MeshAndCollect를 사용 하 여 형광 단백질 리안의 구조 솔루션

자동화된 MeshAndCollect 프로토콜은 시리얼 결정예와 표준 회전 데이터 수집을 결합하여 퍽 샘플에서 작은 결정을 측정하도록 개발되었습니다. 이 방법은 먼저 동일한 샘플 홀더에 장착된 결정의 위치를 식별하여 구조의 용액에 나중에 병합되고 사용되는 부분 데이터 세트의 수집을 지시합니다. MeshAndCollect는 동일한 설정, 구조 솔루션, 리간드 스크리닝 및 작은 결정으로 실험을 빠르게 수행할 수 있으므로 매력적입니다.

이 방법은 싱크로트론 빔라인의 VMX와 호환되며, 높은 광자 플렉스, 작은 빔 직경 및 빠른 재로드 검출기를 이상적으로 갖추고 있습니다. 먼저, 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스를 위한 확장정보 시스템에 연결하고 A양식으로부터 실험 번호및 암호로 MX.로그인을 선택한다. 다음으로 발송물을 새 추가로 선택하고 요청된 정보를 입력합니다.

부분 추가를 선택하고 관련 데이터를 입력합니다. 컨테이너 추가를 선택하고 SC3 퍽을 선택하고 퍽에 있는 샘플 홀더의 위치를 포함하여 필요한 정보를 입력합니다. 실험 적인 오두막에서, 샘플 체인저 doer에 퍽을로드 하 고 그것의 위치를 주의.

다음으로, 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스를 위한 정보 시스템에 로그인합니다. 실험 준비를 선택하고 발송물을 찾고 다음을 선택하고 샘플 체인저에서 빔라인과 퍽 위치를 나타냅니다. A 양식에 제공된 실험 번호와 암호로 빔라인 제어 소프트웨어에 로그인합니다.

동기화를 눌러 빔라인 제어 소프트웨어를 단백질 결정학 빔라인의 데이터베이스에 대한 정보 시스템과 동기화합니다. 빔라인 제어 소프트웨어를 사용하여 샘플 홀더를 고니오미터에 장착합니다. 그런 다음 샘플 체인저 영역에서 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 마운트 샘플을 선택합니다.

가운데 버튼을 선택한 다음 루프 끝 의 가장자리에 있는 가운데세 번 클릭합니다. 저장을 선택하여 가운데 위치를 저장합니다. 고급 아래에서 데이터 수집 큐에 워크플로 시각적 방향 전환을 추가합니다.

그런 다음 큐 수집을 클릭하여 워크플로를 시작합니다. 그런 다음 저장된 중심 위치 중 하나를 클릭하여 선택합니다. 루프 의 줄기의 중간에 다음 중앙 버튼을 다시 클릭합니다.

저장을 클릭하여 두 번째 위치를 저장합니다. 그런 다음 계속을 클릭합니다. 워크플로가 샘플 홀더의 평면을 고니오미터의 회전 축과 정렬한 후 샘플 홀더를 메시 중간 어딘가에 다시 중앙에 표시합니다.

빔라인 제어 소프트웨어를 사용하여 오메가 축을 회전하여 메쉬의 면이 X선 빔 방향에 수직이 되도록 샘플 홀더를 방향을 지정합니다. 빔라인 제어 소프트웨어에서 조리개 드롭다운 메뉴를 클릭하고 값을 선택합니다. 그런 다음 메시 도구 아이콘을 클릭하여 메시 도구 창을 올리입니다.

빔라인 제어 소프트웨어의 샘플 뷰에서 마우스를 샘플 홀더에 있는 크리스탈이 포함된 영역 위로 마우스를 왼쪽으로 클릭하고 드래그하여 메시를 그립니다. 메시를 저장하려면 메시 도구 창의 플러스 버튼을 클릭합니다. 빔라인 제어 소프트웨어의 해상도 필드에 회절 이미지를 수집해야 하는 해상도를 입력합니다.

결정의 회절 품질에 대한 사전 정보가 알려지지 않은 경우 2에서 2.5 사이의 값을 권장합니다. 고급 데이터 수집 탭에서 MeshAndCollect를 선택합니다. 큐에 추가하고 큐 수집을 클릭합니다.

매개 변수 창에서 빔라인 종속 기본 매개 변수를 사용합니다. 여기서 설명한 실험에서 기본 매개변수는 메시 스캔 점당 0.037초 노출 시간, 100%전송 및 메시 스캔 라인당 1도 진동입니다. 계속을 클릭합니다.

각 그리드 지점에서 수집된 메시 스캔 실행 및 회절 이미지는 소프트웨어 Dozer와의 회절 강도에 따라 분석및 순위가 매겨지습니다. Dozer 분석 후 열 맵이 생성되고 후속 부분 데이터 수집순서가 회절 강도에 따라 자동으로 할당됩니다. 마지막으로 계속 클릭하여 부분 데이터 수집을 시작합니다.

MXCuBE에서 구현된 MeshAndCollect는 결정의 시각적 식별이 어려웠던 동일한 샘플 홀더에 위치한 Cerulean의 작은 결정에서 부분 회절 데이터 세트를 수집하는 데 사용되었습니다. 샘플 홀더를 검사하기 위해 그리드가 메시 루프의 중앙에 그려졌고 Dozer 점수 열지도를 기반으로 85개의 부분 회절 데이터 세트가 자동으로 수집되었습니다. 이들은 개별적으로 통합된 다음 1.7 angstroms의 해상도에서 99.8 %의 완전성을 가진 데이터 세트를 생성하도록 병합되었습니다.

예상대로, Cerulean의 결정 구조는 생성된 데이터 세트를 사용하여 분자 대체에 의해 해결될 수 있었다. 정제 후 22.8%의 R작업과 25.4%의 R프리를 얻었다. 이전에 결정된 구조의 슈퍼 위치는 0.1 angstroms의 c-알파 위치에 대한 글로벌 RMSD를 보여줍니다.

결정 성장 단계의 최적화가 있는 프로젝트의 경우 MeshAndCollect는 작은 결정에서 얻은 이러한 비정질 부분 데이터 세트의 조합을 기반으로 완전한 데이터 세트를 얻을 수 있는 가능성을 제공합니다. 이 기술은 구조 생물학자가 마이크로 결정의 몇 10분의 1만 생산할 수 없는 부품 샘플의 구조를 해결할 수 있는 길을 열었습니다.