MeshAndCollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션
2019년 3월 19일
우리는 후속 구조 결정, 형광 단백질 리안의 많은 작은 결정에서 수집 부분 회절 데이터 세트의 구성에 사용 하기 위해 완전 한 회절 데이터 세트를 얻기 위해 MeshAndCollect 프로토콜의 사용을 제시.
자동화된 MeshAndCollect 프로토콜은 시리얼 결정예와 표준 회전 데이터 수집을 결합하여 퍽 샘플에서 작은 결정을 측정하도록 개발되었습니다. 이 방법은 먼저 동일한 샘플 홀더에 장착된 결정의 위치를 식별하여 구조의 용액에 나중에 병합되고 사용되는 부분 데이터 세트의 수집을 지시합니다. MeshAndCollect는 동일한 설정, 구조 솔루션, 리간드 스크리닝 및 작은 결정으로 실험을 빠르게 수행할 수 있으므로 매력적입니다.
이 방법은 싱크로트론 빔라인의 VMX와 호환되며, 높은 광자 플렉스, 작은 빔 직경 및 빠른 재로드 검출기를 이상적으로 갖추고 있습니다. 먼저, 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스를 위한 확장정보 시스템에 연결하고 A양식으로부터 실험 번호및 암호로 MX.로그인을 선택한다. 다음으로 발송물을 새 추가로 선택하고 요청된 정보를 입력합니다.
부분 추가를 선택하고 관련 데이터를 입력합니다. 컨테이너 추가를 선택하고 SC3 퍽을 선택하고 퍽에 있는 샘플 홀더의 위치를 포함하여 필요한 정보를 입력합니다. 실험 적인 오두막에서, 샘플 체인저 doer에 퍽을로드 하 고 그것의 위치를 주의.
다음으로, 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스를 위한 정보 시스템에 로그인합니다. 실험 준비를 선택하고 발송물을 찾고 다음을 선택하고 샘플 체인저에서 빔라인과 퍽 위치를 나타냅니다. A 양식에 제공된 실험 번호와 암호로 빔라인 제어 소프트웨어에 로그인합니다.
동기화를 눌러 빔라인 제어 소프트웨어를 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스에 대한 정보 시스템과 동기화합니다. 빔라인 제어 소프트웨어를 사용하여 샘플 홀더를 고니오미터에 장착합니다. 그런 다음 샘플 체인저 영역에서 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 마운트 샘플을 선택합니다.
가운데 버튼을 선택한 다음 루프 끝 의 가장자리에 있는 가운데세 번 클릭합니다. 저장을 선택하여 가운데 위치를 저장합니다. 고급 아래에서 데이터 수집 큐에 워크플로 시각적 방향 전환을 추가합니다.
그런 다음 큐 수집을 클릭하여 워크플로를 시작합니다. 그런 다음 저장된 중심 위치 중 하나를 클릭하여 선택합니다. 루프 의 줄기의 중간에 다음 중앙 버튼을 다시 클릭합니다.
저장을 클릭하여 두 번째 위치를 저장합니다. 그런 다음 계속을 클릭합니다. 워크플로가 샘플 홀더의 평면을 고니오미터의 회전 축과 정렬한 후 샘플 홀더를 메시 중간 어딘가에 다시 중앙에 표시합니다.
빔라인 제어 소프트웨어를 사용하여 오메가 축을 회전하여 메쉬의 면이 X선 빔 방향에 수직이 되도록 샘플 홀더를 방향을 지정합니다. 빔라인 제어 소프트웨어에서 조리개 드롭다운 메뉴를 클릭하고 값을 선택합니다. 그런 다음 메시 도구 아이콘을 클릭하여 메시 도구 창을 올리입니다.
빔라인 제어 소프트웨어의 샘플 뷰에서 마우스를 샘플 홀더에 있는 크리스탈이 포함된 영역 위로 마우스를 왼쪽으로 클릭하고 드래그하여 메시를 그립니다. 메시를 저장하려면 메시 도구 창의 플러스 버튼을 클릭합니다. 빔라인 제어 소프트웨어의 해상도 필드에 회절 이미지를 수집해야 하는 해상도를 입력합니다.
결정의 회절 품질에 대한 사전 정보가 알려지지 않은 경우 2에서 2.5 사이의 값을 권장합니다. 고급 데이터 수집 탭에서 MeshAndCollect를 선택합니다. 큐에 추가하고 큐 수집을 클릭합니다.
매개 변수 창에서 빔라인 종속 기본 매개 변수를 사용합니다. 여기서 설명한 실험에서 기본 매개변수는 메시 스캔 점당 0.037초 노출 시간, 100%전송 및 메시 스캔 라인당 1도 진동입니다. 계속을 클릭합니다.
각 그리드 지점에서 수집된 메시 스캔 실행 및 회절 이미지는 소프트웨어 Dozer와의 회절 강도에 따라 분석및 순위가 매겨지습니다. Dozer 분석 후 열 맵이 생성되고 후속 부분 데이터 수집순서가 회절 강도에 따라 자동으로 할당됩니다. 마지막으로 계속 클릭하여 부분 데이터 수집을 시작합니다.
MXCuBE에서 구현된 MeshAndCollect는 결정의 시각적 식별이 어려웠던 동일한 샘플 홀더에 위치한 Cerulean의 작은 결정에서 부분 회절 데이터 세트를 수집하는 데 사용되었습니다. 샘플 홀더를 검사하기 위해 그리드가 메시 루프의 중앙에 그려졌고 Dozer 점수 열지도를 기반으로 85개의 부분 회절 데이터 세트가 자동으로 수집되었습니다. 이들은 개별적으로 통합된 다음 1.7 angstroms의 해상도에서 99.8 %의 완전성을 가진 데이터 세트를 생성하도록 병합되었습니다.
예상대로, Cerulean의 결정 구조는 생성된 데이터 세트를 사용하여 분자 대체에 의해 해결될 수 있었다. 정제 후 22.8%의 R작업과 25.4%의 R프리를 얻었다. 이전에 결정된 구조의 슈퍼 위치는 0.1 angstroms의 c-알파 위치에 대한 글로벌 RMSD를 보여줍니다.
결정 성장 단계의 최적화가 있는 프로젝트의 경우 MeshAndCollect는 작은 결정에서 얻은 이러한 비정질 부분 데이터 세트의 조합을 기반으로 완전한 데이터 세트를 얻을 수 있는 가능성을 제공합니다. 이 기술은 구조 생물학자가 마이크로 결정의 몇 10분의 1만 생산할 수 없는 부품 샘플의 구조를 해결할 수 있는 길을 열었습니다.
개요
MeshAndCollect 프로토콜은 작은 결정, 특히 형광 단백질 Cerulean의 완전한 회절 데이터 세트를 수집할 수 있게 합니다. 이 방법은 연속 결정학과 표준 회전 데이터 수집을 통합하여 신속한 실험을 용이하게 합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 구조 생물학
- 결정학
- 단백질 분석
배경
- MeshAndCollect은 여러 작은 결정의 데이터를 결합합니다.
- 동기 방사선 빔라인에서의 사용을 위해 설계되었습니다.
- 이 프로토콜은 구조 결정의 효율성을 향상시킵니다.
- 작은 결정의 시각적 식별 문제를 해결합니다.
연구 목적
- 완전한 회절 데이터 세트를 얻는 방법을 개발합니다.
- 작은 결정에서의 구조 결정을 용이하게 합니다.
- 실험의 속도와 효율성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 작은 결정에서 부분 데이터 세트를 자동으로 수집합니다.
- 분석을 위해 Dozer 소프트웨어를 사용하여 데이터를 통합합니다.
- 샘플 위치 조정을 최적화하기 위해 메쉬 도구를 사용합니다.
- 데이터 수집을 위한 기본 매개변수를 적용합니다.
주요 결과
- 99.8% 완전도를 가진 85개의 부분 회절 데이터 세트를 수집했습니다.
- 달성된 해상도는 1.7 옹스트롬이었습니다.
- Cerulean의 결정 구조가 성공적으로 해명되었습니다.
- 정밀화를 통해 R work는 22.8%이고 R free는 25.4%였습니다.
결론
- MeshAndCollect은 작은 결정으로부터 효과적인 데이터 수집을 가능하게 합니다.
- 이 기술은 복잡한 구조를 해명하는 구조 생물학자를 지원합니다.
- 제한된 결정 성장을 가진 프로젝트에 대한 솔루션을 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Structural determination of fluorescent proteins like Cerulean supports target validation and assay development in biopharma R&D by enabling mechanistic de-risking of protein function and interaction studies. The MeshAndCollect protocol addresses a key bottleneck in early discovery: obtaining high-quality structural data from poorly diffracting or micro-crystalline samples that hinder traditional X-ray crystallography workflows. This capability enhances predictive confidence in lead identification and supports portfolio triage by providing reliable structural insights for structure-based drug design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural data from weakly diffracting crystals.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein-ligand interactions and functional sites critical for target validation.
- Predictive Value: Improves confidence in structural models used for virtual screening and lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides validated structural templates for assay standardization and reproducibility in fluorescence-based screening platforms.
- Operational Value: Facilitates preparation of consistent biological systems for downstream compound evaluation and ligand screening campaigns.
- Scalability: Enables reuse of micro-crystal data collection workflows across multiple targets in structural genomics initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with disease-relevant systems by providing structural insights into fluorescent protein behavior in cellular environments.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming structural integrity under experimental conditions.
- Preclinical Readiness: Enables risk-adjusted advancement decisions through reliable structural data for biomarker and probe development.
Pipeline & Workflow Integration
The MeshAndCollect protocol fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly for projects challenged by difficult crystallization or limited sample availability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering high-resolution structural data from micro-crystals.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized, reproducible structural inputs for ligand binding and conformational studies.
- Analytics: Generates quantitative diffraction data sets with high completeness (99.8%) and defined resolution (1.7 Å) for reliable comparative analysis.
- Translational Research: Connects structural findings to preclinical continuity by enabling biomarker alignment and probe development.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, automated capability for structural data acquisition across multiple targets and campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target structure, reduction of mechanistic ambiguity, and improved model accuracy.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and rapid data collection from non-ideal crystals.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in crystallography campaigns, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable structural data for advancement or termination decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallography and synchrotron beamline operations.
- Dependent on access to VMX-equipped beamlines with high photon flux, small beam size, and fast detectors.
- Necessitates standardized sample preparation and puck-based loading protocols for consistent mesh-based positioning.
- Involves cross-team alignment between structural biology, assay development, and computational modeling groups.
- Limited by crystal quality and diffraction strength, though effective even with weakly diffracting micro-crystals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Offline Preparation of the Synchrotron Experiment
1:31
Loading of the Sample onto a Beamline
3:49
Prepare and Execute the MeshAndCollect Workflow
5:02
Results: Structure Determination of the Fluorescent Protein Cerulean using MeshAndCollect
6:10
Conclusion
