Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법
2019년 1월 7일
여기, 선물이 형광 단백질 유전자 결합된 괴기 하 게 명료한 photoactivatable를 포함 하는 프로토콜. 이러한 형광 단백질 키메라 photoactivation 효율성 즉, 형광, 수의 photoactivated는 PA FP 분수의 정량화를 허용 합니다. 프로토콜은 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 산출을 보여준다.
우리는 여기에 유전적으로 결합 된 스펙트럼 고유의 사진 활성 및 형광 단백질을 포함하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 내부 통치자는 형광으로 활성화된 사진이 되는 PAFP 분획의 정량화를 허용합니다. 지금까지, 어떤 방법은 형광에 활성화 된 사진 표현PAFP의 얼마나 많은 생명 세포에서 대량으로 정량화 할 수 없었다. 사진 활성화 효율의 제시된 정량화는 살아있는 세포에서 PA-GFP 및 PA Cherry에 대한 예시이지만 원칙적으로 광범위하게 적용가능하며 실험 적인 조건 하에서 모든 사진 활성형 형광 단백질에 사용할 수 있습니다. 유전적으로 인코딩된 형광 단백질로 작업할 때마다 발현된 단백질의 절대양은 세포마다 다르며 알 수 없습니다. 세포 간 발현을 표준화하기 위해, 우리는 유전적으로 결합된 광등 단백질의 내부 통치자를 소개합니다. 사진 활성성 식물성 단백질의 유전정보를 형광 단백질 내부 눈금자에 항상 구별하는 것으로 결합함으로써 여전히 알려지지 않은 총양으로 표현되지만 1대 1의 고정된 상대적 양으로 발현된다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 구성하기 시작합니다. 또한, 페놀 레드 프리 버전을 이용한 원근 매체에서 표준 세포주에서의 배양. 실험을 시작할 준비가 되면 페놀 레드없이 트립신을 사용하여 세포를 수확하여 배경 꽃을 줄입니다. 수확 후, T 12.5 세포 배양 플라스크에서 자란 컨부유한 세포 배양으로부터 세포 현탁액으로 2ml 파이펫을 채우세요. 8개의 챔버 유리 슬라이드의 각 챔버에 한 방울을 추가합니다. 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 슬라이드를 배양합니다. 다음으로 유통 프로토콜에 따라 상용 시약을 사용하여 세포를 트랜스펙트합니다. GFP 체리, PA-GFP 체리와 GFPPA 체리 키메라와 세포를 트랜스펙트. 그런 다음 단백질 발현, 접이식 및 성숙을 허용하기 위해 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 총 20시간 후, 가습및 가열된 환경챔버를 장착한 공초점 플로리센트 현미경의 단계로 세포를 37시간으로 미리 데워
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개요
본 논문은 유전적으로 결합된, 분광학적으로 구별되는 광활성화 및 형광 단백질을 이용하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 키메라 단백질을 통해 형광을 띠게 되는 PA-FP 분획의 광활성화 효율을 정량화할 수 있으며, 이를 통해 서로 다른 광활성화 모드가 각기 다른 효율을 나타낸다는 점을 밝힙니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 형광 단백질 기술
- 광활성화 기술
배경
- 형광 단백질은 생물학 연구에서 필수적인 도구입니다.
- 광활성화 형광 단백질은 형광의 시공간적 제어를 가능하게 합니다.
- 정확한 실험 결과를 얻기 위해서는 광활성화 효율을 이해하는 것이 매우 중요합니다.
- 활성화 방법의 차이가 이러한 단백질의 성능에 영향을 미칠 수 있습니다.
연구 목적
- 광활성화 효율을 평가하기 위한 프로토콜을 개발한다.
- 다양한 광활성화 모드의 효과를 비교한다.
- 연구에서 형광 단백질 키메라의 유용성을 높인다.
사용된 방법
- 광활성화 및 형광 단백질의 유전적 결합.
- 광활성화 분율의 정량화.
- 다양한 광활성화 기술의 비교.
- 광활성화 효율 분석.
주요 결과
- 광활성화 모드에 따라 효율이 다르게 나타났습니다.
- 본 프로토콜을 통해 광활성화 효율을 성공적으로 정량화하였습니다.
- 형광 단백질 키메라가 연구 응용 분야에서 상당한 잠재력을 보여주었습니다.
- 획득한 통찰은 광활성화 가능 단백질을 사용하는 향후 연구에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.
결론
- 본 연구는 연구자들에게 유용한 프로토콜을 제공합니다.
- 광활성화 효율을 이해하는 것은 실험 설계에 있어 매우 중요합니다.
- 향후 연구는 이러한 발견을 바탕으로 형광 단백질 사용을 최적화할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
형광 단백질의 광활성화 효율을 정량화하는 것은 라이브 셀 이미징의 중요한 공백을 메워 단백질의 동적 행동을 더욱 신뢰성 있게 해석할 수 있게 합니다. 이러한 능력은 광활성화 프로브 성능에 대한 측정 가능한 파라미터를 제공함으로써 타겟 검증 및 분석법 개발을 지원합니다. 프로브 활성화에 대한 예측 신뢰도가 향상되면 표현형 스크리닝 및 중개 바이오마커 연구와 같은 후속 응용 분야에서의 기전적 모호성이 감소합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 성공적으로 활성화된 광활성화 가능 단백질의 분율을 정량화함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 세포 간 발현 변동성을 정규화하기 위한 비례 측정 방식의 내부 대조군을 제공합니다.
- 예측적 가치: 서로 다른 단백질 변이체 또는 조건 간의 광활성화 효율 비교를 가능하게 하여 리드 물질 발굴을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 분석 최적화를 위해 광활성화 효율의 표준화된 정량적 판독값을 생성합니다.
- 재현성: 유전적으로 결합된 내부 척도를 사용하여 실험 반복 시 일관된 상대적 발현을 보장합니다.
- 확장성: 벌크 및 생세포 형식과 호환되어 고함량 스크리닝 워크플로우로의 통합이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 광활성화 효율을 질환 관련 시스템의 기능적 판독값과 연결함으로써 기전적 리스크 감소를 촉진합니다.
- 예측 신뢰도: 정량적인 광활성화 성능을 바탕으로 리스크가 조정된 개발 진행 결정을 가능하게 합니다.
- 바이오마커 정렬: 전임상 모델에서 종단적 추적을 위한 광활성화 리포터의 개발을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 표적 검증부터 분석법 개발, 전임상 평가에 이르는 발견 연속체에 적합하며, 특히 단백질 활성의 시공간적 제어가 필요한 경우에 유용합니다.
- 발견 생물학: 살아있는 세포 내 광활성화 프로브의 활성화 분율을 정량화하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 절대적인 발현 수준과 무관한 비례 측정(ratiometric measurement)을 통해 분석의 표준화를 가능하게 합니다.
- 분석: 활성화 모드의 비교가 가능한 정량적 종속 변수 측정값(광활성화 분율)을 제공합니다.
- 중개 연구: 질환 모델에서 광활성화 리포터의 표준화된 평가를 가능하게 함으로써 전임상 연속성을 확보합니다.
- 기업적 재사용: 스펙트럼상 구분이 가능한 모든 광활성화 형광 단백질 쌍을 평가할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 광활성화 프로브 성능에 대한 예측 신뢰도를 높이고, 활성화 기반 분석법에서의 위음성을 줄입니다.
- 운용적 가치: 여러 연구실과 실험 설정 간의 재현성 및 표준화를 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 정량적인 활성화 효율 데이터를 제공함으로써 프로브 선택 시의 고/노고(go/no-go) 결정 능력을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 검증된 성능 지표를 바탕으로 광활성화 도구의 위험 조정 우선순위 선정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 유전적으로 결합된 형광 단백질 키메라를 생성하기 위해 분자 클로닝 전문 지식이 필요합니다.
- 광활성화 기능이 있는 공초점 또는 광시야 형광 현미경의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 사용자 간의 이미징 파라미터 및 광활성화 프로토콜의 표준화가 필요합니다.
- 대상 세포주에서 키메라의 기능성과 스펙트럼 분리 능력을 검증해야 합니다.
- 형광체의 유전적 결합이 단백질의 기능이나 국소화를 저해하지 않는 시스템으로 제한됩니다.
