Name: MeshAndCollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 배우세요 MeshAndCollect 프로토콜을 사용하여 형광 단백질 Cerulean의 작은 결정에서 완전한 회절 데이터를 수집하고 구조를 결정하는 방법을. 이 기술은 동기가속기 빔라인에서 신속한 실험이 가능합니다.

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우리는 제공 하는 사내 연구 프로그램을 통해 빔 시간 ESRF 감사.

1. 표현과 리안의 정화
참고: 이것은 Lelimousin 외 의해 프로토콜에 기반 21
<ol><li>익스프레스 대장균 BL21 셀 세600까지 자동 유도할 수 있는 중간23 의 4 L에서 37 ° C에서 성장에서 그의 태그 리안 1 = 및 다음 하룻밤 27 ° c.에 품 어</li>
	<li>5000 x g 에 세균성 세포를 수확 하 고 쥡니다 통해 세포를 lyse (40%, 5 분, 10 s 펄스, 10 s 일시 중지) 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl과 EDTA 무료 protease 억제제 x 1의 구성 버퍼의 200 ml에서.</li>
	<li>그의 트랩 Ni-NTA 열에 상쾌한 로드 하 고 동일한 버퍼 조건에서 100 m m 이미와 리안을 elute.</li>
	<li>밝은 노란색 컬러 분수 풀. 단백질은 본질적으로 착 색 된다, 따라서 포함 하는 리안 분수 쉽게 구별할 수 있습니다.</li>
	<li>20 mM Tris pH 8.0에서에서 S75 열에 단백질 (4 mL)를 정화.</li>
	<li>밝은 노란색 분수 풀 고 15 mg/ml 단백질 해결책 집중.</li>
</ol>2입니다. 결정 화
<ol><li>매달려 드롭 사용 확산 기법24 Linbro 접시에 20 ° C에서 수증기. PH 6.75, 12 %PEG8000 및 100 mM MgCl에서 100 mM HEPES 구성 된 precipitant 솔루션의 1 mL에 채울 우물2. 매달려 삭제에 대 한 단백질의 혼합 1 µ L precipitant 솔루션의 1 µ L로 15 mg/mL에 집중. 크리스탈은 24 시간에 표시 됩니다.</li>
	<li>크리스탈 얻은 수확 및 전송 그들의 시드 버퍼 100 µ L를 0.1 m M HEPES pH 6.75의 구성, 22% 말뚝 8000.</li>
	<li>0.1 mL 조직 분쇄기로 크리스탈을 갈기 고 시드 버퍼 (비율 1: 100)에 희석.</li>
	<li>1 시간 (1:10 (v/v))에 대 한 트립 신 (동일한 버퍼에 0.5 mg/mL)와 단백질 재고 솔루션 (15 mg/mL)의 약 수를 소화.</li>
	<li>10% 포함 하는 씨앗의 소화 단백질 해결책 혼합 버퍼 (v/v).</li>
	<li>결정 성장 (10 * 10 * 20 µ m3) 0.1 M HEPES pH 7, 14% 말뚝 8000, 0.1 MgCl2 1-1.5 μ 교수형에 증기 확산 방법을 사용 하 여 삭제.</li>
</ol>3. 크리스탈 장착
<ol><li>예를 들어, 25 µ m의 메쉬 루프 700 평방 구멍 척추 표준 샘플 홀더25에 탑재 된 적당 한 루프를 사용 합니다. Cryoprotectant 솔루션 (글리세롤 (20 %v / v 최종)과 혼합 잘 precipitant 솔루션)의 1 µ L로 결정 화 (단계 2.6)에서 크리스탈을 전송.</li>
	<li>결정에서 루프를 이동 하 고 드롭에서 그들을 해제 하 여 메쉬 루프에 단백질 크리스탈 슬러리를 탑재 합니다. 이상적으로 크리스탈 5 µ m-루프에 장착 된 결정 사이 아무 중복 최대 차원에서 30 µ m의 크기 범위에 있어야 한다.</li>
	<li>필터 종이와 신속 하 게 산으로 초과 액체를 심지. 침전 물 결정을 그들은 가능한 작은 대량 액체를 둘러싸인 루프의 비행기에 앉아.</li>
	<li>액체 질소의 전체 unipuck에 마운트를 급락. 빔 시간 사용할 수 있습니다까지 100 K에 퍽 적합 한 스토리지 컨테이너에 저장 합니다.</li>
</ol>4. 싱크 로트 론 실험의 오프 라인 준비
주: 가능한으로 싱크 로트 론 빔 시간을 요청 하 고 및 주어진된 싱크 로트 론에 대 한 신청서를 제출 하는 방법에 사용할 수 있는 액세스 종류에 대 한 온라인 지침을 따릅니다. ESRF 지침 http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying에서 찾을 수 있습니다. 경우에 회원의는 ESRF 블록 할당 그룹 (가방), 각 특정 프로젝트에 대 한 응용 프로그램 필요 하지 않습니다. 이 경우에 경험 빔 시간 일정에 관한 그들의 부 대 책임을 접근 해야 합니다.
<ol><li>제안 되는 실험에 대 한 초대장을 받은 후 안전 교육을 완료 하는 모든 참가자가 있다. "A-양식" (통해 ESRF 사용자 포털, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form)는 샘플에 필요한 안전 정보를 입력 합니다. 실험 논의 지역 담당자에 문의. 그것 일단 A-폼 제출 및 검증 실험 번호와 암호 당신을 줄 것 이다.</li>
	<li>확장된 ISPyB26 (http://www.esrf.fr/)에 연결 하 고 MX를 선택 하십시오.</li>
	<li>실험 번호와-양식에서 암호 로그인.</li>
	<li>배송 을 선택 | 새로 추가 하 고 요청된 된 정보를 입력.</li>
	<li>추가 소포 를 선택 하 고 관련 데이터를 입력 합니다. 추가 컨테이너를 선택 하 고 선택한는 unipuck 퍽에는 샘플의 위치를 포함 하 여 필요한 정보를 입력.</li>
</ol>5. 로드는 Beamline에 샘플의
<ol><li>실험 치에서 샘플 체인저 (SC)에 퍽 로드 dewar의 위치를 확인.</li>
	<li>실험적인 오두막을 연동 하 고 제어 허를 입력 합니다.</li>
	<li>ISPyB (https://esrf.fr/)에 로그인 합니다. 실험 준비, 선적을 찾아, 다음 선택 선택한는 beamline 나타내고는 캐롤라이나에서 퍽 위치</li>
	<li>로그인 beamline 제어 소프트웨어, 여기에 MXCuBE2,2728 실험 번호와 암호-양식 제공.<ol>
<li>Beamline 제어 소프트웨어 ISPyB 데이터베이스와 동기화 하려면 동기화 를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beamline 제어 소프트웨어를 사용 하 여 샘플 홀더는 각도에 탑재 하. MXCuBE2, 샘플 체인저 영역 내에서 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하 고 마운트 샘플을 선택 합니다.</li>
	<li>설치 된 MK3 미니 카파 각도29 활용 대부분 ESRF MX beamlines의 사용 하 여 MXCuBE2의 "비주얼 재배치" 워크플로30 는 각도의 회전 축과 샘플 홀더의 비행기를 정렬할.<ol>
<li>루프의 끝의 가장자리의 중간에 3 클릭 센터 센터 버튼을 선택 합니다. 저장을 선택 하 여 중심된 위치를 저장 합니다.</li>
		<li>센터 버튼, 3 클릭 센터 루프의 줄기의 시작의 중간에 다시 클릭 합니다. 또한 저장을 클릭 하 여 두 번째 위치를 저장 합니다.</li>
		<li>그것을 클릭 하 여 저장 된 중심된 위치 중 하나를 선택 합니다.</li>
		<li>고급, MxCuBE2 데이터 수집 큐에 워크플로 시각적 재교육 을 추가 합니다.</li>
		<li>수집 큐를 클릭 하 여 워크플로 시작 합니다.</li>
		<li>워크플로 후는 각도, 센터 다시 샘플 홀더, 메쉬 중간 어딘가에이 이번의 회전 축과 샘플 홀더의 평면을 정렬합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>메시의 얼굴 MXCuBE2를 사용 하 여 오메가 축을 회전 하 여 x 선 빔 방향에 수직 이다 그래야 샘플 홀더를 동양.</li>
	<li>MXCuBE2에서 샘플 홀더 (가변 빔 크기 beamlines)에의 검색에 필요한 빔 크기를 선택 합니다.<ol>
<li>조리개 드롭다운 beamline 제어 소프트웨어에서 메뉴에 클릭 하 고 선택 하는 값, 예를 들어, 10 µ m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>메쉬 스캔에 대 한 메쉬를 정의 합니다.<ol>
<li>MXCuBE2 메쉬 도구 아이콘을 클릭 합니다. 메쉬 도구 창이 나타납니다.</li>
		<li>MXCuBE2의 샘플 보기에서 왼쪽을 클릭 하 고 크리스탈 샘플 홀더에 포함 된 영역 위로 마우스를 드래그 하 여 메시를 그립니다.</li>
		<li>저장 하려면 메쉬 메쉬 도구 창에서 더하기 버튼을 클릭 (메쉬 된다 녹색).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 준비 및 MeshAndCollect 워크플로 실행
<ol><li>MXCuBE2의 해상도 필드에 해상도 (dmin)는 회절에서 이미지를 수집 해야 합니다, 예를 들어, 여기 1.8 Å 입력 합니다.</li>
	<li>고급 데이터 컬렉션 탭에서 MeshAndCollect 를 선택 하 고 큐에 추가 수집 에서 큐를 클릭 합니다.</li>
	<li>나타나는 매개 변수 창에서 beamline 종속 기본 매개 변수를 사용 합니다. 실험에서 기본값 매개 변수는 스캔 망점을, 100% 전송 (이 경우를 선도 4 x 1011 산 도/s), 메쉬 스캔 라인 당 1 ° 발진 0.037 s 노출 시간 여기 설명 합니다.</li>
	<li>Continue를 클릭 합니다. 메쉬 스캔 실행 하 고 각 그리드 시점에서 수집 된 회절 이미지 분석 및 소프트웨어 DOZOR1회절 강도 따라 순위가. 이 프로세스는 백그라운드에서 실행 됩니다.</li>
	<li>DOZOR 분석 후 열 지도 생성 되 고 후속 부분 데이터 컬렉션에 대 한 순서 대로 회절 강도에 따라 자동으로 할당 됩니다 ( 그림 1참조). 참고:이 단계의 결과 ISPyB 또한 검사 수 있습니다. 설정으로 새로운 탭 beamline 제어 소프트웨어에서 팝업 부분 데이터 집합의 컬렉션에 대 한 회전 범위 (즉, 0.1 °), 이미지 (즉, 100)의 수, 노출 시간, 해상도, 전송, 적당 한 값을 선택 합니다. 역 광선 등 이상적으로 각 쐐기를 수집에 대 한 복용량은 Garman 제한 (30 MGy) 미만 이어야 합니다. 이미지 당 대략적인 노출 시간은 0.037 0.1 s 설명된 실험 조건에서 s.</li>
	<li>일부 데이터 컬렉션을 시작 하려면 계속 을 클릭 합니다.</li>
</ol>7입니다. 데이터 처리
참고: 일부 데이터 세트는 적합 한 프로그램 (XDS10)와 통합 됩니다. 이 대 한 파이썬 스크립트 사용 됩니다 각 개별 데이터 집합을 인식 하 고, 그것을 통합 하 고 있는지 다른 부분 데이터 집합 사이의 색인 일치 하 게 하는.
<ol><li>이미지 포함 된 폴더를 엽니다: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.</li>
	<li>안전 부분 데이터 집합 수집 됩니다 폴더에서 찾을 수 있는 프로세스 하위 폴더의 복사본을 만듭니다.<ol>
<li>리눅스 터미널에서 명령을 cp-r 프로세스 process_backup를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>프로세스 폴더로 이동한 처리 스크립트를 실행 합니다.<ol>
<li>리눅스 터미널에서 명령을 cd 프로세스 를 입력 하 고 입력 했다.</li>
		<li>유형 procMultiCrystalData 및 입력합니다. 참고: 스크립트는 공간 그룹에 대 한 물어볼 것입니다 그리고 셀 (이 정보는 선택 사항) 매개 변수, 입력 지침에 따라 그. 마지막 사용자 확인 후 스크립트는 자동으로 실행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 데이터 집합의 병합
참고: 모든 부분 데이터 집합은 통합 후 구조 결정 및 구체화에 사용 하기 위해 최종 데이터 집합을 생성 하 그들의 최고의 조합을 병합 됩니다. 이 병합 과정의 다른 목표 전체 완성도 (추천), 높은 복합성 또는 최고의 데이터 통계를 얻을 수 있습니다 (높은 < I/σ(I) > 낮은 R-요인, 등). 후자는 때로는 수 완전성 및 복합성을 희생 해 서 그래서 주의이 옵션을 선택 합니다.
<ol><li>14프로그램 ccCluster 사용 하 여 부분 데이터 집합을 병합 합니다. 가능한 조합의 일부 데이터 세트 isomorphous () 결정 하기 위해 계층적 클러스터 분석 (HCA)를 사용 합니다.<ol>
<li>그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 열고 유닉스 터미널에서 ccCluster 를 입력 합니다. 참고: ccCluster GUI에는 dendrogram이 그려집니다. 이것은 그들 사이 동형에 따라 어떤 부분 데이터 집합 수 있습니다 최고의 병합 제안을 준다.</li>
		<li>세로 축에서 0.4에 대 한의 값에 해당 하는 노드를 클릭 하십시오. 일반적으로, 값이 높을수록 더 많은 부분 데이터 세트 그러나 더 나쁜 부분 데이터 집합 덜 isomorphous 것으로 통계를 병합 이어질 포함 됩니다.</li>
		<li>데이터 병합을 클릭 합니다. 선택한 클러스터 백그라운드에서 처리 될 것 이다 고 예상된 병합 통계 GUI에서 새 탭에 표시 됩니다. 데이터 집합의 서로 다른 조합에 대 한이 단계를 반복할 수 있습니다. 부분 데이터 집합의 좋은 조합에 대 한 완전성 해야 100%, < I/σ(I) > 높은 값 (10 이상 낮은 해상도 셸에서) R meas31 값 낮은 (낮은 해상도 껍질에 약 5%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택 하는 각 조합에 대해 단일 mtz 파일 (즉, 무의미 한32)으로 선택 부분 데이터 집합을 병합 하려면 생성 된 입력된 스크립트를 사용 합니다.</li>
	<li>결정적으로 고 강도 데이터 확장 프로그램 (즉, 목표 없는32)를 사용 하 여이 파일에 병합 비율과, 단 결정 데이터 수집에서 발생 하는 파일을 사용 하 여 출력 이후 단계적 및 구조 솔루션33 .</li>
</ol>

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<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS+implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">DIALS implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
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</ol>

저자 공개할 게 없다

MX 실험의 성공은 보통 잘 결정 diffracting의 비교적 큰 존재에 따라 달라 집니다. 더 큰 결정에 작은 크리스탈 샤워에서 최적화 실패 하는 프로젝트에 대 한 MeshAndCollect를 완전 한 회절 데이터 집합 구조 솔루션 통해 isomorphous 부분 데이터 집합을 수집된의 조합 가능성을 제공 한다 작은 결정의 시리즈. 메서드를 사용 하면 높은 광자 플럭스와 첨단 diffractometer 장치 및 빠른 판독 검출기 작은 빔 직경, 이상적으로 MX에 대 한 싱크 로트 론 beamlines와 호환 됩니다. 엔드 스테이션에 그런 실험의 데이터 수집 부분 분석할 샘플 홀더 포함 하는 크리스탈의 수와 수집 부분 데이터 집합의 수에 따라 약 20 분 소요 됩니다.
MeshAndCollect 실험의 성공 위한 가장 중요 한 전제는 충분 한 수의 존재 (적어도 50, 100 이상) 샘플 홀더에 위치 diffracting의. 경험에서 분석 결정의 최소 크기는 가장 작은 차원에서 약 5 µ m 이어야 한다. 방법은 표준 cryo 냉각 호환의 모든 종류와 호환 샘플 홀더 최상의 결과와 견고 하 고 직선을 마운트 메쉬를 사용 하 여 달성 되 고.
ESRF에서 MeshAndCollect는 Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) 워크플로30 MXCuBE2 beamline 제어 소프트웨어에서 사용할 수 있는 사용자 친화적인 방식으로 구현 됩니다. 다른 SX 방법에 비해 MeshAndCollect의 주요 이점은 표준 프로그램에서 수집 된 데이터를 처리할 수 이며 단 결정 MX 사용 하는 파이프라인을 자동화.
우리의 예제에서 알 수 있듯이, MeshAndCollect 아주 쉽게 적용 하 고 부분 회절 데이터 세트, 일반적으로 생산 구조 솔루션에 사용 하기 위해 완전 한 데이터 집합을 병합할 수 있습니다 작은 결정에서 수집의 시리즈 리드. 또한, MeshAndCollect는 단백질 결정학의 샘플링 공간 열어 마지막 최적화 단계, 큰 결정의 생산은 성공 하지 결정 화 실험에서 사용할 데이터를 수집 하는 방법을 제공 합니다.
밝은 x 선 근원 (예를 들어, 매우 화려한 소스 (EBS) 프로젝트/ESRF35)으로 현재 개발에 비추어 그것은 예측 그 증가 방사선 손상으로 인해 멀티 크리스탈 데이터 컬렉션 형식을 촉진 MeshAndCollect 될 것입니다-예외 보다는 오히려 데이터 수집의 표준 방법으로 현재 케이스-MX beamlines 싱크 로트 론 기반에.

고분자 엑스레이 결정학 (MX), 지금까지, 생물학 고분자의 3 차원 구조에 원자 해상도 대 한 통찰력을 얻기를 위해 가장 많이 사용 된 방법입니다. 그러나, 주요 병 목은 비교적 큰, 잘 diffracting 결정에 대 한 요구 사항.
종종, 그리고 특히 crystallizing 막 단백질 때 큰 차원에서 몇 미크론의 단지 아주 작은 결정을 얻을 수 있습니다. 방사선 손상 단일 마이크로 크리스탈2에서 그리고 수시로 완전 한 회절 데이터의 해상도 설정 하는 효과 제한 수집 될 수 있습니다, 그것은 신호 대 잡음 비를 개선 하는 데 필요한 이며 따라서 데이터 설정 해상도, 몇몇을 병합 하 여 부분 회절 데이터 다르지만 하다 결정에서 설정합니다. X 선 광선 싱크 로트 론 근원에 그리고 다른 (예: x 선 자유 전자 레이저 (X-FELs))의 자 속 밀도 증가 의미 유용한 부분 회절 데이터 세트 생물학의 매우 작은 결정에서 수집 될 수 있습니다. 고분자입니다. 이, 차례로, 컬렉션에 대 한 새로운 기술의 개발을 주도하 고 있다 고 구조 솔루션에 대 한 완전 한 데이터 집합을 생성 하기 위해 많은 다른 결정에서 수집 부분 회절 데이터 집합의 병합. 이러한 기술은 일반적으로 직렬 결정학 (SX)3,,45,6,7,8이라고 합니다. SX의 원형 예 x 선 빔3,,45크리스탈 슬러리의 좁은 스트림을를 인젝터 장치의 사용 이다. 회절 패턴 크리스탈 '여전히' 회절 이미지를 완전 한 데이터 집합을 생성 하려면 다음 병합 되는 정보의 개별 결정의 많은 수천에서 컬렉션을 선도 하는 엑스레이에 노출 때마다 기록 됩니다. 그러나,는 상당한 직렬 데이터 수집의이 유형의 단점은 스틸 이미지의 처리 문제가 될 수 있습니다. 크리스탈 회전 수 또는 여러 개의 회절 이미지는 직렬 결정학 실험6동안 동일한 크리스탈에서 수집 된 데이터 품질 상당히 향상.
MeshAndCollect1 '표준' MX 회전 데이터 수집 SX 결합의 목적으로 개발 되었다 및 자동 방식, 같은 고분자 대상의 수많은 결정에서 회절 부분 데이터 집합을 수집 하는 경험을 허용 동일 하거나 다른 샘플 홀더에 장착. 완전 한 회절 데이터 집합은 다음 가장 isomorphous 수집 부분 데이터 집합을 병합 하 여 얻어진 다. MeshAndCollect는 MX에 대 한 모든 최신의 싱크 로트 론 엑스레이 beamline와 호환 (이상적으로 삽입 장치 시설 상대적으로 작은 (20 µ m 이하의) 샘플 위치에 크기를 빔). 작은, 잘 diffracting 결정의 시리즈에서 완전 한 데이터 집합의 편집 이외에 방법은 또한 매우 적합 한 마이크로 결정의 회절 품질의 초기 실험 평가 대 한 불투명 한 샘플의 처리에 대 한 예를 들어, meso에서에서 막 단백질9의 microcrystals 성장.
MeshAndCollect 실험의 시작에서 단일 샘플 홀더에 포함 된 많은 크리스탈의 각각의 2 차원 위치는 낮은 복용량 x 선 검사를 사용 하 여 결정 됩니다. 이 검색 중에 수집 된 회절 이미지 자동으로 그들의 각각 회절 강도 따라 샘플 홀더에 결정의 위치를 정렬 하는 프로그램 DOZOR1에 의해 분석 된다. 부분 데이터 집합의 컬렉션에 대 한 위치는 회절 강도 컷오프에 따라 자동으로 할당 하 고, 마지막 단계에서 작은 웨지 회절 데이터, 회전, 일반적으로 ± 5 °의 각 선택한 위치에서 수집 됩니다. 경험이 회전 범위 확장 목적, 동시에 가능한 크리스탈 중심 문제와 여러 결정에 노출의 기회를 줄이는 부분 데이터 집합에 대 한 크리스탈 당 반사의 충분 한 금액을 제공 보여주었다는 특히 붐비는 지원1. 개별 회절 데이터 웨지 (일부 데이터 세트)는 다음 중 하나를 수동으로 처리 하거나 자동화 된 데이터 처리를 사용 하 여 파이프라인10,11,,1213. 다운스트림 구조 결정에 대 한 그것은 다음 부분 데이터 집합 병합된14,,1516 후 결과 완전 한 데이터 집합은 같은 방식으로 대우 될 수 있다 수의 최고의 조합의 찾을 필요가 단 결정에서 발생 한 실험.
예를 들어 MeshAndCollect의 연습에서 선물이 여기 청록색 형광 성 단백질 (CFP) 리안의 결정 구조 솔루션 부분 데이터 집합에서 일련의 수집의 조합에서 건설 회절 데이터 집합을 사용 하 여 microcrystals 같은 샘플 지원에 거치 된다. 리안은 Aequorea 빅토리아17, 누구의 형광 발 색 단 autocatalytically 3 연속 아미노산 잔류물의 cyclisation에서 형성 된 해파리에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를에서 설계 되었습니다. 리안은 발 색 단는 떠들고 있는 티로신, 트레오닌 (S65T)과 트립토판 (Y66W)의 첫 번째 및 두 번째 잔류물을 각각 변경 하 고 더 돌연변이 (Y145A, N146I, H148D, M153T와 발 색 단 환경에 적응 하 여 GFP에서 가져온 그리고 V163A) 생산 QY의 중요 한, 아직 최적이 아닌 형광 수준 = 0.4918,,1920. 리안의 차선 형광 속성 중 단백질21 11 β 물가의 불완전 한 안정화를 포함 하는 복잡 한 단백질 역학 및 두 개의 서로 다른 발 색 단의 숙박 시설을 연결 제안 pH 및 방사선 조건22따라이 성체. 우리로 인해 MeshAndCollect 프로토콜의 사용을 보여주는 모델 단백질으로 리안 사용 하기로 상대적으로 결정 화에 따라 크리스탈 크기 조정의 용이성. 리안의 구조는 매우 비슷합니다 그는 부모 단백질 GFP의 그것의 헌법은으로 β 배럴 형성 11 β 물가 α-나선, 곰는 발 색 단을 둘러싼의.

<table><tbody><tr><td>Beamline</td><td>ESRF ID 23-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>농축기: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>실란트가 포함된 XDXm 결정화 플레이트</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free 프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>4,693,159,001</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td><td>Life Technologies Thermo Fisher 과학</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>VWR 화학 물질 Prolabo</td><td>14388.29T</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Euromedex</td><td>10-110-C</td><td></td></tr><tr><td>His-trap HP</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13452-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MicroMeshes 700/25</td><td>MiTeGen</td><td>SKU:&nbsp; M3-L18SP-25L</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔 화학</td><td>S/3160/60</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5413-500G</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기 비브라 셀 75/15</td><td>SONICS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 -GL</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5174-01</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Unipuck</td><td>분자 치수</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Programs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>솔란지 델라게니&그레이브; re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&eacute; 파니 베이리어, 조스&이큐트; 가바디뉴, 엘스페스 J. 고든, 사무엘 D. 존스, 칼 에릭 레빅, 세아큐트; n M. 맥스위니, St&eacute; 파니 모나코, 맥스 나나오, 대런 스프루스, 올로프 스벤손, 마틴 A. 월시, 고든 A. 레너드; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 2011년 11월 15일, Pages 3186&ndash; 3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td><td>지역 개발</td></tr><tr><td>목적없는</td><td>MRC 분자 생물학 연구소</td><td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. 내 데이터는 얼마나 좋으며 해상도는 무엇입니까? Acta Crystallographica 섹션 D 생물학적 결정학. 69 (7), 1204&ndash; 1214, DOI: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td><td></td></tr><tr><td>ccCluster</td><td>ESRF</td><td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. 다중 결정 고분자 결정학 실험을 위한 계층적 클러스터링: ccCluster 프로그램. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&ndash; 1851년, DOI: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td><td>지역 개발</td></tr><tr><td>DOZOR</td><td>ESRF</td><td>Bourenkov and Popov, 미공개</td><td>로컬 개발</td></tr><tr><td>MeshAndCollect 워크플로우</td><td>ESRF</td><td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: synchrotron macromolecular crystallography beamlines를 위한 자동화된 다결정 데이터 수집 워크플로우.Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&ndash; 2343, DOI: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td><td>지역 개발</td></tr><tr><td>MXCuBE2</td><td>ESRF</td><td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: 고분자 결정학 실험을 위해 맞춤화된 싱크로트론 빔라인 제어 환경. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&ndash; 707, DOI: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone, Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&ndash; 226 (2014년).</td><td>지역 개발</td></tr><tr><td>XDS</td><td>막스-플랑크-인스티투트 f&uuml; r Medizinische Forschung</td><td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&ndash; 132, DOI: 10.1107/S0907444909047337 (2010년)</td><td></td></tr></tbody></table>

meshandcollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

엑스레이 결정학 생물학 고분자의 3 차원 구조에 대 한 높은 해상도 정보를 가져오는 데 사용 하는 주요 기술입니다. 최근까지, 주요 요구 사항은 잘 얻기 위해 도전 들은 크리스탈을 diffracting의 비교적 큰 여부 되었습니다. 그러나, 직렬 결정학의 출현 및 멀티 크리스탈 데이터 수집 방법에 르네상스는 큰 결정의 가용성 제한 하는 요인이 될 더 이상 필요 의미 했다. 여기, 우리가 먼저 동일한 샘플 홀더에 장착 하는 많은 작은 결정의 위치를 식별 하 고 다음에 대 한 부분 회절 데이터 집합의 일련의 결정에서 컬렉션을 지시 하는 자동된 MeshAndCollect 프로토콜의 사용 설명 후속 병합 및 구조 결정에 사용 합니다. MeshAndCollect diffracting 약하게 하는 경우에 마이크로 결정의 모든 종류에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 여기 청록색 형광 성 단백질 (CFP) 리안의 결정 구조를 해결 하기 위해 기술 사용 하 여 현재.

MeshAndCollect, MXCuBE2에서 구현 (참조 그림 1A), 결정의 시각적 식별 어려웠다 동일한 샘플 홀더에 위치한 리안의 작은 결정에서 부분 회절 데이터 세트의 수집을 위해 사용 되었다. 화면 샘플 홀더, 우리는 meshloop의 중심에는 그리드를 그린 ( 그림 1B참조)는 DOZOR에 따라 점수 열 지도 ( 그림 1C, 1d참조) 85 부분 회절 데이터 집합 자동으로 수집. 이들은 개별적으로 통합 했다 다음 d분 99.8% 완성도와 데이터 집합을 생성 하 (의 위에 보십시오) 병합 = 1.7Å ( 표 1참조). 높은 해상도 셸에서 하프 세트 상관 (CC1/2)34 (= 4.7) 60% 이었다. 예상 했던 대로, 리안의 결정 구조 분자 교체33 생성 된 데이터 집합을 사용 하 여 straightforwardly 해결 될 수 있습니다. 세련미, 후 우리 취득 한 R작동 22.8%는 R무료 25.4%의. 이전 결정된 구조 (PDB 항목 2WSO21)와 중첩 0.1 Cα 위치에 글로벌 rmsd를 보여줍니다 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>병합 된 데이터 집합의 통계</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>클러스터링 임계값</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>부분 집합의 수</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>공간 그룹</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>단위 셀 (a, b, c)</td>
			<td>50.98, 62.76 69.50</td>
		</tr>
<tr>
<td>해상도 범위</td>
			<td>46.58-1.70 (1.73-1.70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (모든 나 + 나-)</td>
			<td>0.133 (0.743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (모든 난 + &amp; 나-)</td>
			<td>0.142 (0.813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (모든 난 + &amp; 나-)</td>
			<td>0.047 (0.318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>관찰 총/독특한</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/sd(I))</td>
			<td>13.8 (4.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mn(I) 하프 세트 상관 관계 CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>완성도</td>
			<td>99.8 (99.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>다중성</td>
			<td>8.8 (6.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>마지막 R뒷
</td>
			<td>22.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>마지막 R무료
</td>
			<td>25.4</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 데이터의 높은 품질을 나타내는 병합 된 데이터 집합의 통계를 수집 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> 그림 1: MeshAndCollect를 사용 하 여 동일한 샘플 홀더에 포함 된 작은 결정의 시리즈에서 일련의 부분 데이터 집합을 수집 하. A) MXCuBE2의 사용자 인터페이스입니다. 축에 뷰어 필드 위에 녹색 타원형 그리드 도구를 나타냅니다. B) 그걸로 그리드 샘플 홀더 생활 이미지 필드에서 이미지에 그려집니다. DOZOR 점수 C) 열 지도. D) 회절 이미지의 예입니다. E) Dendrogram 계층적 클러스터 분석 후입니다. 빨간색에서 데이터 집합 병합을 위해 사용 되었다. 리안의 F) 전체 구조입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

우리는 후속 구조 결정, 형광 단백질 리안의 많은 작은 결정에서 수집 부분 회절 데이터 세트의 구성에 사용 하기 위해 완전 한 회절 데이터 세트를 얻기 위해 MeshAndCollect 프로토콜의 사용을 제시.

MeshAndCollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

자동화된 MeshAndCollect 프로토콜은 시리얼 결정예와 표준 회전 데이터 수집을 결합하여 퍽 샘플에서 작은 결정을 측정하도록 개발되었습니다. 이 방법은 먼저 동일한 샘플 홀더에 장착된 결정의 위치를 식별하여 구조의 용액에 나중에 병합되고 사용되는 부분 데이터 세트의 수집을 지시합니다. MeshAndCollect는 동일한 설정, 구조 솔루션, 리간드 스크리닝 및 작은 결정으로 실험을 빠르게 수행할 수 있으므로 매력적입니다.이 방법은 싱크로트론 빔라인의 VMX와 호환되며, 높은 광자 플렉스, 작은 빔 직경 및 빠른 재로드 검출기를 이상적으로 갖추고 있습니다. 먼저, 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스를 위한 확장정보 시스템에 연결하고 A양식으로부터 실험 번호및 암호로 MX.로그인을 선택한다. 다음으로 발송물을 새 추가로 선택하고 요청된 정보를 입력합니다.부분 추가를 선택하고 관련 데이터를 입력합니다. 컨테이너 추가를 선택하고 SC3 퍽을 선택하고 퍽에 있는 샘플 홀더의 위치를 포함하여 필요한 정보를 입력합니다. 실험 적인 오두막에서, 샘플 체인저 doer에 퍽을로드 하 고 그것의 위치를 주의.다음으로, 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스를 위한 정보 시스템에 로그인합니다. 실험 준비를 선택하고 발송물을 찾고 다음을 선택하고 샘플 체인저에서 빔라인과 퍽 위치를 나타냅니다. A 양식에 제공된 실험 번호와 암호로 빔라인 제어 소프트웨어에 로그인합니다.동기화를 눌러 빔라인 제어 소프트웨어를 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스에 대한 정보 시스템과 동기화합니다. 빔라인 제어 소프트웨어를 사용하여 샘플 홀더를 고니오미터에 장착합니다. 그런 다음 샘플 체인저 영역에서 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 마운트 샘플을 선택합니다.가운데 버튼을 선택한 다음 루프 끝 의 가장자리에 있는 가운데세 번 클릭합니다. 저장을 선택하여 가운데 위치를 저장합니다. 고급 아래에서 데이터 수집 큐에 워크플로 시각적 방향 전환을 추가합니다.그런 다음 큐 수집을 클릭하여 워크플로를 시작합니다. 그런 다음 저장된 중심 위치 중 하나를 클릭하여 선택합니다. 루프 의 줄기의 중간에 다음 중앙 버튼을 다시 클릭합니다.저장을 클릭하여 두 번째 위치를 저장합니다. 그런 다음 계속을 클릭합니다. 워크플로가 샘플 홀더의 평면을 고니오미터의 회전 축과 정렬한 후 샘플 홀더를 메시 중간 어딘가에 다시 중앙에 표시합니다.빔라인 제어 소프트웨어를 사용하여 오메가 축을 회전하여 메쉬의 면이 X선 빔 방향에 수직이 되도록 샘플 홀더를 방향을 지정합니다. 빔라인 제어 소프트웨어에서 조리개 드롭다운 메뉴를 클릭하고 값을 선택합니다. 그런 다음 메시 도구 아이콘을 클릭하여 메시 도구 창을 올리입니다.빔라인 제어 소프트웨어의 샘플 뷰에서 마우스를 샘플 홀더에 있는 크리스탈이 포함된 영역 위로 마우스를 왼쪽으로 클릭하고 드래그하여 메시를 그립니다. 메시를 저장하려면 메시 도구 창의 플러스 버튼을 클릭합니다. 빔라인 제어 소프트웨어의 해상도 필드에 회절 이미지를 수집해야 하는 해상도를 입력합니다.결정의 회절 품질에 대한 사전 정보가 알려지지 않은 경우 2에서 2.5 사이의 값을 권장합니다. 고급 데이터 수집 탭에서 MeshAndCollect를 선택합니다. 큐에 추가하고 큐 수집을 클릭합니다.매개 변수 창에서 빔라인 종속 기본 매개 변수를 사용합니다. 여기서 설명한 실험에서 기본 매개변수는 메시 스캔 점당 0.037초 노출 시간, 100%전송 및 메시 스캔 라인당 1도 진동입니다. 계속을 클릭합니다.각 그리드 지점에서 수집된 메시 스캔 실행 및 회절 이미지는 소프트웨어 Dozer와의 회절 강도에 따라 분석및 순위가 매겨지습니다. Dozer 분석 후 열 맵이 생성되고 후속 부분 데이터 수집순서가 회절 강도에 따라 자동으로 할당됩니다. 마지막으로 계속 클릭하여 부분 데이터 수집을 시작합니다.MXCuBE에서 구현된 MeshAndCollect는 결정의 시각적 식별이 어려웠던 동일한 샘플 홀더에 위치한 Cerulean의 작은 결정에서 부분 회절 데이터 세트를 수집하는 데 사용되었습니다. 샘플 홀더를 검사하기 위해 그리드가 메시 루프의 중앙에 그려졌고 Dozer 점수 열지도를 기반으로 85개의 부분 회절 데이터 세트가 자동으로 수집되었습니다. 이들은 개별적으로 통합된 다음 1.7 angstroms의 해상도에서 99.8 %의 완전성을 가진 데이터 세트를 생성하도록 병합되었습니다.예상대로, Cerulean의 결정 구조는 생성된 데이터 세트를 사용하여 분자 대체에 의해 해결될 수 있었다. 정제 후 22.8%의 R작업과 25.4%의 R프리를 얻었다. 이전에 결정된 구조의 슈퍼 위치는 0.1 angstroms의 c-알파 위치에 대한 글로벌 RMSD를 보여줍니다.결정 성장 단계의 최적화가 있는 프로젝트의 경우 MeshAndCollect는 작은 결정에서 얻은 이러한 비정질 부분 데이터 세트의 조합을 기반으로 완전한 데이터 세트를 얻을 수 있는 가능성을 제공합니다. 이 기술은 구조 생물학자가 마이크로 결정의 몇 10분의 1만 생산할 수 없는 부품 샘플의 구조를 해결할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

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체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

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엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

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형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

이 기사는 유전자 코드 확장(GCE) 부위 특이적 표지를 사용하여 살모넬라균 분비 이펙터에 라벨을 붙이고 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 이미지화하는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공합니다...

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Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

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MeshAndCollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션

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