Name: Biocytin 복구 및 채워진된 Hippocampal CA2 수의 3D 복원 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 학습하세요 해마 CA2 중간뉴런의 생리학적 기록 후 고품질 3D 재구성 방법을 통해 신경 세포 형태학과 기능을 정밀 분석하는 기술을. 이 프로토콜은 수상돌기와 축삭돌기 보존에 최적화되어 있습니다.

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이 연구는 노바 티 스 제약 (바젤) 및 의료 연구 위원회 교수 알렉스 톰슨, 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC-BB/G008639/1), 생리 적인 사회, 유럽 연합의 수 여에서 자금 받았다 수평선 2020 프레임 워크 프로그램 연구 및 혁신 특정 부여 계약 번호 720270에서 (인간의 두뇌 프로젝트 SGA1)에 대 한 특정 권한 부여 계약 번호 785907에서 (인간의 두뇌 프로젝트 SGA2). 우리는 매우 감사 교수 알렉스 톰슨에 자금 확보, 다른 대뇌 피 질의 영역에 프로토콜을 설정 하 고 그녀의 지속적인 지원을 위해이 프로젝트에 대 한. 연구소-회원 복구 프로토콜을 최적화 하는 데 도움이 및 CA2 뉴런을 재건 기여는 인정 하 고 기꺼이: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. 휴즈, A. P. 베 니, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
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<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
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<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
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<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
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<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
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<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
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<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

Electrophysiological 녹음에서 생체 외에서 (그림 1 Ac,d 및 Bc, d) 조직화 학적인 결합 및 immunohistochemical 절차 세부 형태, 칼슘 바인딩 단백질 콘텐츠를 사용 및 성숙한 대뇌 피 질의 수의 정체성 밝혀 기록. CA2 영역에서이 기술을 처음으로 지역 회로의 연구 허용 한 CA1 또는 CA3에서 이전에 설명 하지 않는 했다 수의 서브 클래스 공개: 넓은 수지상 및 axonal 아 버 바구니 세포 (그림 1B), bistratified 세포와 SP SR 수입니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 보존 하는 뉴런의 열 대권 외 고 얻을 수지상 (등 쪽이) 및 axonal 버는 우수한 복구 최적화 되었습니다. 중요 한 단계 가벼운 현미경 검사 법26 대비 향상을 이중 고정 기술의 사용 등도 picric 산 솔루션 항 체 침투를 강화 하 고는 신경 보존을 통 솔루션을 추가 열 대권 외의27 부드러운 동결-해 동 permeabilization osmication 및 수 지 포함 z-비행기 수축28을 줄일 수 있지만 미세 구조의 더 나은 보존을 제공 합니다. 또한, 매우 미세 구조 (예를 들어 작은 boutons와 축 삭 괜 찮)의 시각화 잠복기 섹션 H2O2 와 NaBH4 배경 얼룩을 줄이기 위해 향상 됩니다. 대비는 HRP 반응에 NiCl2 의 추가 함께 또한 증가 수 있습니다.
여기서 설명 하는 조직학 절차 재현성 및 신뢰성 측면에서 우수한 결과 제공 합니다. 그러나, electrophysiological 녹음 기간 biocytin/형광 얼룩, 가난한 axonal 얼룩과 일반적으로 관련 된 짧은 녹음의 품질을 결정 합니다. 프로토콜 (사용 하 여 전체 셀 패치 클램핑 대 날카로운 전극 세포내 녹음) 녹음의 선택 또한 biocytin 보존 및 미세 해부학의 보존에 영향을 미칠 수 있습니다.
어려움에 발생 하는 동안 감사는 여기에 설명 된 조직학 처리 및 100 배 확대 (축 삭의 복잡도 따라 1-4 주간)에서 재구성 하는 데 걸린 시간 동안 미세 구조를 보존, 제공 하는이 메서드는 돌기 및 axonal 직경의 정확한 표현입니다. 그러나 적은 biocytin 라벨을 요구 하는 프로토콜의 사용은 이해할 수 있다,, 이들은 종종 훌륭한 axonal 분기의 명확한 시각화 배제. 세제, Avidin-HRP biocytin 및 항 체, 공개 항목을 홍보 하는 종종 두꺼운 부분에 필요 하지만 미세 구조를 혼란 시킬 수 있다. 신경 검색 지속적으로 반자동 방식의 재건, 하지만, 지금은 하 고 수동 재구성으로 특히, biocytin HRP axons 금31남아 있습니다.
매우 상세한 신경 개조, 특히 정확한 도면 axonal boutons 및 노드, 존재 또는 부재 myelin의와 더 일반적으로 정확한 축 삭 직경의 표현으로 완전 한 axonal 아 버의 그림을 따라 변경의 길이, interneurone의 다른 종류의 정확한 식별에 대 한 정보를 추가 제공. 위에서 설명한 기술을 신경 electrophysiological 속성, 및 연결의 특정 종류와 관련 된 상세한 단기적인가 소성에 상호 관련 된 데이터를 제공 합니다 많은 수는 특정 클래스에 정확히 맞지 않을 수도 있습니다, 비록 신경 개조, 배선 다이어그램, CA2 영역, 예를 들어 자세히 공부 수 있도록
정밀한, 상세한 구조는 종종 전산 모델 간소화 됩니다. 반면, 미래에 중요 한 증명할 수 있는 정보의 손실 발생 합니다. 병렬 시 냅 스 데이터와 상세한 3D 복원의 분석 조건의 더 interneuronal 분류에 대 한 추가 수 있습니다. 데이터 공개 저장소에 고 modellers 계산 축 삭 직경 및 myelination 활동 전위 전파에 산발적 변경의 결과 탐구 하는 데 사용 될 수 있습니다.

피 질과 해 마는 이러한 복잡성을 신경의 분류 하위1,2,3,4, 그들 사이 연결의 지도5,6 의 구조 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 고이 회로 인지 기능12,13,,1415 를 지원 하는 방법을 아직도 강렬한 연구와 지속적인 토론의 주제 아래 있습니다. 예를 들어 세부 사항 및 회로의 복잡성을 이해 하 고 많은 다른 연구에서 얻은 데이터를 조정 그것 정의 하 고 구성 요소, 설명 수 친절 하지만 어떻게 논쟁에 대 한 문제에 남아 있다 다른 많은 클래스의 존재, 또는 특정 클래스에 속한 모든 신경 세포를 정의 가능 여부입니다. 전산 도구를 구축 하 고 복잡 다양 한 각도와 회로 테스트할 수 있습니다 개발된16,,1718, 하지만 이러한 노력에 중앙은 셀 유형의 상세한 연구에 대 한 필요성 그리고 그들 사이 연결의 속성. 많은 양의 성인 쥐의 피 질 지역 회로 대 한 정보는 이미 수집 된를 사용 하 여 프로토콜 설명 여기10,,1920,21, 22. "배선 다이어그램" 완전 한에서 멀리 이다, 일부 취소 패턴 또는 규칙 등장. 또한, 일부 내용은 다르지만, 이러한 규칙은 일반적인 두 포유류 종 (쥐와 고양이)와 여러 neocortical 지역에 걸쳐 인간의 피 질에 동등 하 게 적용 될 가능성이 기본 빌딩 블록의 개발을 허용. 여기에 설명 된 기술은 식별 연 접 및 postsynaptic 신경 영역을 공부 하지 않은 전에, 자세하게는 프로토콜을 사용 하 여 연결에 참여 하 여 대뇌 피 질의 회로의 기능 지도 대 한 우리의 이해를 확장 하는 데 사용 됩니다. 그 성인 뇌 조직에 우수한 조직 보존 및 놀라운 얼룩 복구 수 있습니다. CA2에 로컬 회로 및이 하위 필드 연결 속성에는 데이터, biocytin 세포내 electrophysiological 녹음 (쌍된 녹음 날카로운 microelectrodes와) 결합 하 여이 방법으로 수집 된 면역 형광 검사, 조직학 절차 및 매우 상세한 신경 개조, 이웃 캘리포니아 지역23,,2425와 직접 비교를 허용.
이 문서에서 설명 하는 기술은 자세한 신경 해부학 세포와 높은 품질의 정확한 분류와 둘 다 그들의 수지상 및 axonal 아 버, 될 수 있는 데이터의 정확한 개조를 수 년에 걸쳐 개발 되었습니다. 날카로운 전극을 사용 하 여 쌍을 이루는 녹음에서 수집한 electrophysiological 데이터와 상관 된다. 조직학 프로토콜은 보존 하는 뉴런의 열 대권 외 고 얻을 수지상 (등 쪽이) 및 axonal 버는 우수한 복구 최적화 되었습니다. 예를 들어 통 솔루션에 immersing 첫째와 둘째 오스뮴 tetroxide에 고정 후 이중 고정 기술의 원리는 가벼운 현미경 검사 법26좋은 대조를 제공 합니다. 글 고 picric 산 솔루션의 소량 항 체 침투를 강화 하 고 세포의 열 대권 외의 이전 연구27에 제안으로 보존 하 통 솔루션에 추가 됩니다. 전통적인 세제 보다는 자당, cryo-보호와 함께 동결-해 동 방법을 사용 하 여 뇌 조각의 permeabilization 또한 기록 된 셀의 자세한 형태소 분석에 대 한 조직의 최적의 보존을 제공 합니다. 또한, 특히 매우 미세 구조의 시각화는 배경, 과산화 수소 (H2O2)와 나트륨 borohydride (NaBH4) 외피와 착 색을 줄임으로써 향상 됩니다. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 니켈 염화 물 (NiCl2)를 추가 검은 색소 반응 제품을 얻기 위해 반응 또한 대비를 높입니다.
다음 프로토콜 우수한 조직 보존 및 매우 상세한 신경 3D 복원 생체 외에서세포내 기록을 확인 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 조각 준비 설명 사용 하 여 세포내 짝된 녹음 날카로운 전극 그리고 우리의 실험실에서 사용 되는 후속 조직학 절차 이전에 보고 된28. 450-500 μ m 두꺼운 조각에서 biocytin 침 가득 셀에 적용 되는 프로토콜, 비록 동일한 프로토콜 전체 세포 기록에 따라 사용할 수 있습니다. 그러나, 얇은 슬라이스를 사용 하 여 셀의 덜 완전 한 복원 발생 합니다.

<table><tbody><tr><td>Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) 항체- 20.8 mg/mL&nbsp;</td><td>벡터 연구소</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>바이오싸이틴&nbsp; &ge; 98% (TLC)</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 디아미노벤지딘(DAB) 정제, 5mL</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan 에폭시 수지 A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan 에폭시 수지 B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan 에폭시 수지 C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan 에폭시 수지 D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, puriss. p.a., absolute, &ge; 99.8 %</td> <td>시그마</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드 용액, 등급 I, H2O</td><td>시그마</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤, &ge에서 25 %; 99%&nbsp;</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>시그마</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)- 14.3 mg/mL</td><td>시그마</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 텍사스 레드(TR)- 3.3 mg/mL</td><td>인비트로겐</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소, 30% 용액</td><td>시그마</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>이멀젼 오일, 점도 1.250 cSt (점등)</td><td>Sigma</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>염화니켈(NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드, 전자 현미경용, H2O&nbsp에서 4%;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 시약 등급, 결정질&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>피크르산, 물에 적신 &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>인산염 버퍼 1 M</td><td>Sigma</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드 (C3H6O), 99%</td><td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 테트라하이드로보레이트</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 하이드로클로라이드, &ge; 99.0%</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 베이스, &ge; 99.9%</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 안티페이드 마운팅 미디엄, , 굴절률 1.45&nbsp;</td><td>벡터 연구소</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP 키트</td><td>벡터 연구소</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>장비 사용&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A 컵 알루미늄 플란체트&nbsp;</td><td>GA-MA 및 어소시에이츠, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 DMR 현미경&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp; 형광 광원&nbsp;</td><td>엑셀리타스 테크놀로지스&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 DFC450 디지털 현미경 카메라&nbsp;</td><td>라이카 마이크로시스템즈&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapidograph 기술 드로잉 펜 0.18mm&nbsp;</td><td>런던 그래픽 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.18 mm 라피도그래프 닙</td><td>런던 그래픽 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라피도그래프 기술 드로잉 펜 0.25mm&nbsp;</td><td>런던 그래픽 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25mm rapidograph 펜촉</td><td>런던 그래픽 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 시스템 PC 워크 스테이션, 무대, 카메라 및 joystic을 포함한 XYZ 무대 제어</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 소프트웨어 버전 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW 그래픽 Suite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>비디오 편집 소프트웨어&nbsp;</td><td>Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알 14mL</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biocytin 복구 및 채워진된 hippocampal ca2 수의 3d 복원

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

어떻게 처리 하는 대뇌 피 질의 네트워크 활동 정보는 기본 및 임상 과학 질문의 다 수 중요 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜이이 회로의 기본 구성 요소를 식별 합니다. 대뇌 피 질 영역의 심층 연구 회로 구성 요소와 다른 과학자 들은 두뇌 획득 하는 방법에 대 한 이해에 필요한, 처리 하 고 정보 및 어떤 질병은 electrophysiological 동안에 잘못 되 면 저장 제공 궁극적으로 것 이다 그리고 형태학 상 데이터 계산 신경 네트워크 모델을 찾아보기 정보 처리의 건설에 의해 널리 사용 됩니다. 여기에 설명 된 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 해 마 CA2 영역에 기록 biocytin 가득 세포를 복구 하 여 다음 3d에서 재구성. 또한, 프로토콜 칼슘 의무적인 단백질 또는 펩 티 드 콘텐츠 기록된 수의 데모를 설명합니다.

뉴런 hippocampal CA2 biocytin electrophysiological 녹음 (그림 1Ac, 광고 및 1Bc, Bd) 다음으로 가득 차 있었다. 조각 밤새 녹음을 다음 고정 하 고 신경 및 신경 세포의 형태학 특성 다음 여기에 설명 된 프로토콜을 공개 했다.
칼슘 의무적인 단백질 또는 단백질 콘텐츠 채워진된 수의 조각을 먼저 기본 항 체와 함께 다음 붙일 이라는 2 차 항 체를 배양 하 여 결정 했다. 녹음 하는 동안 수의 발사 특성 사용 기본 항 체의 선택을 쓰게 됩니다. Avidin AMCA biocytin 가득 interneuron 시각화 하는 데 사용 했다 하 고 반대로 마우스 fluorescein isothiocyanate (FITC)와 염소 안티 토끼 텍사스 레드 (TR) interneuronal 신경 (그림 1Bb) 특성을 사용.
형광 시각화 다음 HRP 프로토콜 biocytin (그림 1Ab)를 나타내기 위해 사용 되었다. CA2 수의 잘 상세한 해부학 다음 신경 재구성 소프트웨어 (그림 2 및 그림 3a)를 사용 하 여 3D에서 당겨 졌다. 기록 및 CA2에 가득 바구니 세포의 3 차원 재구성의 비디오는 비디오에 표시 됩니다. 신경 개조 수지상 및 axonal 버는 450-500 μ m 조각의 깊이 내에서 국한 되었다 하는 경우 완료 된 것으로 간주 됐다. 불 쌍 한 axonal 아 버 얼룩 축 삭 머리글자 세그먼트와 매우 인접 가지에 국한 되었다 상단 또는 하단 슬라이스 나는 얼룩에 오픈 엔딩으로 잘린된 분 지의 존재에 의해 평가 되었다. 그림 4 는 좋고 가난한 HRP 얼룩 다음 biocytin 시각화의 예를 나타냅니다.
3D 복원 (그림 3)의 형태학 분석 지점 복잡성, 소마 노출 영역 및 노출 영역 및 수지상 및 axonal 아 버의 볼륨 밖으로 수행할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> 그림 1 : 바구니 세포의 두 종류의 신경 개조 기록 및 hippocampal CA2 영역에 채워지고 세포내 녹음에 따라 얻은 electrophysiological 데이터 상관 생체 외에서. 이 그림은 이전 연구23,24에서 수정 되었습니다. 그래서 지층 Oriens, SP 지층 Pyramidale, SR 지층 Radiatum, SLM 지층 Lacunosum Moleculare. (A) Aa: 드로잉 튜브 (1000 X)를 사용 하 여 제한 된 수지상 및 axonal 아 버와 CA2 바구니 세포의 재구성. 블랙, 있는 모 수석 그리고 축 삭 빨간색. Ab: 여기에서 설명 하는 avidin HRP 프로토콜 다음 biocytin 가득 바구니 세포의 이미지. Ac: 전압 응답 hyperpolarizing 및 depolarizing는 CA2 바구니 셀 제한 수지상 및 axonal 아 버의 현재 분사의 대표적인 추적입니다. 광고: 예 아 버 바구니 셀 연결 범위 CA2 피라미드의 날카로운 전극을 사용 하 여 기록. 복합 흥분 성의 시 냅 스 후 전위 (EPSP) 평균 3 스파이크의 열차에 대 한 응답 중 짧은 기차 우울증 명백한 표시. (B) 바: 드로잉 튜브 (1000 X)를 사용 하 여 넓은 수지상 및 axonal 버는 CA2 바구니 셀의 2D 재건. (블랙)에이 바구니 세포의 수지상 나무 CA2 영역 및 수평에 등등 CA2, CA3 영역의 SP의 모든 레이어를 통해 광선으로 확장. 한 수평 모 수석에 CA1 영역에 도달 했습니다. (빨간색)으로 축 삭 연장 CA1 고 CA3 영역. Bb:는 biocytin 가득 (AMCA 얼룩) 바구니 세포는 태양광 발전-immunopositive (FITC 얼룩) 및 CB-immunonegative (텍사스 레드 얼룩). 기원전: 전압 응답 hyperpolarizing 및 depolarizing 넓은 수지상 및 axonal 아 버와 CA2 바구니 세포의 현재 분사의 대표적인 추적입니다. Bd: 복합 EPSP 평균 보여 짧은 기차 촉진 명백한 3 스파이크의 열차에 응답 하는 동안. 이전 연구25,30에서 CA2에 기록 하는 수의 다른 유형의 예를 찾을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> 그림 2 : 3D 셀 바디 재건. (A) 세포 체의 3D 추적 세포 체를 통해 집중 하는 동안 다른 z 위치 추적 다른 윤곽선의 보기. (B) 다른 윤곽선의 3D 보기. (C) 다른 각도에서 세포 체의 3 차원 보기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> 그림 3 : 3D 신경 개조의 Morphometry 분석. (A) CA2 좁은 목 바구니 세포의 3D 개조. 수지상 각 분기 (녹색, 파란색, 빨간색 및 분홍색) 색상으로 표시 됩니다 하 고 축 삭은 밝은 파란색. (B) Dendrogram 수지상 가지의 수 고는 소마와 소마는에서 100 μ m 간격 동심 구체에 포함 된 각 세그먼트의 길이 나타내는 바구니 세포의. dendrogram에 색상 dendrites CA2 피라미드 세포 (이전 연구23에서 적응)에 대해 수행 하는 형태학 분석의 대답 (C) 예에서의에 해당 합니다. 수지상 가지의 수 CA2 피라미드 세포의 소마에서 거리에 대 한 구성 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> 그림 4 : (A) 좋고 가난한 (B) HRP 얼룩의 예. (A) Biocytin 복구 CA2에 아주 잘 채워진된 interneuron 공개. 셀 바디 (CB) 스테인드 음울 하 고 명확한 윤곽선을 있다. 모 수석 파란색은 하 고 어떤 쪽이 (붉은 별 표시)을 표시 합니다. Axonal 아 버 (A)이 고 작은 boutons를 선물 한다. (B)는 가난한 수지상 및 axonal 얼룩 CA2에 2 피라미드 세포의의 예입니다. CB의 얼룩은 아무 명확한 윤곽선으로 희미 한입니다. 불 쌍 한 얼룩은 종종 관련 짧은 electrophysiological 녹음과 거의 biocytin 가득 분기의 결과입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
비디오 1: 제한 된 수지상 아 버 (CA2 좁은 목 바구니 세포 라고도 함) 지층 pyramidale, 모든 레이어와 CA2 지층 pyramidale에 인접 한 지층 oriens 축 삭 모 수석에에서는 소마와 함께 CA2 바구니 세포의 3D 신경 재건 그리고 radiatum. 아주 몇 가지 인접 CA3 지층 oriens 고 CA3 지층 pyramidale에 도달. 이 셀 biocytin electrophysiological 녹음 다음으로 채워졌다 고 섹션 avidin HRP 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 처리 했다. 비록 모 수석 그대로 슬라이스, 때문 조각의 깊이 내 축 삭만 복구 했습니다. 모 수석 어두운 핑크와 화이트에 축 삭에 있습니다. 레이어 및 지역 경계는 비디오의 시작 부분에 추가 되었습니다. Svenja 포크에 의해 조지아 Economides-3D 비디오 3D 개조. 동영상 단계 2.17에 명시 신경 재구성 소프트웨어와 함께 기록 하 고 비디오 편집 소프트웨어와 함께 편집 했다. 동영상에 링크:30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>사용 하는 솔루션</td>
			<td>구성/지침</td>
		</tr>
<tr>
<td>고정 솔루션</td>
			<td>4% paraformaldehyde 0.2% 포화 picric 산 솔루션, 0.1 M 인산 버퍼 (PB)에 0.025%도 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 M 인산 버퍼 pH 7.6</td>
			<td>증류수의 900 mL를 100 mL의 1 M 인산 염 버퍼 재고 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td>인산 염 (PBS) pH 7.4/7.5 버퍼링</td>
			<td>0.1 M 인산 염 버퍼, KCl과 NaCl의 8.76 g 990 mL 증류수를 0.2 g의 10 mL을 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td>TRIS 버퍼 pH 7.5</td>
			<td>분해 트리 스 염 산 및 증류수 50 mL에 트리 스 기지의 1.66 g 5.72 g. 증류수 1 L를 확인 하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>버퍼링된도 및 paraformaldehyde 통 솔루션</td>
			<td>4% paraformaldehyde 0.2% 포화 picric 산 솔루션, 0.1 M 인산 염 버퍼에서 0.025%도 솔루션.</td>
		</tr>
<tr>
<td>ABC 솔루션</td>
			<td>솔루션 ABC 키트에서 사용 하기 전에 적어도 30 분을 만들 수. 2.5 ml PBS의 솔루션의 1 방울과 솔루션 B의 1 방울을 추가 합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durcupan 에폭시 수 지:</td>
			<td>20 냄비 만들기 위해:의 구성 요소, 구성 요소 B의 20 g, C의 0.6 g 및 컴포넌트의 D-0.4 g 20 g</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>필터 종이의 원형으로 접시를 취재 하 여 유출에서 균형을 보호 합니다. 신중 하 게 상기 비율에서 tripour 비 커에는 시 약의 무게. 적극적으로 두 개의 나무 막대기를 사용 하 여 적어도 5 분 교 반에 의해 철저 하 게 혼합. 혼합물은 균일 한 밀도 어두운 갈색 색깔 될 것입니다. 가능한 많은 기포를 제거 하는 10 분의 최대 ~ 50 ° C에서 오븐으로 비 커를 놓습니다. 참고: 수 지 두고 10 분 Decant 이상 오븐에서 비 커 수 지 플라스틱 남 비 또는 5 mL 주사기로, 그들의 날짜 및 사용에 대 한 준비-20 ° C 냉동 고에 저장 하는 경우 치료를 시작 합니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 솔루션의 테이블입니다.

여기에 설명 된 프로토콜 설명 면역 형광 분석, biocytin 복구 hippocampal CA2 수는 세포내 electrophysiological 녹음 생체 외에서, 수 있도록 신경 다음의 높은-품질 개조 특성화 고 궁극적으로 훌륭한 신경 해부학 공부를 해야.

Biocytin 복구 및 채워진된 Hippocampal CA2 수의 3D 복원

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

이 방법은 신경 아류형을 분류하고 피질 회로의 기능지도에 대한 이해를 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 뉴런의 초구조를 보존하고 수지상 및 축축식 식소의 우수한 회복을 얻기 위해 최적화되어 고품질의 재구성을 가능하게 합니다. 전기 생리학적 기록의 끝에서, ACSF의 작은 접시에 기록 된 세포를 포함하는 조각을 전송.연기 후드에서 작업하는 동안, 좋은 품질의 필터 용지의 작은 조각에 슬라이스를 롤과 조각에 촉촉한 필터 종이의 또 다른 조각을 배치합니다. 조직을 5~10밀리리터의 고정 용액이 들어 있는 작은 플라스틱 냄비에 놓고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 다음 날, 고정 용액을 가진 용기에서 0.1 개의 어금니 완충제 2 밀리리터가있는 용기로 조직을 옮기고 메스 블레이드로 과도한 조직을 잘라냅니다.페트리 접시에 슬라이스를 배치하여 과잉 조직을 제거하고, 메스 블레이드와 여분의 조직을 잘라. 손질된 티슈를 깨끗한 페트리 접시에 전달하여 주름이나 주름없이 평평하게 놓이도록 합니다. 드라이 페인트 브러시를 사용하여 과도한 버퍼를 제거합니다.따뜻한 젤라틴 용액으로 조직을 덮고 페트리 접시를 냉동 블록에 놓고 용액을 빠르게 식힙니다. 그런 다음 젤라틴을 섭씨 4도로 30~60분간 옮는다. 연기 후드에서 메스 블레이드를 사용하여 젤라틴 내장 조직을 포함하는 작은 1 X 1 센티미터 블록을 잘라냅니다.작은 주걱을 사용하여 블록을 들어 올리고 신중하게 신선한 고정 솔루션으로 전송합니다. 섭씨 4도에서 30분 이상 수정할 수 있습니다. 이 두 번째 고정에 따라 젤라틴 블록을 PB의 5 밀리리터로 세 번 세척하십시오.세척 후 종이 조직을 사용하여 블록을 건조시십시오. 그런 다음 소량의 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 상단에 있는 조직을 중심으로 한 블록을 슈퍼 접착제를 사용하여 진동트럭에 고정시합니다. 진동을 사용하여 50 미크론 두께로 슬라이스를 섹션과 10 %의 자당을 포함하는 유리 유리 바이알에 각 섹션을 신중하게 배치합니다.단면 후, 조심스럽게 바이알에서 섹션을 선택하고 페트리 접시 뚜껑에 평평하게 놓습니다. 그런 다음 신선한 메스 블레이드를 사용하여 섹션 주변에서 젤라틴을 제거합니다. 섹션은 PB에서 신선한 10 % 자당 2 밀리리터를 포함하는 바이알에 넣고 10 분 동안 교반하여 극저온 보호 프로세스를 시작합니다.냉동 보호 후, 페인트 브러시를 사용하여 알루미늄 호일의 작은 사각형에 섹션을 평평하게 놓습니다. 섹션에서 여분의 액체를 제거하고 조심스럽게 소포에 호일을 접어. 알루미늄 호일을 30초 동안 표면에 닿지 않고 액체 질소 표면 가까이에서 잡습니다.그런 다음 섹션이 약 30초 동안 완전히 해동되도록 합니다. 동결을 두 번 더 해동반복합니다. 페인트 브러시로 호일에서 모든 섹션을 제거하고 일정한 동요에서 과도한 자당을 씻어 PB의 두 밀리리터를 포함하는 유리 유리 바이알에 배치합니다.형광 화상 진찰을 위해 면역 염색 한 후, PBS가 들어있는 유리 페트리 접시에 슬라이드를 넣고 조심스럽게 커버 슬립을 제거합니다. 그런 다음 파스퇴르 파이펫에서 PBS의 부드러운 펄스를 사용하여 슬라이드에서 섹션을 씻어 냅니다. 섹션을 PBS가 들어 있는 깨끗한 유리 바이알에 넣습니다.아비딘 바이오틴 복합체 또는 ABC의 섹션을 먼저 배양하여 HRP 반응 생성물을 증폭시키기 위해 적어도 2시간 동안 아비딘 HRP 반응을 수행한다. 그런 다음 PBS로 섹션을 10 분 동안 3 번 씻은 다음 tris 버퍼로 10 분 동안 두 번 버퍼링합니다. 마지막 트라이버퍼 워시를 제거한 후, 디아미노벤지딘 용액 또는 DAB 용액에 8% 니켈 염화물 용액 1방울을 빠르게 추가합니다.그런 다음 솔루션을 혼합하고 섹션에 이 솔루션의 밀리리터 1밀리리터를 빠르게 추가합니다. 이 솔루션의 섹션을 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 DAB 용액에 과산화수소 1%의 마이크로리터 10을 추가합니다.세포가 표지될 때까지 약 1~2분 동안 일정한 동요 하에서 암흑에서 반응을 진행할 수 있도록 한다. 연기 후드에 작은 필터 용지 원을 페트리 접시에 넣고 PB로 감쇠합니다. 페인트 브러시를 사용하여 유리 유리 병에서 한 번에 하나씩 섹션을 들어 올리고 조심스럽게 종이에 평평하게 놓습니다. 필터 용지의 또 다른 촉촉한 원으로 섹션을 덮고 티슈 페이퍼를 표면에 부드럽게 터치하여 과도한 버퍼를 제거합니다.상단 용지에 PB에 1% 오스뮴 테트옥사이드의 8~9방울을 적용합니다. 접시를 덮고 연기 후드에 적어도 30 분 동안 유지하지만 1 시간 이상 보관하십시오. 헹도, 장착 및 커버를 한 후, 50%, 70%, 95%, 알코올 100% 시리즈를 통해 탈수합니다.탈수 단계에 따라, 약 5 분 동안 셰이커에 100 % 에탄올을 포함하는 유리 바이알로 섹션을 전송합니다. 알코올 용액을 프로필렌 옥사이드로 대체하고 5분 동안 세 번 씻습니다. 마지막 세척 에 이어, 유리병에 있는 프로필렌 산화물의 약 2 밀리리터를 유지하고 1:1 비율로 수지추가.수지가 용해되었는지 확인하고 단면을 30분 동안 일정한 교반 아래에 유지합니다. 30분 후, 나무 막대기를 사용하여 각 섹션을 에폭시 수지가 들어 있는 알루미늄 플랑셰트에 놓고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플랑셰트를 핫 플레이트에 약 10분간 놓습니다.그런 다음 나무 막대기로 각 섹션을 선택하고 깨끗한 슬라이드에 놓습니다. 모든 섹션이 슬라이드로 옮겨지면 해부 현미경 아래에서 슬라이드를 보고 슬라이스의 방향을 확인하고 섹션 위에 덮개 슬립을 놓습니다. 오븐에서 섭씨 56도에서 48시간 동안 치료하십시오.낮은 배율 목표를 사용하여 세포 체를 포함하는 홈 섹션에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 100x 목표를 사용하고 셀 본문에 초점을 맞추고 중앙을 클릭하여 기준점을 표시합니다. 100x 목표를 사용하여 3D로 소마를 추적하려면 추적 탭에서 윤곽을 선택하고 셀 본체 윤곽을 선택합니다.조이스틱을 사용하여 포커스를 세포 몸의 맨 위로 이동합니다. 현재 초점이 맞춰진 부품의 둘레를 클릭하여 점을 배치합니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 닫기 윤곽을 선택하여 이 첫 번째 윤곽선을 완료합니다.셀 바디의 바닥에 도달할 때까지 다른 z 위치에서 이 과정을 반복합니다. 수지상 식목을 추적하려면 뉴런 메뉴에서 원점 또는 정점 원점을 선택합니다. 먼저 마우스 스크롤 휠을 사용하여 각 원원막에 대한 짧은 초기 세그먼트를 추적하여 커서의 직경을 조정하여 원더의 직경에 맞게 조정합니다.각 수상월을 따라 추적합니다. 트리의 노드에 도달하면 드롭다운 메뉴에서 분기 노드 또는 트리퍼케이팅 노드를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 선택합니다. 완료된 섹션으로 일치하는 섹션의 원점 일치 점을 식별하려면 이동 탭을 클릭하고 일치 점을 선택합니다.일치하는 데 필요한 포인트 수를 선택한 다음 확인을 누릅니다. 완성된 분기의 끝을 클릭한 다음 분기를 클릭합니다. 각 일치점에 대해 이 것을 반복합니다. 각 섹션의 모든 원더라이트가 추적되면, 여기에 표시된 동일한 프로세스를 사용하여 축축을 추적하면 드로잉 튜브를 사용하여 제한된 수지상 및 축산 아버가있는 CA2 바구니 셀의 재구성입니다.수상자는 검은색으로, 축산은 빨간색입니다. 여기에 기재된 아비딘 HRP 프로토콜에 따른 바이오시틴 충전 바구니 세포의 예상이다. 여기에 표시된 CA2 바구니 세포의 3D 뉴런 재구성 의 비디오입니다.펜드라이트는 짙은 분홍색으로, 축산은 흰색입니다. 마지막으로, 이 이미지는 CA2 바구니 셀의 덴드로그램을 보여줍니다. 이 프로토콜에 능숙해지는 데는 시간이 걸릴 것입니다.그러나, 이 최적화된 접근은 체외에서 복잡한 피질 및 해마 구조물의 고해상도 심상을 생성할 수 있습니다.

biocytin-recovery-3d-reconstructions-filled-hippocampal-ca2

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐 해마 절편에서 바이오사이틴으로 채워진 인터뉴런을 시각화하는 과정을 보여주며, 특정 항체 및 형광 현미경을 사용하여 신경화학적 정체성을 강조합니다.

쥐 해마 절편에서 중간뉴런의 면역염색

이 비디오는 바이오사이틴으로 채워진 중간뉴런을 포함하는 고정된 쥐의 뇌 절편을 염색하는 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 아비딘-비오틴 복합체(ABC)를 사용한 배양, HRP 및 발색 기질로 염색, 사산화오스뮴으로 구조 보존, 이미징을 위해 조직을 수지에 삽입하는 것이 포함됩니다.

시각화를 위한 쥐 해마 절편에서 바이오사이틴으로 채워진 중간뉴런 라벨링

신경 네트워크의 구조를 이해하기 위해, 개별 뉴런의 기능적, 형태 적 특성이 필요하다. 여기, 우리는 juxtasomal biocytin의 세포 구성에 전기 생리학 녹음을 할 수 있습니다 라벨, 아직 세포 내에서 돌기 및 축삭 아키텍처의 사후 재건 신경 레이블을 할 수있는 능력을 유지을 보여줍니다.

Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

1차 해마 뉴런의 저밀도 배양은 일반적으로 신경 영양 인자를 공급하고 수명을 유지하기 위해 신경교 공급층을 필요로 합니다. 여기에서는 고밀도 뉴런 공급층(neuronal feeder layer)이 있는 곳에서 유리 커버슬립에서 초저밀도 뉴런을 배양하는 단순화된 방법을 설명하며, 이는 특정 뉴런 자율 메커니즘의 연구를 용이하게 합니다.

매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화

이 프로토콜은 biocytin 충전 및 후속 면역 후 처리를 사용하여 전기 생리 녹음하는 동안 패치 신경 세포의 형태 학적 복구를위한 방법을 제시한다. 우리는 염색 coverslipped 된 두꺼운 biocytin 채워진 부분은 나중에 두 번째 차 항체 일 개월 restained 될 수 있음을 보여줍니다.

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

여기에서, 우리는 측방 geniculate 핵을 포함하는 급성 두뇌 조각의 준비를 위한 프로토콜 및 망막 생성 성 및 코르티코겐iculate 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사를 제시합니다. 이 프로토콜은 동일한 급성 뇌 슬라이스에서 높은 방출 및 낮은 방출 확률로 시냅스를 연구하는 효율적인 방법을 제공합니다.

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 뇌 제거를 결합하면 많은 수의 뉴런과 성상세포를 동시에 조사할 수 있습니다.

맑은 뇌에서 성상세포와 뉴런 사이의 공간적 상호작용 조사

학습하세요 해마 CA2 중간뉴런의 생리학적 기록 후 고품질 3D 재구성 방법을 통해 신경 세포 형태학과 기능을 정밀 분석하는 기술을. 이 프로토콜은 수상돌기와 축삭돌기 보존에 최적화되어 있습니다.

Biocytin 복구 및 채워진된 Hippocampal CA2 수의 3D 복원

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