Name: 병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 학습하세요 쥐 뇌를 이용한 micro-CT 기반 병변 특성화 및 전극 위치 선정 방법을 통해 신경과학 연구에서 구조-기능 관계를 정량적으로 분석하는 기술을.

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저자 감사 합니다 그렉 린과 아서 McClelland 자신의 전문성에 대 한 마이크로-CT 기계와 데이비드 리치몬드 및 이미지에서 헌터 엘리엇과 데이터 분석 코어 (IDAC) 처리 조언, 그들의 이미지에 대 한 하버드의과 대학에 보스턴에서 윌리엄 Liberti 기꺼이 얼룩말 피리 새 류 두뇌를 제공 하는 대학. 이 작업 수행 되었다 일부 센터에서 대 한 나노 시스템 (CNS), 구성원의는 국가 나노기술 조정 인프라 네트워크 (NNCI), NSF 보너스 번호 1541959에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는. CNS는 하버드 대학교의 일부입니다. 이 작품은 리처드와 수잔 스미스 가족 재단과 IARPA (계약 #D16PC00002)에 의해 지원 되었다. S.B.E.W. 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP;에서 장학금에 의해 지원 되었다 LT000514/2014)와 유럽 분자 생물학 기구 (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. 여는 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 친교 프로그램 (GRFP)을 지원 했다.

모든 관심과 동물의 실험적인 조작 검토 하 고 하버드 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다. 여기에 설명 된 관류 쥐에 대 한 특정 하지만 작거나 비슷한 크기 두뇌를 가진 어떤 동물 든 지에 적용 되는 절차.
1입니다. 관류
<ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1을 준비 합니다. 쥐에 대 한 (나이: 0.5-1.5 세, 무게: 250-600 g), 800-1000 mL 충분 해야 한다. 400 mL를 사용 하 여 동물과 정착 액을 희석 하는 추가적인 400 mL perfuse.</li>
	<li>정착 액 2% (w/v) paraformaldehyde (PFA) 및 1 x PBS에 2.5% (w/v)도 (GA)으로 구성 된 준비. 쥐, 400 mL 충분 하다입니다. 재 관류 후 뇌의 후 고정을 위한 50 mL 원뿔 튜브에 50ml를 저장 합니다.</li>
	<li>4-5 %isoflurane 가스 (0.8 L/min O2 21 ° C에서 1.0 바에서)에서 15 분 동안 쥐 anesthetize</li>
	<li>Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital의 치명적인 복용량을 주사 (180 mg/kg).</li>
	<li>발가락-핀치 반사 시험을 실시 하 여 동물에 반사 손실에 대 한 테스트. 동물의 반사 응답 잃은 때까지 관류를 시작을 기다립니다.</li>
	<li>앞에서 설명한 intracardial 관류와 뇌 추출 프로토콜14 다음 솔루션에 따라: 1 x 125 mm Hg 피 제거 하에서 PBS의 400 mL와 함께 동물을 perfuse. 일단 모든 혈액 제거 되었으며 1 x PBS로 대체, PFA와 2.5%가 125 mm Hg에 1 x PBS에 용 해 2%의 솔루션의 400 mL와 함께 perfusing 시작 합니다. 참고: 경우에 절차는 쥐를 동물에 실시 되 고, 관류 절차만 중요 한 구성 요소는 PBS와 2% x 1 사용 하 여 PFA, 1 x PBS에 2.5%가. 솔루션 볼륨 및 관류 압력은 종에 따라 조정할 수 있다.</li>
</ol>2입니다. 포스트 고정
<ol><li>2%에서 추출한 뇌를 배치 PFA, 2.5%가 PBS 솔루션 (이전 동물을 perfuse 하는 데 사용 하는 동일한 솔루션) x 1에서. 솔루션 볼륨 적어도 10 배는 두뇌의 볼륨 인지 확인 합니다. 쥐를 위해 솔루션 50 mL 50 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 놓습니다. 2-3 일, 4 ° c.에 가볍게 흔들어 후 고정 샘플 저장 주: 샘플 50 mL 원뿔 튜브에 경우에, 궤도 통에 가로로 배치 됩니다 확인 최상의 결과.</li>
	<li>샘플 후 수정 되었습니다 오랫동안 충분히, 후 씻어 두 번 증 류 물 (ddH2O), 드 이온된 수 (diH2O), 또는 초순 샘플 4 다음 기간에 대 한 시간 ( 재료의 표참조): 1, 1, 1, 및 15 분. 참고:이 프로토콜 ddH2O, diH2O, 또는 초순 이어야 한다 상호 교환. 편의상, ddH2O 이제부터 물 정화를 참조 하 사용 됩니다.</li>
</ol>3. 얼룩
주의:이 단계에 대 한 장갑을 사용 하는 동안 모든 솔루션 준비는 후드 아래를 수행 합니다.
<ol><li>적어도 10 배 솔루션 얼룩의 두뇌 볼륨을 준비 합니다. 쥐 두뇌, 2% (w/v) 오스뮴 tetroxide (OsO4) 50 mL에에서 준비 ddH2O 주식 4% OsO4 솔루션의 25 mL 및 ddH2오의 25 mL 주의: 오스뮴 tetroxide 휘발성 및 임시 실명 및 호흡기 문제를 일으킬 수 있습니다 하지 않을 경우 적절 하 게 처리. 보조 컨테이너 내에서 적절 한 화학 위험 컨테이너에서 오스뮴 tetroxide를 문의 하는 모든 자료를 삭제 합니다.</li>
	<li>새로운 50 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 놓고 OsO4 솔루션을 추가 합니다. 두뇌는 OsO4 조직에서 지질과 반응으로 갈색을 시작 한다.</li>
	<li>튜브를 닫고 파라핀과 그것을 철저 하 게 봉인 외피 동안 누설 하지 않습니다 있도록 ( 재료의 표참조) 영화. 참고:는 오스뮴 휘발성 이며 반응할지 가벼운 튜브, 플라스틱 튜브를 제대로 밀봉 하는 것은 무척 중요 하다. 튜브 추가 보호를 위해 알루미늄 호 일 포장 될 수 있습니다.</li>
	<li>2 주 동안 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 가볍게 흔들어 4 ° C에서 밀봉 된 튜브를 저장 합니다. 가로로 최고의 혼합 되도록 튜브를 놓습니다. 샘플 흔들어 동안 솔루션에 완전히 빠져들은 확인 합니다. 참고: 지속적으로 순환 하는 오스뮴은 허용 되지 않습니다, 만약 그것 수 있습니다 완전히 침투 하지 샘플, 그래서 뿌리에 수평 배치는 매우 중요 하다.</li>
</ol>4. 포함
<ol><li>샘플은 2 주 동안 OsO4 incubated 되어, 후에 그것을 세척 ddH2O 5 시간 실 온 (RT)에서 다음 기간에 대 한: 1, 1, 1, 15, 및 모든 언바운드 OsO4 샘플에서 제거 60 분. 참고: 지난 60 분 교환를 포함 하 여 여러 교류는 밖으로 확산에 순환 시스템에서 모든 오스뮴을 허용 하는 데 필요한.</li>
	<li>4 ° c.에서 ddH2O 30 분 샘플을 씻어 참고: 오스뮴 샘플, 밖으로 확산 계속 수 있습니다 하지만 그 수량을 크게 이전 단계에서 감소 한다.</li>
	<li>결국 수 지로 침투 하는 에탄올과 샘플을 탈수. 탈수, 바꿉니다 ddH2O (30 분 각 4 ° C에서)에 대 한 다음 에탄올 희석의 10-20 mL: 20% (v/v) 에탄올과 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) 에탄올과 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) 에탄올 및 30% (v/v) ddH2O; 90% (v/v) 에탄올과 10% (v/v) ddH2O; 100%의 에탄올</li>
	<li>다음과 같이 아세톤 또는 수 지 희석을 준비 합니다.<ol>
<li>( 재료의 표참조)을 포함 하기 위한 제조업체의 지침에 따라 수 지의 100 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>33% (v/v) 수 지-67% 아세톤 솔루션으로 만들기 위해 50 mL 원뿔 튜브에 수 지의 15 mL를 붓고 하 고 100% 유리 증 류 아세톤의 30 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>50% (v/v) 수 지-50% 아세톤, 수 지의 22.5 mL 50 mL 원뿔 튜브로 부 어와 100% 유리 증 류 아세톤의 22.5 mL을 추가.</li>
		<li>67% (v/v) 수 지-33% 아세톤 솔루션으로 만들기 위해 수 지의 30 mL 50 mL 원뿔 관에 부 어 하 고 100% 유리 증 류 아세톤의 15 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>수 지의 잔여 32.5 mL를 사용 하 여 100% 수 지 아래의 첫 번째 솔루션으로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수 지 침투 과정 다음 아세톤 및 아세톤 또는 수 지 희석의 10-20 mL를 통해 샘플을 이동 하 여 시작: 4 ° C에서 30 분 동안 100% 아세톤 4 ° C에서 30 분 동안 100% 아세톤 그리고 실 온 (RT)에서 30 분 동안 100% 아세톤. 참고: 침투 과정의 나머지 부분에서 열린다 실시간</li>
	<li>33% (v/v) 수 지 67% 아세톤 3 h RT에 RT, RT에서 3 h 67% (v/v) 수 지 33% 아세톤 및 실시간에 12 h에 대 한 100% 수 지에서 3 h에 대 한 50% (v/v) 수 지-50% 아세톤에 샘플을 담가</li>
	<li>병에는 지침에 따라 수 지의 신선한 50 mL 배치를 확인 합니다. 그것은 치료 하실 것입니다 컨테이너에 샘플을 전송 (예., 일회용 금형 재료의 테이블에서에서 설명). 실시간에서 4 시간 동안 신선한 100% 수 지와 함께 샘플을 고취 참고: 신선한 수 지를 사용 하지 않으면 전날 만든 수 지 성급 하 게, 강화에 시작 되 고 샘플 조작 하기 어려울 것입니다.</li>
	<li>45 ° c.에 15 분 동안 진공 오븐에서 샘플을 드 참고:이 단계는 샘플 내에서 어떤 덫을 놓은 공기 거품을 제거 도움이 될 것입니다 하지만 그것은 중요 하지 않은 데이터의 품질에는 영향을 미치지 것입니다.</li>
	<li>마지막으로, 60 ° c.에서 48 h에 대 한 오븐에 샘플을 치료</li>
</ol>5입니다. 마이크로-CT
<ol><li>일단 샘플을 치료 껍질 일회용 형을 하 고 마이크로-CT 기계와 스캔. 참고: 사용 되는 기계에 따라 설정이 달라 집니다. 재료의 테이블에에서 나열 된 저자에 의해 사용 되는 스캐너에 대 한 권장 설정이 130 kV, 0.1 m m 구리 필터 및 몰 리브 덴 소스, 1 초 노출, 프로젝션 4 프레임의 평균 135 µ A. 그러나, 경험 한다 보정 스캐너 개별적으로, 많은 요인 특정 세션 동안 최적의 설정에 영향을 미칠 것입니다.</li>
	<li>검사가 완료 되 면, 스캐너 소프트웨어와 함께 컴퓨터에 실험의 스캐너/소프트웨어 조합에 대 한 권장 매개 변수 샘플을 재구성 합니다.</li>
	<li>마지막으로, 시각화 하 고 분석 하는 선택의 실험의 소프트웨어를 사용 하 여 복원된 디지털 볼륨 (예제 테이블의 자료 를 참조).</li>
</ol>

<ol><li>Scoville, W., Milner, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10678523">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).</li>
<li>Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+return+of+Phineas+Gage%3A+clues+about+the+brain+from+the+skull+of+a+famous+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient.</a> Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).</li>
<li>Kawai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortex+is+required+for+learning+but+not+for+executing+a+motor+skill%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill.</a> Neuron. 86, 800-812 (2015).</li>
<li>Otchy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+off-target+effects+of+neural+circuit+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acute off-target effects of neural circuit manipulations.</a> Nature. 528, 358-363 (2015).</li>
<li>Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+the+anterior+thalamus+in+directing+attention+to+task-relevant+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli.</a> Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).</li>
<li>Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+exposure+to+combination+paradigm+of+environmental+enrichment%2C+physical+exercise+and+diet+reverses+the+spatial+memory+deficits+and+restores+hippocampal+neurogenesis+in+ventral+subicular+lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).</li>
<li>Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+NBM-+lesion+on+synaptic+plasticity+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats.</a> Brain Research. 1655, 122-127 (2017).</li>
<li>Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+visual+motion+representation+in+mouse+area+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex visual motion representation in mouse area V1.</a> Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).</li>
<li>Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28063155">Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).</li>
<li>Wood, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+honeycomb+maze+provides+a+novel+test+to+study+hippocampal-dependent+spatial+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation.</a> Nature. , (2018).</li>
<li>Vermaercke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+in+rat+occipital+and+temporal+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551, 232-236 (2017).</li>
<li>Masís, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((micro-CT-based+method+for+quantitative+brain+lesion+characterization+and+electrode+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization.</a> Scientific Reports. 8, 5184(2018).</li>
<li>Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, 3564(2012).</li>
<li>Helander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+formaldehyde+binding+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue.</a> Biotechnic & Histochemistry. , (1994).</li>
<li>Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+aldehyde+fixation+for+electron+microscopy%3A+stabilization+of+rat+brain+tissue+to+withstand+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress.</a> Histochemical Journal. , (1979).</li>
<li>Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X91902315">Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds.</a> Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).</li>
<li>Bahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+and+ruthenium+tetroxide+and+their+reactions+with+biologically+important+substances%3A+electron+stains+III%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III.</a> Experimental Cell Research. , (1954).</li>
<li>Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+of+osmium+tetroxide+with+lipids+and+other+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).</li>
<li>Riemersma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+fixation+of+lipids+for+electron+microscopy+a+possible+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).</li>
<li>Mikula, S., Binding, J., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+embedding+the+whole+mouse+brain+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy.</a> Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).</li>
<li>Mikula, S., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-brain+staining+for+electron+microscopic+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction.</a> Nature Methods. 12, 541-546 (2015).</li>
<li>Crespigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+micro-CT+imaging+of+the+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">3D micro-CT imaging of the postmortem brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+Iodine-Based+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast.</a> PLoS One. 10, 0142974(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027284">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532, 122-126 (2016).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+imaging+reveals+mekk3+heterozygosity+prevents+cerebral+cavernous+malformations+in+Ccm2-Deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice.</a> PloS One. 11, 0160833(2016).</li>
<li>Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+Micro-CT+imaging+of+cerebral+cavernous+malformations+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10860789">Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain.</a> Neuroimage. 11, 601-611 (2000).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+episcopic+microscopy%3A+a+rapid+technique+for+high+detailed+3D+analysis+of+gene+activity+in+the+context+of+tissue+architecture+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol%22%5BJournal%5D)">High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology.</a> Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).</li>
<li>Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+magnetic+paragraph+sign+resonance+imaging+of+mouse+embryonic+paragraph+sign+anatomy+using+a+fast+gradient-echo+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22MAGMA%22%5BJournal%5D)">high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence.</a> MAGMA. 16, 43-51 (2003).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Three-Dimensional+microelectrode+brain+mapping+using+stereo+microfocal+x-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging.</a> Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).</li>
<li>Borg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+metal+electrodes+in+the+intact+rat+brain+using+registration+of+3D+microcomputed+tomography+images+to+a+magnetic+resonance+histology+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas.</a> eNeuro. 2, (2015).</li>
<li>Fu, T. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+chronic+brain+mapping+at+the+single-neuron+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level.</a> Nature Methods. 13, 875-882 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

다음은 프로토콜에 중요 한 단계: 첫째, PFA와 조지아 동물 perfuse 이후 두뇌를 수정 후의 조합의 사용 했다 조직의 일관 된 전체 오스뮴 침투를 달성 하는 최고. 우리가 테스트 하지 않 았 명시적으로, 비록 그럴듯한 설명이입니다 PFA 고정 가역15, 반면 조지아 고정은 가역16,17. 오스뮴 tetroxide에서 2 주간 배양 조직의 전체 침투에 대 한 필요 하기 때문에, 뇌의 내부에 PFA 밖으로 확산 하 고 조직의 얼룩이 지기는 하는 동안 저하 가능 하다. 오스뮴 따라서 내부 구조를 유지할 수 없습니다.
버퍼에 녹아 있는 수성 오스뮴 오스뮴 반대를 사용 하 여 (즉, 나트륨 cacodylate)는 오스뮴에 의해 전체 조직 침투를 위해 절대적으로 필요 했다. 6 주 부 화 후에 나트륨 cacodylate에...

신경 기능 및 뇌의 위치 사이의 관계를 이해 하기 위해서는 오랜 시간에 대 한 장애에 의존 했습니다. 예를 들어 우리의 이해 학습 및 메모리 불가결 되 고 마 키 충 동 제어에 대 한 것으로 전 두 엽 피 질 인간1,2serendipitous 변의 두 제품을 했다. 그러나 동물 모델,,를 사용 하 여 세 렌, 저쪽에 하 여 병 변의 힘을 활용 하는 신경 수 있다 그리고 수많은 뇌 영역의 기능을 통해 구조-기능 관계의 체계적인 연구를 통해 해명 되었습니다 했습니다. 병 변3,4.
그러나 올바르게 구조에 함수를 할당,, 병 변 연구는 부족 했던 지역 이다 정확한 정량화 절차 필요 합니다. 장애를 측정을 위한 현재 골드 표준 섹션, 마운트, 및 가벼운 현미경 이미지 두뇌입니다. 이미지 분할 영역 다음 아틀라스에 가장 가까운 부분에 일치와 과목에 걸쳐 변의 대략적인 좌표는 직접 보고, 종종 카메라 루시 다 이미지 또는 예제 조직학 조각3,4 사용 ,5,6,7,8,,910.
현재 병 변 부 량 절차의 부정확성을 넘어 이러한 기술은 시간과 실패 하는 경향이 있습니다. 뇌 경직, 블레이드 선명도, 및 온도에 작은 변화는 어설픈, 뒤틀린, 또는 찢어진 섹션으로 이어질 수 있습니다. 섹션 수 있습니다 또한 얼룩 하지 균등 하 게 하 고 설치 매체에 거품 때문에 몇 군데 잘못 될. 중요 한 것은, 단면, 시 뇌의 병 변의 위치의 3 차원 컨텍스트 손실, 두뇌 도전 병 변의 정확한 3D 개조를 만들기 됩니다.
병 변에 대 한 또 다른 일반적인 응용 단일 및 다중 전극 녹음 뇌에서의 위치 결정 되었습니다. 마지막 녹음 세션의 끝에, 연구팀은 전극 끝에 작은 전해질 병 변 유발 하 고 두뇌 조직학 기존 병 변 실험11에서 처리. 조직학 찾을 수 도전 되는 전해질 병 변 일반적으로 그들을 확인 하는 데 사용 하는 전극 보다 큰 하지만 충분히 작은 일반적으로 추가 문제, 위에서 설명한 동일한 단점에서 겪고 있다이 기술. Tetrode 배열의 경우 여러 전극 삽입 되 면 전해 병 변 통해 확인은 훨씬 더 도전. 대신 전해 병 변은 나중에12, 조직학 확인 전극에 염료를 사용 하 여 하지만이 기술은 전통적인 조직학와 함께 제공 되는 동일한 단점이 있습니다 겪고 있다.
여기, 우리는 깊이 있는 설명 얼룩 전자 현미경 (EM) 및 x-선 기법에 따라 최근 설명된 방법13 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 병 변 단정 하 고 전류 보다 작은 동물 두뇌에서 전극을 찾습니다 방법입니다. 마이크로-CT는 엑스레이 선과 하지 샘플에서 반사 하는 엑스레이 수집 하는 동안 360 ° 회전 하는 샘플에서 촬영 하는 이미징 기법입니다. 결과 어떤 방향으로 시각화 하 고 정확 하 게 측정할 수 있는 샘플의 고해상도 디지털 3D 재구성. 많은 교육 기관 있다 마이크로 CT 스캐너, 상업적으로 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학(EMS)</td><td>15710</td><td>1X PBS에서 2%(w/v/)</td></tr><tr><td>글루타르알데히드(GA)</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>1x PBS에서 2.5%(w/v) GA OsO</td></tr><tr><td>4</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>흄 후드에서 작업</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Labs</td><td>Koptec</td><td>140, 190, 200 증거</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>EMS</td><td>10015</td><td>유리 증류</td></tr><tr><td>Durcupan ACM 수지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44610</td><td>A, B, C, D 부품, 일회용 금형 임베딩용 수지</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>27114</td><td>권장</td></tr><tr><td>milliQ 물(초순수)</td><td>Millipore Sigma</td><td>QGARD00R1(또는 관련 정수기)</td><td>제안된</td></tr><tr><td>파라필름(파라핀 필름)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td>제안된 파라핀 필름</td></tr><tr><td>마이크로 CT 스캐너</td><td>Nikon Metrology Ltd., Tring, UK</td><td>X-Tek HMS ST 225</td><td>저자가 사용</td></tr><tr><td>하는마이크로 CT 스캔을 시각화하고 분석하기위한 소프트웨어 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Volume Graphics</td><td>VG Studio Max</td><td>저자가</td></tr><tr><td></td> 사용 <td>FEI / Thermo Scientific</td><td>Avizo</td><td>저자</td></tr><tr><td></td>가 사용 <td>FEI / Thermo Scientific</td><td>아미라</td><td>Avizo</td></tr><tr><td></td><td>Mark Sutton & 과 유사함 Russell Garwood</td><td>Spiers</td><td>Free, http://spiers-software.org/</td></tr> <tr><td></td><td>Pixmeo Sarl</td><td>Osirix Lite</td><td>Free, https://www.osirix-viewer.com/</td></tr> <tr><td></td><td>Open Source</td><td>FIJI</td><td>Free, https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td></td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td>한 번에 한 슬라이스를 분석하는 데 좋습니다</td></tr></tbody></table>.

병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-ct 기반 방법

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

병 변 및 전극 위치 확인은 전통적으로 통해 조직학 검사 스테인드 뇌 조각의 수동 추정을 요구 하는 시간이 걸리는 절차 다. 여기, 우리는 장애를 측정 하 고 덜 힘 드는 이며 더 자세한 결과 뇌의 전극 위치에 대 한 간단 하 고, 간단한 방법을 설명 합니다. 전체 두뇌 오스뮴 tetroxide 물, 수 지에 포함 되며 마이크로 CT 스캐너로 촬영. 검사 결과 해상도와 가상 섹션 두께 샘플 크기에 따라 두뇌의 3D 디지털 볼륨 (쥐와 얼룩말 피리 새 류 대 한 복 당 12-15와 5-6 µ m 머리, 각각). 표면과 깊은 병 변 특징 하실 수 있습니다 및 단일 tetrodes, tetrode 배열, 전해질 장애, 그리고 실리콘 프로브도 지역화할 수 있습니다. 무료 및 독점 소프트웨어는 수동 또는 자동으로 모든 비행기와 세그먼트 볼륨에서 샘플 볼륨을 검사 하는 경험이 있습니다. 이 방법은 뇌 볼륨을 생성 하기 때문에 병 변 및 전극 비교 시간과 연구에 걸쳐 표준화 하는 데 도움이 됩니다 현재 방법에 보다 훨씬 더 높은 학위를 측정할 수 수 있습니다.

전통적으로, 두뇌는 구분 병 변 계량 하 고 전극, 찾을 스테인드 하지만이 방법은 오류 발생, 노동 집약, 일반적으로 결과의 추정을 필요 합니다. 마이크로-CT 영상에 대 한 전체 두뇌를 준비 하 여 샘플을 손상의 가능성이 크게 감소, 관심의 기능, 전체 뇌의 맥락에서 분석 될 수 있습니다 및 방법을 빌려준다 많은 샘플의 병렬 처리를 상당히 샘플 준비를 과속.
메서드는 4 개의 주요 단계를 포함 한다: (1) 얼룩 오스뮴 tetroxide와 perfused 뇌, (2) 수 지에 두뇌를 포함, (3) 마이크로 CT 스캐너로 두뇌 이미징 및 (4) 분석 결과 디지털 볼륨 (그림 1). 이 문서에서는 1-3 단계는,으로 설명 4 (분석) 단계는 프로젝트의 특정 요구에 따라 상당히 달라 집니다.
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이 문서에서는 마이크로-CT 영상, 어떤 병 변 양이 정해질 수 있다와 전극 전체 뇌의 맥락에서 높은 정밀도와 위치에 대 한 작은 동물 두뇌를 준비 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

이 방법은 병변을 확인하고 전극 위치를 찾기위한 보다 간단하고 적은 오류 경향이 및 보다 정량적인 방법을 제공함으로써 신경 과학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단면화없이 전체 뇌의 병변 및 전극 부위의 검증을 허용한다는 것입니다. 최종 제품은 뇌의 디지털 3D 볼륨이며 여러 뇌를 병렬로 처리 할 수 있습니다.이 방법은 쥐에서 입증될 것이지만, 마우스 및 얼룩말 핀치와 같은 다른 유기체에도 적용될 수 있다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 은 몇 가지 단계는 최상의 결과 보장 하기 위해 특정 주의 필요 하기 때문에 투쟁 할 것 이다. 시작하려면 추출된 뇌를 50밀리리터 원문 튜브에 주입용액에 배치합니다.샘플을 섭씨 4도에서 부드럽게 흔들어 2~3일 동안 보관하십시오. 오스뮴이 완충제가 아닌 물에 희석되어 있는지 확인하십시오. 이는 물이 가벼운 세제역할을 하여 오스뮴이 조직 깊숙이 침투할 수 있기 때문입니다.이중 증류수에 2%의 오스뮴 테트산화물 50밀리리터를 준비합니다. 그런 다음 새로운 50 밀리리터 원옥 튜브에 뇌를 배치하고 osmium 테트옥사이드 용액을 추가합니다. 튜브를 닫고 파라핀 필름으로 밀봉하여 누출을 방지합니다.밀봉된 튜브를 섭씨 4도에 보관하고 2주 동안 부드러운 흔들림을 냅니다. 튜브가 수평으로 배치되었는지 확인합니다. 뇌는 매우 두껍고 확산으로 여행하는 긴 방법입니다.튜브를 수평으로 배치하면 오스뮴이 조직 깊숙이 들어갈 수 있습니다. 샘플이 2 주 동안 배양 한 후, 샘플에서 모든 무한 한 osmium 테트산화물을 제거하기 위해 다섯 번 두 번 증류된 물로 씻어. 다음으로, 샘플을 섭씨 4도에서 30분 간 양적 증류수로 씻어내면 됩니다.이중 증류수를 에탄올 4개의 희석물로 교체하여 시료를 탈수시합니다. 수지 침투 과정을 시작하려면 3개의 아세톤과 3개의 아세톤 수지 희석제를 통해 샘플을 이동한 다음 실온에서 100% 수지로 샘플을 담그고 침투 과정을 계속합니다. 그 후 시료를 일회용 금형으로 옮기습니다.실온에서 4시간 동안 신선한 100% 수지와 샘플을 주입합니다. 45도에서 15분 동안 진공 오븐에서 샘플을 탈바합니다. 그런 다음 60 °C에서 48 시간 동안 오븐에서 샘플을 치료하십시오.마지막으로 시료가 경화되면 일회용 금형을 벗겨 내고 Micro-CT 기계로 스캔합니다. 전통적인 단면에서 뇌의 방향은 미리 결정되어야 합니다. 이 Micro-CT 방법을 사용하여, 샘플 뇌의 디지털 볼륨은 3 차원에서 조작하고 사실상 어떤 방향으로 슬라이스 할 수 있습니다.준비된 쥐 뇌의 전자 현미경 검사를 스캔하면 조직이 Micro-CT 이미징의 목적으로 크게 손상되지 않았는지 확인합니다. 얼룩말 핀치 뇌는 또한 준비 하 고 다른 작은 동물 두뇌에이 방법의 유틸리티를 테스트 하기 위해이 프로토콜에 따라 스캔. 이 기술은 뇌의 표면 병변뿐만 아니라 뇌 깊은 병변을 찾는 데 사용할 수 있습니다.이 기술은 또한 좌측, 전해질 병변, 전극 트랙, 테트로드 어레이, 그 자리에서실리콘 프로브의 단일 테트로드 의 위치에 적용될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안, 뇌가 충분히 오랫동안 충분한 동요와 함께 배양 할 수 있도록 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 광유전학과 2광자 화상 진찰 같이 그밖 방법은 다른 두뇌 지역이 다른 행동에서 재생하는 역할에 관하여 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다.이 기술은 신경 과학 분야의 연구원이 쥐, 마우스, 송버드 및 기타 작은 동물의 뇌와 행동 사이의 구조 기능 관계를 더 잘 탐구할 수 있게 할 수 있습니다. osmium과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑을 착용하고 진공 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 무선 양방향 다채널 전극 장치를 쥐의 뇌에 이식하여 다채널 신경망을 기록하고 자극하는 절차를 보여줍니다.

쥐의 뇌에 무선 양방향 미세전극 시스템 이식

출처: Choi, J. P.  et al. 마우스 모델에서 대뇌 해면 기형의 유도 및 마이크로 CT 이미징.J. Vis. 특급 (2017)이 비디오는 쥐 뇌에서 대뇌 해면상 기형(CCM) 병변을 시각화하기 위해 마이크로 CT 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 뇌 조직에서 CCM 병변의 밀도와 위치를 평가하기 위해 샘플 준비, 이미징 및 3D 이미지 재구성 단계를 자세히 설명합니다.

마우스 뇌의 대뇌 해면상 기형 병변에 대한 조영제 강화 마이크로 CT 이미징

여기 광학 삭제하고, 쥐 뇌 조직에 만성 이식 microdevices 주변의 이미지 그대로 뇌 조직 인터페이스를 라벨, 캡처하기위한 조직 학적 방법을 제시한다. 이 방법을 포함하는 기술의 결과는 주변 조직의 다양한 관통 뇌 이식의 영향을 이해하는 데 유용합니다.

뇌 이식 Microdevices과 주변 조직의 손상 조직 학적 특성

이 프로토콜 대뇌 동굴 같은 기형 질병 마우스 모델에서의 유도 및 고 사용 대비 향상 된 병 변 부담을 측정 하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영. 이 방법은 분자 기초 및 대뇌 동굴 같은 기형에 대 한 잠재적인 치료 및 기타 뇌혈관 질병 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.

유도 및 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 마이크로-CT 영상

다광자 이미징은 조직 표면의 제한된 깊이에서만 효과적이지만 pCLE를 통해 모든 깊이에서 3μm 해상도의 이미징을 달성할 수 있습니다. 여기에서는 ictal 및 야생형 마우스의 해마에서 미세혈관 역학을 측정하기 위해 pCLE 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

깨어 있는 마우스의 해마 모세혈관의 In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE)

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

여기에서는 수술 방법 및 도구, 수술 후 자기 공명 영상, 청각 피질의 전기 생리학, 임플란트의 전기 화학적 특성 및 사후 면역 화학을 설명하는 minipig 모델에서 연질 경막하 전극 어레이의 장기 성능 및 안전성 평가 방법을 제시합니다.

경막하 연피질검사(ECoG) 어레이 이식 및 Minipig의 장기 피질 기록

이 연구는 생체 외 샘플에서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)과 조영제를 결합하여 신생아 마우스 뇌의 고해상도 이미지를 얻는 단계를 설명합니다. 우리는 이러한 이미지에서 뇌 크기와 모양을 정량화하기 위한 기본 형태 분석을 설명합니다.

Micro-CT 영상 및 생쥐 신생아 뇌의 형태 분석

우리는 뇌 전기장 측정 및 관련 바이오마커-대뇌 혈류의 관점에서 두개외 자극에 대한 용량-반응 곡선을 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뇌에 침습적인 전극 배치를 포함하기 때문에 전신 마취가 필요하며 통제된 호흡보다는 자발적 호흡이 선호됩니다.

두개외 자극 전극의 배치 및 마취된 마우스의 대뇌 혈류 및 두개내 전기장 측정

밀리미터 크기의 코일과 결합된 저비용 뇌파 기록 시스템은 생체 내에서 마우스 뇌의 경두개 자기 자극을 유도하기 위해 제안되었습니다. 맞춤형의 유연한 다중 전극 어레이 기판이 있는 기존의 나사 전극을 사용하여 경두개 자기 자극에 대한 반응으로 마우스 뇌에서 다중 부위 기록을 수행할 수 있습니다.

생체 내에서 마우스 뇌를 경두개로 자극하기 위해 밀리미터 크기의 코일과 결합된 저비용 뇌파 기록 시스템

여기에서는 쥐와 생쥐의 고밀도 마이크로 전기 피질 검사(μEcoG) 기록을 위한 수술, 이식 및 기록 방법을 포함한 두 가지 프로토콜을 제시합니다. μECoG 기록은 쥐의 청각 피질에서 층류 다원(laminar polytrode) 기록 또는 쥐의 체성 감각 피질(somatosensory cortex)에서 신경 활동의 광유전학적 조작과 함께 수행됩니다.

설치류의 미세 전기 피질 조영술과 층류 폴리트로드 및 광유전학을 통합하여 피질 처리의 멀티스케일 조사

학습하세요 쥐 뇌를 이용한 micro-CT 기반 병변 특성화 및 전극 위치 선정 방법을 통해 신경과학 연구에서 구조-기능 관계를 정량적으로 분석하는 기술을.

병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

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