Name: Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 배우세요 광활성화 형광 단백질의 효율을 정량화하는 방법을 통해 신경과학 및 세포생물학 연구의 정확성을 높이세요. 이 프로토콜은 다양한 광활성화 모드의 효율을 비교 분석하여 실험 설계를 최적화합니다.

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우리는이 프로젝트에 대 한 장비와 공간을 제공 하기 위한 Dorigo 실험실 그리고 스탠포드 대학의과 대학에서 신경 과학 이미징 서비스를 감사 하 고 싶습니다.

1. 플라스 미드 건설
<ol><li>2 색 퓨전 프로브를 생성 합니다. 포유류 세포 식 벡터를 사용 하 여 ( 재료의 표참조)는 mCherry112 , PA mCherry113 제한으로 삽입 되어 있는 사이트 AgeI 및 BsrGI.
</li>
	<li>사용자 지정 올리고 뉴클레오티드 eGFP 및 PA eGFP A206K 돌연변이, 즉, mEGFP PA mEGFP14 사리 BamHI 단편으로 정지 codon 없이 포함 된 단위체 변종 증폭 주문. 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC 아 그 GGC 개 그 G 3'와 C 터미널 뇌관 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC 고양이 GC 3' N 맨끝 뇌관을 사용 하 고 식 벡터의 다중 복제 사이트에 삽입이 사리 BamHI 조각. 이것은 녹색과 적색 형광 단백질 사이 5 개의 아미노산 링커 RNPPV을 만듭니다. 우리 GFP fluorophore 키메라를 참조 한다-체리, PA-GFP-체리, 그리고 GFP-PA-벚꽃이 문서의 나머지 부분에 대 한. 참고: fluorophores의 커플링 및 photoactivation 효율성을 평가 하기 위해 내부 통치자의 창조 함께 할 수 있습니다 어떤 괴기 하 게 뚜렷한 fluorophore 쌍, 예: superfolder PA GFP 15/ PA-TagRFP 16, 등 Photoactivatable 형광 단백질의 많은 GFP에서 파생 됩니다. 따라서, 위에 제공 된 뇌관 순서 포유류 세포 식 벡터에 fluorophore 키메라를 만드는 데 많은 형광 단백질을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 세포 배양과 Transfection
<ol><li>헬러, NRK, Cos-7 또는 특정 셀 라인 데 사용할 특정 photoactivation 실험 등 모든 표준 셀 라인 중 하나를 사용 합니다. DMEM (10% 태아 둔감 한 혈 청, 그리고 2mm 글루타민 보충)을 사용 하 여 트립 신 없이 페 놀 레드 ( 재료의 표참조)을 줄이기 위해 배경 형광.</li>
	<li>트립 신 confluent 문화의 세포를 분리, 잘 당 Neubauer 챔버 및 씨앗 5000-10000 셀을 사용 하 여 셀에에서 셀의 수를 계산 합니다. T 25-세포 배양 플라스 크 또는 T 12.5-세포 배양 플라스 크에 성장 confluent 문화에서 5 mL 세포 현 탁 액에서 3 방울 또는 성장 confluent 세포 배양에서 10 mL 세포 현 탁 액의 2 mL 피 펫에서 1 방울을 사용 합니다.</li>
	<li>#1.0 커버 8 잘 실에서 세포 성장 유리 ( 재료의 표참조) 형광 라이브 셀입니다.</li>
	<li>GFP와 배포자의 프로토콜 당 상업용 시 약 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 도금 후 셀 24 h transfect-체리, PA-GFP-체리, 그리고 GFP-PA-체리 키메라.</li>
	<li>20 h의 총 후 이미지 세포 transfection 단백질 표정, 접는 및 성숙 수 있도록 게시 합니다.</li>
</ol>3. 이미징 및 Photoactivation
<ol><li>섭씨 37도에서 습도 열 환경 챔버에 이미지 셀. 생리 적 pH에서 셀 미디어를 버퍼링 하 고 CO2렌더링-독립, 추가 20 mM HEPES, 또는 5 %flow 설정 하는 CO2 가스를 사용 하 여.</li>
	<li>먼저, 이미지는 GFP를 표현 하는 세포-체리 구문. 공초점 이미지, 즉, 픽셀의 유지 시간 (마이크로초)에서, %, 및 디지털 줌 acousto 광학 가변 필터 (AOTF) 전송에서 픽셀 당 시간 통합 레이저 강도 정의 하는 매개 변수를 설정 합니다. 참고: 60 x 목표 및 3 x 디지털 줌 사용 하 여 충분 한 확대를 제공 하면서 전체에서 셀의 이미지를 수 있습니다. 이미지 어떤 표백 없이 좋은 신호 대 잡음 비율을 표시 하 고 형광 강도 채도 나타내는 아무 픽셀 2-4 μ 및 AOTF 전송 488 nm 및 561-nm 레이저에 대 한 픽셀의 유지 시간을 설정 합니다.</li>
	<li>이미지를 사용 하 여 설정된 레이저 전원, AOTF 전송, 픽셀의 유지 시간 및 디지털 줌, GFP를 표현 하는 15-20 셀-체리.</li>
	<li>그런 다음, 동일한 설정된 레이저 전원, 픽셀의 유지 시간, AOTF 전송 및 디지털 줌 셀 GFP 표현 이미지-PA-체리와 PA-GFP-체리. 녹색 채널 또는 빨강 채널, 셀을 각각 표현에 대 한 검색. 형광 단백질을 표백 하지 위하여 세포를 표현 하기 위한 검색 하는 동안 셀의 긴 노출을 피하십시오.</li>
	<li>하나의 사전 활성화 이미지와 세 후 활성화 이미지 미니 시계열을 설정 합니다. 후 정품 인증 이미지는 UV 빛에 노출 때문에 잠재적인 과도 어두운 상태를 식별 하는 데 도움이 됩니다. 참고: 우리 손에서 검출 된 형광 강도 임시 어두운 상태 때문에 변화 했다 < 1% 수 무시, 하지만 모든 실험 설정에 대 한 그 어두운 상태를 평가 합니다.</li>
	<li>확인 하려면 photoactivation 효율성, 즉, 이미 설정 된 특정 photoactivation 실험에서 형광 수 켜져 PA FPs의 분수 15-20 셀 같은 photoactivation 설정을 적용 하는 여기 소개 하는 내부 통치자를 표현 하 고 이미지 분석 (제 4). Photoactivation 실험 설정 하기 시작 하는 경우 찾기 여기 몇 가지 다른 설정을 PA GFP와 PA-체리; 우리의 실험 경험에 따라 필요에 따라 수정 합니다.<ol>
<li>PA GFP의 PA-체리 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)를 사용 하 여 즉각적인 photoactivation에 대 한 405 nm 레이저 3 또는 5 반복에서 빛의 90 μW를 각각 적용 합니다. 참고: 우리의 미세한 설정 38 %AOTM 전송과 2 µs 픽셀 망설임 시간을 사용 하 여 우리 측정 대물 렌즈에 라인 스캔 모드에서이 405 nm 레이저 전원. 이러한 설정을 사용 하 여 약 8%와 16%의 PA-GFP와 PA-체리 표현 형광등 수를 photoactivated 수 있습니다. 즉각적인 photoactivation 되어 CLSM를 사용 하 여 전체 적정 시리즈 출판 이전17.</li>
		<li>Photoactivated PA-GFP와 PA-체리 fluorophores의 높은 분수 유리 예: 높은 신호 대 잡음 비율을 달성 하 고 photoactivation 즉시 될 필요가 없습니다, 405 nm 레이저 2 μ 픽셀 유지 시간 및 6% 빛의 40 μW 적용 AOTF 전송 450 반복입니다. 다음, photoactivation는만 1-2 초 반대로 최대 4 분 소요 됩니다 하지만 PA GFP에 대 한 photoactivation 효율 29% 8%, 더 높은 신호 대 잡음 비율에 대 한 허용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공간 광 변조기에 마이크로 미러 어레이 포함 하는 모자이크 디지털 조명 시스템을 사용할 수 있는 경우 widefield-photoactivation에 대 한 405 nm 레이저 빛을 사용할 수 있습니다. 효율적인 photoactivation 밀리초 내에 대 한 수 있습니다. 참고: 1.6 mW 레이저 전원 대물 렌즈와 250 ms의 노출 시간에 측정 된, PA GFP의 29% 형광등 수를 photoactivated 될 수 있습니다.</li>
	<li>매개 변수 설정된 photoactivation PA-GFP를 표현 하는 15-20 셀 이미지-체리와 GFP-PA-체리, 각각.</li>
	<li>관심사의 단백질은 각각 subcellular micromilieu에 PA FPs의 photoactivation 효율성을 평가 하는 것이 중요 수 때문에 pH, 반응 산소 종 및 기타 환경 요인 photoactivation 효율성 영향을 미칠 수 있습니다, 위치 해 있습니다. Fluorophore 키메라 관심사의 단백질에 결합 하 여 저자 플라즈마 막 단백질 VSVG 18와 함께 할 관심의 특정 subcellular 구획에서 photoactivation 효율성 평가 수 있습니다.</li>
</ol>4. Photoactivation 효율의 비율 기준 강도 기반 정량화에 대 한 이미지 분석 및 알고리즘
<ol><li>이미지 분석 플랫폼 ImageJ 또는 피지를 처리 하는 오픈 소스 이미지와 함께 할 수 있습니다. 비 페 셀 (B1) 녹색과 빨강 (B2) 채널에에서 배경 형광 강도 결정 합니다. Perinuclear 또는 어떤 증가 자동 형광 표시 하지 마십시오.</li>
	<li>Transfected 세포에 형광 강도 확인 하려면 셀 시체 자유형 선택 도구를 설명 합니다. 다시, perinuclear 또는 어떤 다른 자동 형광 표시 하지 마십시오.</li>
	<li>각 채널에 측정 된 형광 강도에서 배경 빼기. 나G 나Green_measured -B1 = 내가연구 내가Red_measured -B2 를 =
</li>
	<li>GFP를 사용 하 여-빨강-녹색 비율 (RtoGr)와 기증자-형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 때문에 냉각에 대 한 수정 벚꽃 구문. 무서 워 효율 E는 GFP에 대 한 이전 실험에서 0.3을 결정 했다-벚꽃 구문 두 fluorophores18사이 동일한 아미노산 링커를 사용 하 여. RtoGr = (나Red_measured -B2) / (나Green_measured -B1) RtoGr코어 RtoGr = * (1-E) 참고:이 강도-기반 접근, 냉각 하는 mEGFP 및 PA-mGFP에 대 한 기증자 수 있습니다 주어진 가능한 독특한 스펙트럼 속성 특징 되지. 무서 워 (kET)의 속도 Foerster 거리 (R0) mEGFP 및 PA-mGFP 결정 되지 않은 기증자의 양자 수율에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>GFP를 사용 하 여-photoactivated PA-체리의 분수를 평가 하기 위해 PA-체리 구문. PA-체리의 예상된 형광 강도 GFP의 측정된 unquenched 녹색 형광 강도 곱하여 결정-PA-체리 구성 이전 에 수정 된 레드--녹색-비에로 photoactivation (RtoGrcorr ). 내가Red_expected (IGreen_measured -B1) = * RtoGrcorr 참고: 위에 표시 된 대로 항상에 FP와 photoactivatable FP의 분자 밝기 달라질 수 있습니다. 이러한 차이 대 한 계정 하는 방법에 대 한 자세한 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>PA-체리 photoactivation 효율성 측정된 빨간색 형광 강도 후 photoactivation 및 예상된 형광 강도 빨강 채널에의 한 분수를 계산 합니다. (FPA-체리) = (나Red_measured -B2) / 나Red_expected
</li>
	<li>PA-GFP를 사용 하 여 — photoactivated PA-GFP의 분수를 평가 하기 위해 벚꽃 구문. PA-GFP의 측정 된 빨간 형광 강도 나누어 PA GFP의 예상된 형광 강도 결정-체리 레드-에-녹색-비율 (RtoGr)에 의해 이전 에 photoactivation 구성. 여기는 RtoGr GFP와 PA GFP 냉각 하는 동일한 금액을 기증 받습니다 때문에 냉각 하 고, 기증자에 대 한 수정 될 필요가 없습니다. 내가Green_expected = (나Red_measured -B2) / RtoGr</li>
	<li>PA GFP photoactivation 효율성 측정된 녹색 형광 강도 후 photoactivation 및 녹색 채널에 예상된 형광 강도의 한 분수를 계산 합니다. (FPA-GFP) = (나Green_measured -B1) / 나Green_expected
</li>
</ol>

<ol><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
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<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li>
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<li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li>
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<li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 PA-FPs의 라이브 셀에서 표현 photoactivated 형광 하는 분수 결정에 존재. 어떤 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 쌍 제시 프로토콜을 사용할 수 있습니다. PA FPs PA-GFP와 PA-체리는 돌이킬 수 없는 대 한 여기 exemplified, 동안이 방식은 원칙적으로 뿐만 아니라 photoconvertible 단백질에 적용 합니다. 그러나 괴기 하 게 고유한 형광 단백질,, 선택 되어야 합니다 신중 하 게 photoconvertible 형광 단백질 이동 그들의 흡수도 및 방출 스펙트럼, 예를 들면 녹색에서 빨간색 형광을 그 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해.
위에서 설명한 대로 제시 접근 비율입니다 상태로 중요 하 고 강도 기반입니다. 그것은 photoactivation의 다른 모드 셀에 알 수 없는 표현 레벨을 표준화 하 고 photoactivation 효율성에서 상대적인 차이 정의를 사용할 수 있습니다. 프...

2002 년, 첫 번째 광범위 하 게 적용 가능한 photoactivatable (PA-GFP1) 및 photoconvertible (가2) 형광 단백질 설명 했다. 자외선과, 즉, 방사선 조사 시 스펙트럼 그들의 속성을 변경 하는이 광 형광펜 형광 단백질 그들은 밝은 될 (photoactivatable 형광 성 단백질, 즉, PA FPs), 또는 (photoconvertible 그들의 색상을 변경 FPs)입니다. 날짜 하려면, 여러 가지 되돌릴 수와 돌이킬 수 없는 photoactivatable 및 photoconvertible 형광 단백질 개발된3,4되었습니다. 앙상블 또는 대량 연구, 광학 형광펜 subcellular 구획의 연결 전체 셀 또는 단백질의 역학을 공부 하 고 사용 되었습니다. 또한, 광학 형광펜 사용 단일 분자 이미징 기술이 팜5 FPALM6해상도 기반으로 합니다.
비록 중 사진화학 처리 photoactivation 또는-변환 설명 되었습니다. 많은 광학 형광펜 및 심지어 결정학 구조 photoactivation 전후 /-변환 사용할 수7 되었습니다. , 8, photoactivation 및-변환의 기본 사진물리적 메커니즘 완전히 이해 하지는. 또한, 지금까지 원유 추정 존재의 photoactivation-변환 효율의 즉, 즉 표현 형광 단백질의 분수 실제로 photoconverted 또는 형광 수 photoactivated. 네이티브의 양과 흡수 스펙트럼의 변화를 측정 하 고 젤9,,1011에 단백질 활성화 앙상블 연구 생체 외에서 보고 되었습니다.
여기, 선물이 photoactivated 형광 단백질 대량에서 및 라이브 셀에 분수를 평가 하기 위해 형광 단백질 키메라를 포함 하는 프로토콜. 때마다 형광 단백질 유전자 인코딩된 작업, 표현 하는 단백질의 절대 크기가 셀에서 변화 하 고 알. PA FP를 표현 하는 하나의 셀 다른 셀 보다 photoactivation 후 밝은 신호를 보여줍니다, 경우이 밝은 신호 파 FP의 높은 식 또는 PA-FP의 더 효율적인 photoactivation 분화 될 수 없습니다. 셀에 식 수준 표준화, 유전자 결합된 spectrally 고유한 형광 단백질의 내부 통치자 소개 합니다. 괴기 하 게 뚜렷한 항상에 형광 단백질, 내부 통치자 photoactivatable 형광 단백질의 유전 정보가 만들어집니다 커플링으로는 여전히 표현 됩니다 알 수 없는 총 금액만의 고정 및 알려진 상대 금액에서 1:1.이이 전략 수 제도의 다른 UV 빛 photoactivation, 즉, 양적 특성 photoactivation, 다른 모드와 photoactivated 수를 그로 인하여 허용 PA FPs의 상대적인 양의 평가 다른 사람 보다 더 효과적인 photoactivation 스키마를 정의 합니다. 또한,이 전략 photoactivated PA FP 분수의 절대 정량화 평가 원리에 있습니다. 이 위해, 그것은 제시 앙상블 연구는 강도-기반 분석으로이 프로토콜에 누워 복잡 한 게 실현 하는 것이 중요. 측정 된 형광 강도, 즉, 다른 분자 밝기, 흡 광도 및 방출 스펙트럼 무서 워 효과 결정 하는 매개 변수 다른 형광 단백질의 형광 강도 비교할 때 고려 될 필요가 있다.
Photoactivation 효율성의 제시 비율 강도 기반 정량화 GFP PA 및 PA-벚꽃 라이브 셀에 대 한 예증 하지만 원칙적으로 광범위 하 게 적용 및 어떤 photoactivatable 형광 단백질에서 사용 될 수 있습니다. 실험 조건입니다.

<table><tbody><tr><td>pEGFP-N1 포유류 세포 발현 벡터</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM w/o 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>페놀 없는 트립신 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LabTek 8웰 챔버 #1.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr></tbody></table>

photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Photoactivatable 및-컨버터블 형광 성 단백질 (PA-FPs) 세포와 단백질 앙상블의 역학을 분석 하기 위한 형광 라이브 셀 현미경에 사용 되었습니다. 지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 계량 수 되었으며 라이브에서 PA-FPs의 얼마나 많은 표현 세포 형광을 photoactivated 있습니다.
여기, 우리가 현재 내부 통치자를 포함 하는 프로토콜, 즉, 유전자 결합 spectrally 별개 (photoactivatable) 형광 단백질, ratiometrically 모든 PA-FPs의 것에 전환 하는 셀에 표시의 일부분을 계량 형광. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 나왔고 보여줍니다. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 고 전력 photoactivation CLSM으로 적용 하는 낮은 수준의 노출 또는 widefield 조명에 의해 적용 짧은 펄스의 수백 보다 4 배 더 낮은 photoactivation 효율까지 결과. 프로토콜 GFP (펜 실바 니 아-)와 (펜 실바 니 아-) 체리 여기 궁 행 되는, 하는 동안 그것은 원칙에 적용할 수 있습니다 어떤 괴기 하 게 명료한 photoactivatable 또는 photoconvertible 형광 단백질 쌍 및 모든 실험 설정.

여기에 제시 된 프로토콜 표시 photoactivated 형광 수은 형광 단백질의 분수의 비율 정량화 (그림 1). 이 분수는 photoactivation의 모드에 따라 다릅니다.
Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 시간 고 전력 photoactivation를 사용 하 여 일반적인 결과 그림 2 c에 표시 됩니다. 픽셀에 의해 대물 렌즈에서 측정 된 레이저 힘 titrating 후 연연 시간 및 ATOF 전송, 최대 photoactivation 효율 PA GFP가 약 8%와 PA-체리에 대 한 약 16%. PA GFP와 PA-체리의 comparably 낮은 photoactivation 효율성 동시 photoactivation 및-CLSM에...

여기, 선물이 형광 단백질 유전자 결합된 괴기 하 게 명료한 photoactivatable를 포함 하는 프로토콜. 이러한 형광 단백질 키메라 photoactivation 효율성 즉, 형광, 수의 photoactivated는 PA FP 분수의 정량화를 허용 합니다. 프로토콜은 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 산출을 보여준다.

Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

우리는 여기에 유전적으로 결합 된 스펙트럼 고유의 사진 활성 및 형광 단백질을 포함하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 내부 통치자는 형광으로 활성화된 사진이 되는 PAFP 분획의 정량화를 허용합니다. 지금까지, 어떤 방법은 형광에 활성화 된 사진 표현PAFP의 얼마나 많은 생명 세포에서 대량으로 정량화 할 수 없었다. 사진 활성화 효율의 제시된 정량화는 살아있는 세포에서 PA-GFP 및 PA Cherry에 대한 예시이지만 원칙적으로 광범위하게 적용가능하며 실험 적인 조건 하에서 모든 사진 활성형 형광 단백질에 사용할 수 있습니다. 유전적으로 인코딩된 형광 단백질로 작업할 때마다 발현된 단백질의 절대양은 세포마다 다르며 알 수 없습니다. 세포 간 발현을 표준화하기 위해, 우리는 유전적으로 결합된 광등 단백질의 내부 통치자를 소개합니다. 사진 활성성 식물성 단백질의 유전정보를 형광 단백질 내부 눈금자에 항상 구별하는 것으로 결합함으로써 여전히 알려지지 않은 총양으로 표현되지만 1대 1의 고정된 상대적 양으로 발현된다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 구성하기 시작합니다. 또한, 페놀 레드 프리 버전을 이용한 원근 매체에서 표준 세포주에서의 배양. 실험을 시작할 준비가 되면 페놀 레드없이 트립신을 사용하여 세포를 수확하여 배경 꽃을 줄입니다. 수확 후, T 12.5 세포 배양 플라스크에서 자란 컨부유한 세포 배양으로부터 세포 현탁액으로 2ml 파이펫을 채우세요. 8개의 챔버 유리 슬라이드의 각 챔버에 한 방울을 추가합니다. 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 슬라이드를 배양합니다. 다음으로 유통 프로토콜에 따라 상용 시약을 사용하여 세포를 트랜스펙트합니다. GFP 체리, PA-GFP 체리와 GFPPA 체리 키메라와 세포를 트랜스펙트. 그런 다음 단백질 발현, 접이식 및 성숙을 허용하기 위해 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 총 20시간 후, 가습및 가열된 환경챔버를 장착한 공초점 플로리센트 현미경의 단계로 세포를 37시간으로 미리 데워

how-to-quantify-fraction-photoactivated-fluorescent-proteins-bulk

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 프로토콜은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 형광 단백질 photoconversion을 수행하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 우리는 puried 단백질 샘플 photoconversion뿐만 아니라 mOrange2과 Dronpa 살 세포의 듀얼 프로브 광학 하이라이트를위한 절차를 설명합니다.

라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 채용함으로써, 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 효율성의 픽셀 수준의지도 게이 oligomeric 단지를 형성하기 위해 가상 막 수용체를 표현하는 세포를 얻을 수있다. 효율성의지도 걱정부터, 우리는 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 정보를 추정 할 수 있습니다.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

배우세요 광활성화 형광 단백질의 효율을 정량화하는 방법을 통해 신경과학 및 세포생물학 연구의 정확성을 높이세요. 이 프로토콜은 다양한 광활성화 모드의 효율을 비교 분석하여 실험 설계를 최적화합니다.

Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법

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