO(디메틸 설폭사이드)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>아지드-비오틴</td><td>클릭 화학 도구</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 황산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민]</td><td>시그마 알드리치</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>아지드-CY5</td><td>클릭 화학 도구</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>LDS 샘플 버퍼(4&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>10% 비스-트리스 겔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [폴리옥시에틸렌(20) 올레일에테르]</td><td>J& K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올아민</td><td>시그마 알드리치</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 아가로스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>시그마 알드리치</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>사르코실(N-라우로일사르코신 나트륨염)</td><td>시그마 알드리치</td><td>61743</td><td></td></tr><tr><td>비오틴</td><td>시그마 알드리치</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td></td><td></td><td>버전: 1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

캡처 클릭 화학 기반 rna 위하여를 사용 하 여 rna 의무적인 단백질의 포착 (caric) 전략

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

RNA 의무적인 단백질 (RBPs)의 포괄적인 식별 셀에 posttranscriptional 규제 네트워크를 이해 하는 열쇠입니다. RBP 캡처에 대 한 널리 사용 되는 전략은 polyadenylation [많은] 대상 RNAs의 미확인 non-poly(A) RNAs의 대부분 바인딩 단백질을 떠나 진 성숙한 mRNAs에 주로 발생 하는 이용 한다. 여기 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC)의 대사 라벨을 결합 하 여 많은 non-poly(A) RBPs transcriptome 전체 캡처를 가능 하 게 되 나 최근 보고 된 방법의 자세한 절차 설명 RNAs vivo에서 UV cross-linking, 그리고 bioorthogonal 태그.

품질 관리 단계의 대표적인 결과 표시 됩니다. 결과 단계 2.3.2 (그림 1)에서 설명 하는 젤에 형광 분석, 단계 4.1.3 (그림 2A)에서 설명 하는 서쪽 오 점 분석 및 단계 4.2.2 (그림 2B)에 설명 된 실버 얼룩 분석 수치 포함. 품질 관리 단계는 CARIC 프로토콜의 최적화를 위해 중요 합니다. 항상 대규모 RBP 식별 실험의 준비에서 품질 컨트롤을 포함 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58580/58580fig1.jpg"> 그림 1: 젤 단계 2.3.2에서에서 설명 클릭 표시 된 샘플...

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

이 방법, CARIC, RNA 결합 단백질의 포괄적인 인구 조사를 제공 하 여 유전자 레크리에이션의 후 전사의 분야에서 주요 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다. CARIC의 주요 장점은 mRNA 및 비코딩 RNA와 같은 다양한 종류의 RNA에 바인딩된 단백질을 포착하는 능력입니다. 이 방법은 다양한 유형 및 유기체에서 작용시 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있다.첫째, 5%의 CO2 대기에서 섭씨 37도에서 DMEM을 보충한 배양 헬라 세포. 세포가 약 80%에 도달하면 각 접시의 배양 배지를 예동, 신선한 배지의 15 밀리리터로 대체합니다. 각 접시에 100 밀리머 EU의 15 마이크로리터를 추가하여 1 밀리머의 최종 농도를 유지합니다.실험용 및 자외선 제어 샘플의 경우 각 접시에 100 밀리머 4 SU의 7.5 마이크로리터를 추가합니다. 이전 조건을 사용하여 16 시간 동안 세포를 호일로 덮고 요리를 덮습니다. 그 후, EU 및/또는 4개의 SU의 이전 금액의 절반을 적절한 판에 추가하고 2시간 동안 계속 배양합니다.생체 내 교차 연결에서 시작하려면, 배양 매체를 제거하고 세척 당 PBS의 5 밀리리터를 사용하여 PBS로 각 접시를 세 번 세척하십시오. 잔여 PBS를 가능한 한 많이 제거합니다. 실험적이고 4개의 SU 제어 샘플이 없는 경우 뚜껑을 제거한 채 접시를 얼음 위에 놓습니다.UV 크로스 링커를 사용하여 365 나노미터의 UV 빛과 2개의 줄의 제곱을 통해 세포를 조사합니다. 자외선 제어 샘플이 없는 경우, 얼음 위에 접시를 놓고 빛으로부터 보호하십시오. 다음으로 각 접시에 프리리시스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.고무 셀 리프터를 사용하여 세포를 긁어 내고 15 밀리리터 튜브에서 프리 리시즈 서스펜션을 수집합니다. 총 볼륨을 6밀리리터로 조정하는 두 접시의 서스펜션이 포함된 튜브에 프리리시스 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 동일한 양의 R 리시스 버퍼를 추가합니다.리스가 명확하고 균일 할 때까지 좁은 바늘로 주사기를 통해 셀 리스를 여러 번 전달합니다. 1 시간 동안 부드러운 회전과 섭씨 4도에서 lysate을 배양. 이 후 희석 버퍼의 20 볼륨에서 lysate를 희석하고 15 밀리리터 여과 튜브, 10 킬로달톤의 분자 차단에 15 밀리리터 분획으로 분할.스윙 버킷 회전기를 사용하여 튜브를 4000회 G와 섭씨 4도에서 약 15분간 회전하여 각 분획이 1밀리리터 미만의 부피로 농축됩니다. 각 농축 된 용액 분획에 14 밀리리터의 희석 버퍼를 추가하고 농도 과정을 반복합니다. 그런 다음 분획을 결합하고 이전에 설명한 농도 공정을 사용하여 6 밀리리터의 부피에 농축한다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 믹스를 준비합니다. 이 반응 믹스를 미리 지워진 용액의 6 밀리리터에 넣고 잘 섞습니다. 시약을 줄이는 162.5 마이크로리터를 추가하고 잘 섞습니다.궤도 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 800rpm의 배양합니다. 이 후 5 밀리머 EDTA를 추가하고 5 분 동안 실온에서 궤도 셰이커에 인큐베이팅하여 반응을 담금질. 다음으로, 반응 혼합물을 50밀리리터 튜브 2개 사이로 나누고, 각각 4권의 미리 냉각된 메탄올을 포함하고 30분 동안 음수 섭씨 30도에서 배양한다.원심분리기는 G 4000배, 섭씨 4도에서 15분 동안. 상체를 버리고 미리 차가운 메탄올의 1~2밀리리터를 펠릿에 넣습니다. 펠릿이 보이는 덩어리없이 완전히 중단되도록 펠릿을 분해하기 위해 위아래로 파이프.원심분리 및 재서스펜션 프로세스를 두 번 반복합니다. 그 후, 펠릿을 방해하지 않도록 가능한 한 잔류 메탄올을 조심스럽게 꺼낸다. 10 밀리리터의 재구성 버퍼를 추가하고 펠릿을 녹이도록 위아래로 파이프를 넣습니다.원심분리기는 G 4000배, 섭씨 4도에서 10분 간. 그런 다음 품질 관리를 위해 샘플의 20 마이크로 리터를 수집하는 새로운 튜브로 상체를 전송합니다. 세척 및 재구성된 샘플을 준비된 스트렙타비딘 아가로즈 구슬로 옮기.하룻밤 동안 부드러운 회전과 섭씨 4도에서 배양. 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다. 품질 관리를 위해 샘플의 20 마이크로 리터를 수집할 수 있도록 새로운 튜브로 상체를 전송합니다.10 밀리리터의 워시 버퍼 A.Incubate로 구슬을 12 rpm및 실온에서 10 분 동안 부드럽게 회전시 세척하십시오. 그런 다음 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다. 상체를 제거하고 세탁 및 원심 분리 과정을 다시 한 번 반복하십시오.이 세척 과정을 반복하여 버퍼 B를 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 버퍼 C를 세척합니다. 그 후, 50 밀리머 트리스 염산염의 10 밀리리터로 구슬을 씻으시다. 구슬을 4000회 G로 5분간 회전시합니다.상체를 제거하고 두 개의 1.5 마이크로 센세이퍼지 튜브 사이에 구슬을 균등하게 분할합니다. 포획된 RNP를 제외하기 시작하려면 400마이크로리터의 세척된 정착구슬에 준비된 비오틴 용출 버퍼 400마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1500 rpm에서 궤도 셰이커를 20분 동안 배양합니다.그런 다음 1500 rpm과 섭씨 65도에서 10 분 동안 열 블록으로 궤도 셰이커에 배양하십시오. 구슬을 7800회 G로 1분간 원심분리하고 꺼진 RNP를 수집합니다. 400 마이크로리터의 신선한 비오틴 용출 버퍼를 비드에 추가합니다.인큐베이션 및 원심분리 과정을 반복하여 두 번째 엘루트를 수집하고 두 개의 엘루스를 단일 15 밀리리터 튜브에 결합합니다. 다음으로, 결합된 RNP elutes에 3권의 희석 버퍼를 추가하여 SDS의 농도를 감소시다. 0.5 밀리리터 울트라 여과 튜브를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 약 40 마이크로리터에 농축합니다.마이크로리터 RNase A당 0.5 마이크로그램을 추가하고 2시간 동안 섭씨 37도에서 배양하여 교차 연결된 RNase에서 RBP를 방출합니다. 품질 관리를 위해 두 개의 마이크로리터를 RP로 수집합니다. CARIC 프로토콜을 최적화할 때 품질 관리 단계가 중요합니다.클릭 라벨이 부착된 샘플의 대표적인 품질 관리는 인겔 형광 분석을 통해 수행됩니다. 이중 표지된 샘플만이 교차 연결된 RNP의 신호를 나타내는 높은 분자량에서 강한 얼룩 밴드를 보여줍니다. RNP 신호는 4개의 SU 또는 EU를 생략하여 폐지됩니다. 또한 RNase를 사용하여 소화에 의해 폐지될 수 A.In 어떤 경우에는 4개의 SU 제어 샘플에서 강한 얼룩밴드가 관찰된다.이 밴드는 대부분의 경우 열 내포화 중에 저하되는 레이블이 지정되지 않은 연결되지 않은 RNase를 나타냅니다. 선호도 투표 데이터의 품질 관리는 풀다운 전과 풀다운 후 샘플의 비오틴 신호를 보여주는 서부 블롯 분석을 통해 평가됩니다. 포획된 RBP의 은 염색 분석은 HeLa 세포의 경우 일반적인 총 포획 효율이 입력 단백질의 0.05~0.1% 사이임을 보여줍니다.이 절차를 시도하는 동안 RNase는 ribonucleases에 민감하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. RNase의 탈색을 줄이기 위해 실험 환경을 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오. 이 절차에 따라 질량 분석법을 사용하여 단백질 알메이크 식별이 미리 형성되어 철 경계 단백질을 나타낼 수 있습니다.개발 후 CARIC 기술은 직장에서 우편 전사 OT 규정을 보다 포괄적으로 이해할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

RNA의 성적표는 횡단 행동 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 다수에 의해 중재됩니다 광범위한 posttranscriptional 규정이 적용됩니다. 여기 우리는 정확하고 transcriptome 전체 규모 RBPs의 RNA 결합 사이트를 식별할 수있는 generalizable 방법을 제시.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

이 비디오는 mRNA에서 아데닐레이트-우리딜레이트-풍부 요소(ARE) 염기서열과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질(RBP)을 식별하기 위한 체외 RNA 풀다운 분석을 보여줍니다. 세포 용해물의 표적 RBP는 RNA 프로브와 혼합되어 RNA 단백질 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 RNA 프로브의 desthiobiotin 라벨과 streptavidin-labeled magnetic bead의 친화성을 활용하여 친화성 정제를 통해 분리됩니다.

친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

이 비디오에서는 관심 대상 단백질에 대한 특정 RNA 결합 서열을 식별하기 위해 지수 농축(SELEX) 방법에 의한 리간드의 체계적인 진화를 설명합니다. 단백질은 무작위 RNA 염기서열의 대규모 풀과 함께 배양되며, 단백질 결합 RNA 염기서열은 단백질 결합 부위를 식별하기 위해 분리, PCR 증폭 및 염기서열 분석됩니다.

RNA-단백질 상호작용을 식별하기 위한 SELEX 기반 체외 결합 분석

RNA 풀다운 프로토콜은 RNA 결합 단백질 (RBPs) 및 비 암호화뿐만 아니라 코딩 RNA를 사이의 상호 작용의 검출을 위해 여기에 최적화되어 있습니다. 안드로겐 수용체 (AR)에서 RNA 조각은 차 갈색 지방 세포의 lystate로부터 RBP를 검색하는 방법을 보여주기 위해 예로서 사용되었다.

RNA 결합 단백질의 검출에 의해<em&gt; 체외</em지방 세포 문화&gt; RNA 풀다운

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

여기에서, 우리는 포유류 세포에서 내인성 RNA 결합 사이트 또는 RNA의 "발자국"을 풍부하게 하는 프로토콜을 제시합니다:단백질 (RNP) 복합체. 이 접근은 RNP 소단위의 2개의 면역 강절을 관련시키고 그러므로 나란히 RNA 면역 침전이라고 불립니다 (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

학습하세요 CARIC 방법을 통해 HeLa 세포에서 RNA 결합 단백질을 포착하는 기술을. 이 프로토콜은 전사 후 유전자 조절 연구에 필수적인 RNA-단백질 상호작용을 이해하는 데 활용됩니다.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

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