Name: 산 성 침 용 법을 사용 하 여 전체 신장의 네 프 론의 수 추정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 학습하세요 산성 침용법을 사용하여 전체 신장의 네프론 수를 추정하는 방법을. 이 기술은 신장 및 심혈관 질환 연구에 필수적이며 유전자와 환경 요인이 네프론 발달에 미치는 영향을 분석하는 데 활용됩니다.

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이 사업은 건강의 국가 학회, 국가 심장, 폐 및 혈액 학회에 의해 부분적으로 지원 되었습니다 (R01HL107632).

아래 나열 된 소모품 및 시 약은 한 번의 마우스에서 전체 신장의 네 프 론의 수, 즉 두 개의 신장에 대 한 결정입니다. 쥐에 대 한 산 성 침 용 방법의 사용에 대 한 수정은 별표로 식별 됩니다. 모든 실험 프로토콜은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 건강 가이드의 국립 연구소를 본, 미시시피 대학 의료 센터에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 신장 분리 절차
<ol><li>마우스 (또는 다른 종)의 무게를 측정 하 고이 소에 어 루 레인 (5%-8%)으로 안락사 과다 복용 또는 pentobarbital (150 밀리 그램/kg 복 강 내 주사).</li>
	<li>마우스가 안락사 되 면, 중간 선을 따라 미세 수술가 위를 사용 하 여 복 강을 엽 니 다.</li>
	<li>내장을 조심 스럽게 들어 올리고 지방 생식을 복 강의 오른쪽으로 올립니다. 총 해 부에 의해, 왼쪽 신장을 분리. 미세 수술가 위를 사용 하 여 왼쪽 신장 동맥과 정 맥을 자르고 왼쪽 신장을 조심 스럽게 제거 하 고 (마우스 번호/식별자) 형광체 완충 식 염 수를 포함 하는 계량 보트에 신장을 배치 합니다 (PBS).</li>
	<li>오른쪽 신장에 대 한 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>각각의 계량 보트에서 각 신장을 제거 하 고 PBS로 미리 적신 수술 거 즈에 놓습니다.</li>
	<li>수술 거 즈에 신장을 남겨, 신속 하 게 모든 부착 된 비 신장 조직 제거 (예: 신장 지방 또는 부 신 동맥) 신장 캡슐의 제거에 의해 다음. 각각의 신장을 개별적으로 계량 하 여 실험실 노트북에서 왼쪽과 오른쪽 신장의 무게를 개별적으로 기록 합니다.</li>
</ol>2. 균질 화, 배양 및 변형 절차
<ol><li>각 신장이 무게 되 면, PBS의 각 계량 보트를 배수 하 고 적절 하 게 표시 된 계량 보트에 다시 신장을 배치 합니다. 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 신장을 반으로 자르고 세로로 자릅니다. 각 신장의 절반을 아래로 향하게 하 고 각 반쪽을 2mm 또는 더 작은 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>같은 레이저 블레이드를 사용 하 여 조심 스럽게 잘게 자른 신장 조각을 수집 하 고 표시 된 15ml 원뿔 튜브 (마우스 번호/식별자를 왼쪽 대 오른쪽 신장)에 넣습니다.</li>
	<li>새로운 면도날을 사용 하 여 반대 신장에 대 한 절차를 반복 합니다. 잘게 자른 신장을 별도의 표지 된 15ml 원추형 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>통풍이 잘되는 증기 후드에서 각 15ml 원추형 튜브에 6 M 염 (HCl) 산 5Ml를 추가 하십시오.</li>
	<li>캡을 원추형 튜브로 교체 하 고, 신장/HCl 혼합물을 부드럽게 교 교 하 고, 15Ml 원추형 튜브를 37 ° c에서 90 분 동안 설정 된 예 열 된 수조에 넣고, 쥐 신장에는 120 min을 넣습니다.</li>
	<li>모든 조직이 HCl 산에 노출 되는 것을 보장 하기 위해 인큐베이션 동안 15 분 마다 각 15Ml 튜브를 짧게 교 번 한다.</li>
	<li>18g 바늘을 5ml 주사기 (쥐에 대 한 10ml 주사기)에 넣고 주사기 플런저를 조심 스럽게 제거 합니다. 주사기를 흄 후드의 50 원추형 튜브 (튜브 #1)에 넣습니다.</li>
	<li>수조에서 신장/HCl 용액을 제거 하 고 티슈 용액을 주사기의 열린 끝에 붓고 15ml 원뿔형 튜브를 시험관 랙에 따로 둔다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 서서히 플런저를 밀어 바늘을 통해 용액을 압출 하 고 튜브 #1.</li>
	<li>15ml 원추형 튜브를 5 mL의 PBS 용액으로 씻으십시오. 15ml 원추형 튜브에 PBS를 소용돌이 시켜 남아 있는 모든 신장 조직을 가용 화 하도록 한다.</li>
	<li>다시 말하지만, 18g 바늘을 포함 하는 5 mL 주사기에서 플런저를 조심 스럽게 제거 하 고 15ml 원추형 튜브의 내용물을 주사기의 열린 끝에 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 튜브 #1에 플런저를 부드럽게 밀어 주사기를 플러시. 이 과정을 2 배 반복 합니다 (총 3 배).</li>
	<li>21g 바늘을 새로운 5Ml 주사기 (* 10ml의 쥐 용 주사기)에 넣고 주사기 플런저를 조심 스럽게 제거 합니다. 새로운 50-mL 원추형 튜브 (튜브 #2)에 부착 된 21g 바늘로 주사기를 놓습니다.</li>
	<li>21-G 바늘을 포함 하는 주사기의 열린 끝에 튜브 #1 내용물을 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 삽입 하 고 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 주사기를 세척 하 고 압출 용액을 튜브 #2에 놓습니다.</li>
	<li>5 mL의 PBS 용액을 사용 하 여 세척 튜브 #1. 나머지 신장 조직을 가용 화할 수 있도록 튜브 #1에 PBS를 소용돌이.</li>
	<li>다시, 18g 바늘을 포함 하는 5 mL 주사기에서 플런저를 조심 스럽게 제거 하 고 튜브 #1 내용물을 주사기의 열린 끝에 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 부드럽게 플런저를 아래로 밀어 주사기를 플러시, 튜브 #2에 솔루션을 압출. 이 과정을 2 배 반복 합니다 (총 3 배).</li>
	<li>튜브 #2에 최대 50 라인까지 PBS를 추가 하 여 최대 50 mL의 튜브 #2 총 부피를 가져옵니다.</li>
	<li>신장 조직 용액을 로커 플레이트의 튜브 랙에 포함 하는 배양 관 #2 4°c에서 하룻밤 동안 설정 된 냉장고 (최소 8-10 시간).</li>
</ol>3. 사 구체 계산 및 네 프 론의 외삽 수
<ol><li>냉장고에서 튜브 #2를 제거 하 고 균질 한 용액을 만들기 위해 튜브를 여러 번 살짝 반전 하 여 펠 레로 모 조직을 소생 시킵니다. 처리 후 5 d 내에서 사 구체를 계산 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>조심 스럽게 12 웰 플레이트의 하나의 우물에 신장 용액의 µ L을 500. 이 2 배를 반복 하 여 각 매 취 액을 별도의 우물에 두어 신장 당 세 개의 웰이 있고 삼중 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>신장 용액을 포함 하는 3 개의 웰 각각에 500 µ L의 PBS를 추가 하 여 1:1 희석 하십시오.</li>
	<li>반전 현미경을 사용 하 여, 잘 당 사 구체 수를 세어. 계수는 각 웰의 하단에 배치 된 16 개의 개별 섹션 그리드를 사용 하 여 지원 됩니다. 각 그 리딩 된 섹션 당 사 구체 수를 세어 다음 그리드 당 수를 합산 하 여 웰 당 사 구체 총 수를 얻습니다. 사 구체는 그들의 구형 구조에 의해 쉽게 식별할. 추가 식별자에는 혈액으로 채워진 모세 혈관으로 인 한 붉은 색조 뿐만 아니라 개별 사 구체 신체에 부착 된 상태를 유지 하는 사전 또는 사후 세 동맥 포함 되어 있습니다 (그림 1).</li>
	<li>사 구체의 총 수를 추가 3 개의 우물의 각각에 대해 계산 후 신장 용액 500 µ L 당 사 구체의 평균 수에 대해 세 가지로 나누어. 웰 당 평균 사 구체 수의 분산이 10%를 초과할 경우, 신장 용액의 균질 한 성질에 세심 한 주의를 기울여 네 프 론의 계수 절차를 반복 합니다. 사 구체는 신장 당 사 구체 평균 수에 대 한 웰 타임즈 100에 계산 된 수를 곱합니다. 총 네 프 론의 수는 신장 당 또는, mg 또는 조직의 g 당 신장 체중을 사용 하 여 발현 될 수 있다.</li>
</ol>

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좋은 실험 기법으로, 산 침 용 방법은 전체 신장의 네 프 론의 수를 추정 하는 데 이상적입니다. 신장은 산에 용 해 되지만, 사 구체는 크게 그대로 유지 하 고 쉽게 식별, 개별 사 구체 계산 상대적으로 쉽고 간단 하 게. 산 성 침 용 기법은 특히 여러 가지 이유로 유리 하다. 첫째, 산 성 침 용 법은 비용과 물리적 노력의 측면에서 상대적으로 적은을 필요로 하는 신속 하 고 편리한 방법입니다. 산 성 침 용 법을 수행 하는 데 필요한 모든 시 약과 소모품은 대부분의 기본 실험실에서 쉽게 구할 수 있으며, 사 구체 계산을 위한 도립 현미경에 대 한 접근이 유일한 주요 요구 사항입니다. 비용 측면에서, 산 침 화 방법은 동물 당 단지 몇 백 달러 비용을 추정 하 고,이는 자기 공명 영상과 같은 전체 신장 사 구체 카운팅의 다른 방법과 관련 된 비용에 비해 많은 경우, 스캔 시간 및 기술 전문성의 동물 당 수천 달러에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.
둘째, 상기 산 침 용 법은...

네 프 론의 기본 구조와 신장1의 기능 단위입니다. 구조적으로, 네 프 론의 사 구체 (모세 혈관과 세포)는 보 먼의 캡슐 내에 위치 하 고 신장 세관, 근 위 세관, Henle의 루프 및 수집 덕트로 종결 되는 말단 세관으로 구성 됩니다. 기능적으로, 네 프 론의 역할은 물과 전해질의 여과 및 재흡수와 폐기물의 분 비입니다. 일반적으로, 신장은 마우스와 쥐2와 같은 여러 종에서 출생 직후 인 간에 서 임신 36 주에 완료 됩니다. 네 프 론 엔 다 우먼 트는 개인이 태어난 네 프 론의 총 수를 말하며, 반면 네 프 론 수는 출생 후3년에 언제 든 지 측정 된 네 프 론의 총 개수입니다. 용어 네 프 론의 숫자와 사 구체 숫자는 종종 같은 의미로 사용 됩니다. 네 프 론의 사 구체 1 개만 있기 때문에, 사 구체 수의 평가는 네 프 온 수를 추정 하는 중요 한 대리 이다.
네 프 론의 엔 다 우먼 트와 네 프 론의 수치는 네 프 론의 자질과 심혈 관 질환의 발병 률이 증가 하는 네 프 론의 숫자와의 연관성을 입증 한 것으로 임상적 관심을가지고 있다4,5 ,8,10,9,13 ,11,12 15. 부검에서 신장의 연구 결과에 근거 하 여, 브 레너는 고혈압 환자 들이 노 몰 하는 사람들16보다 낮은 총 수의 네 프 론을 제시 했다는 것을 관찰 했습니다. 따라서, 브 레너는 네 프 론의 수와 인생에서 나중에 고혈압을 개발의 위험 사이에 역 관계가 있다는 가설. 브 레너는 또한 네 프 론 수의 감소가 남아 있는 네 프 톤에 의해 보상 되었다는 것을 가설 했다. 신장에서 정상적인 여과 속도를 유지 하기 위해, 잔여 네 프 톤은 사 구체 표면적 (사 구체 비 대)을 증가 시 킴으로써, 신장 기능4 에 대 한 네 프 론의 부작용을 완화 하는 작용을 합니다 ,16.
단기, 사 구체 비 대에서 보호 하는 동안, 장기에, 증가 나트륨과 유체 유지에 이르게, 증가 세포 외 유동성 볼륨, 그리고 동맥 혈압 증가, 더 증가의 악순환으로 이어지는 사 구체 모 세관 압력, 사 구체 하이퍼 여과, 네 프 론의 흉터 (경화 증) 및 부상4,16.
네 프 론의 추정치 또는 개수를 구하는 것은 몇 가지 실험적 이점을 제공 합니다. 1)이는 신 기원 과정에 관한 정보를 제공 하며,이는 배아 또는 모계 태아 환경의 특정 유전자 또는 인자에 연결 될 수 있으며, 2) 심장 혈관 질병을 가진 네 프 론의 수의 협회가 있으며, 따라서, 네 프 론의 추정치는 미래의 심혈 관 위험을 예측 하는 데 사용 될 수 있는 가능성이 있다2,17,18, 19 , 20 , 21 , 22. 모계 태아 환경 외에도 몇몇 질병은 동맥 경화 증, 당뇨, 고혈압, 심지어 정상적인 노화를 포함 하는 네 프 론의 수와 신장 기능에 직접적으로 영향을 미치기 때문에2,9, 10,11,12,21. 따라서, 전체 신장 네 프 론의 평가는 사람의 삶과 결과 효과의 과정을 통해 신 기원 (즉, 네 프 론의 엔 다 우먼 트) 및 네 프 번에 영향을 미치는 유전 및 환경적 요인을 모두 이해 하는 것이 중요 합니다 신장 기능 및 심혈 관 건강에.
현재 네 프 론의 판정 및 정량화에 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있으며, 각각의 장점과 한계를가지고 있습니다.24,25, 29,27 ,29,30. 전체 신장 네 프 론 수를 결정 하기 위한 정교한 방법에는 전위/fractionator 방법, 자기 공명 영상25,26등의 입체 방법이 포함 된다. 전체 신장 네 프 론의 수를 결정 하기 위한 금-표준으로 간주 되는 경우가 많으며, dissector/fractionator 방법은 비용과 시간이 많이 소요 됩니다. 자기 공명 영상 처리 및 프로세싱의 최근의 발전과 개선은 각각의 네 프 론의 카운트를 개별적으로 하는 도구를 제공 한다. 그러나 자기 공명 이미징은 시간 소모적 일 뿐만 아니라 매우 비쌉니다. 또한, dissector/fractionator 방식과 자기 공명 영상 모두 첨단 기술 전문 지식이 필요 하므로 대부분의 연구 실험실에서 이러한 방법의 사용을 제한 합니다.
네 프 론의 숫자를 결정 하는 대부분의 방법은, 그들은 구조적으로 쉽게 식별 할 수 있기 때문에, 사 구체 식별을 기반으로 카운트 또는 추정치를 확인 합니다. 본 논문에서, 전체 신장에서 네 프 론의 수를 추정 하는 산 성 침 용 방법은도27과 설명 된다. 상기 산 침 용 법은 전위/fractionator 방법 및 자기 공명 영상과 같은 다른 방법 들 보다 빠르고, 안정적 이며, 현저히 저렴 하다. 더욱이, 상기 산 침 용 법은 자기 공명 영상 (26)을 사용 하 여 결정 된 것 들의 범위 내에 있는 것으로 보고 되는 네 프 론의 매우 반복 가능한 추정값을 제공 한다.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane 마취</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 기화기 시스템 및 유량계</td><td>Braintree Scientific</td><td>VP I</td><td>의료용 산소 공급 장치</td></tr><tr><td>포함 라이카 도립 현미경 DMIL LED</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td>DMIL LED</td><td>모든 제작 적합한</td></tr><tr><td>디지털 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>2239</td><td>모든 제조사 적합한</td></tr><tr><td>ToughCut Fine 수술 용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>25mm 절삭 날, 11.5cm 길이; 팁 : 날카롭고 날카롭습니다. 팁 모양: 직선</td></tr><tr><td>마이크로 해부 겸자 4 1/4 in.</td><td>Biomed Res Instruments, Inc</td><td>10-1760</td><td>곡선 팁</td></tr><tr><td>플렉시글라스 보드 5 인치 x 7 인치.</td><td>모든 출처 적합</td><td>n/a</td><td>모든 제작 또한 적합한</td></tr><tr><td>육각형 폴리스티렌 계량 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-2002-100</td><td>모든 제작 또한 적합한</td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>단일 모서리 탄소강 0.009</td></tr><tr><td>거즈 스폰지 4 x 4 in. 8 플라이</td><td>Fisher Scientific</td><td>MSD-1400250</td><td></td></tr><tr><td>10x 농축 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493-4L</td><td>은 1배로 희석합니다.</td></tr><tr><td>6 N 하이드로콜린산 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3750-32</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>모든 제작</td></tr> 적합 <tr><td>50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>모든 제작 또한 적합한</td></tr><tr><td>일회용 5 mL 주사기</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-07944-06</td><td>모든 제작 또한 적합한</td></tr><tr><td>18G1.5 일회용 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td>모든 제조사 적합</td></tr><tr><td>21G1.5 일회용 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>모든 제조사</td></tr> 적합 <tr><td>12-웰 다중 웰 세포 배양 플레이트 뚜껑 Cole</td><td>Palmer</td><td>#FW-01959-06</td><td>모든 제조사</td></tr><tr><td>적합 폴리프로필렌 모듈식 시험관 랙</td><td>Cole Palmer</td><td>#EW-06733-00</td><td>15 및 50 mL 코니컬 튜브 수용 가능; 모든 것이 또한 적합합니다.</td></tr></tbody></table>

산 성 침 용 법을 사용 하 여 전체 신장의 네 프 론의 수 추정

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

네 프 론 엔 다 우먼 트는 개인이 태어난 네 프 론의 총 수를 말하며, 인간에서의 신장은 임신 36 주에 완료 되 고 출산 후에는 새로운 네 프 톤이 형성 되지 않습니다. 네 프 론 번호는 출생 후 시점에서 측정 된 네 프 론의 총 수를 지칭 한다. 유전과 환경적 요인 모두 네 프 론의 엔 다 우먼 트와 수에 영향을 미친다. 특정 유전자 또는 요인이 신 기원과 네 프 론의 손실이 나 종말의 과정에 영향을 미치는 방법을 이해 하는 것은 더 낮은 네 프 인 엔 다 우먼 트 또는 수를 가진 개인은 신장 또는 심혈 관 질환을 개발의 높은 위험에 있을 것으로 생각 됩니다. 사람의 일생 동안 환경 노출이 어떻게 네 프 론의 숫자에 영향을 미치는지 이해 하는 것은 미래의 질병 위험을 결정 하는 데에도 중요 합니다. 따라서, 전체 신장 네 프 론의 수를 신속 하 고 안정적으로 평가 하는 능력은 신 기원 또는 네 프 랭 손실을 촉진 시키거나 증진 시키는 기전을 더 잘 이해 하기 위한 기본적인 실험적 요구 사항 이다. 여기서, 우리는 Damadian, 샤이 리 및 Bricker에 의해 설명 된 절차에 기초 하 여 전체 신장의 네 프 론의 추정을 위한 산 침 용 법을 약간의 수정과 함께 설명 한다. 산 성 연 화 방법은 네 프 론의 빠르고 신뢰할 수 있는 추정치를 제공 합니다 (사 구체를 계산 하 여 평가 됨) 그 중 5% 내에서 더 고급을 사용 하 여 결정, 이기는 하지만 비싼, 자기 공명 영상과 같은 방법. 더욱이, 상기 산 침 용 법은 많은 수의 샘플 또는 실험 조건에서 네 프 론의 개수를 평가 하는 우수한 고 처리량 방법 이다.

다음은 고혈압의 확립 된 마우스 모델과 연령과 관련 된 만성 신 장병의 유전 쥐 모델에서 전체 신장 네 프 론의 대표적인 추정치입니다. 사전 또는 사후 arteriolar 또는 관 형 구조물을 부착 하거나 포함 하지 않은 구형 구조와 같은 사 구체를 식별 하는 주요 특성은 산 침 용 법에 새로운 것을 강조 합니다 (그림 1).
제 1 실험 예에 있어서, 총 네 프 론의 숫자는 14 일 동안 비 히 클 (염 분) 또는 안 지 오 텐 신 II를 포함 하는 쥐 (남성 C57BL 6 주)에서 측정 하였다. 차량 주입 마우스에서, 네 프 론 수는 산 성 침 용 법을 이용 하 여 결정 된 대로 신장 당 12411 ± 248 네 프 톤 이었다 (도 2). 이러한 추정값은...

전체 신장 네 프 론의 추정치는 네 프 론의 수와 신장 및 심혈 관 질환의 향상 된 위험 사이에 역 연관이 있기 때문에 임상적으로 그리고 실험적으로 중요 합니다. 본 원에서, 전체 신장의 네 프 론의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 추정치를 제공 하는 산 성 침 용 방법을 사용 하는 것이 입증 된다.

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

산 성 메이세레이션 방법은 신장에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며 특정 유전자가 신장 발달에 기여하거나 영향을 미치는 방법과 당뇨병이나 고혈압과 같은 특정 조건이 nephron 수에 미치는 영향을 미칩니다. 이것은 태아 발달 도중 태어난 개별을 가진 출생한 개별이 신장 병리학과 연관되었기 때문에 신장의 총 수로 중요합니다. 산 성 메이션 방법의 주요 장점은 자기 공명 화상 진찰과 같은 다른 nephron 카운팅 방법 보다 더 빠르고, 재현 가능하고, 저렴하며, 시간이 덜 소요된다는 것입니다.이 기술은 신장 기능에 대한 신장 수의 영향의 상관 관계를 용이하게하며, 이는 특정 유전자가 nephron 기능 및 개발에 미치는 영향에 대한 이해를 증진하는 데 중요합니다. 전반적인 nephron 수에 영향을 미치는 유전자 또는 요인의 연구는 질병 관련 nephron 손실을 제한하도록 설계된 약리학 또는 유전 적 접근의 개발에 도움이 될 것입니다. 좋은 실험 기술과 연습으로, 이 방법에 새로운 개인은 쉽게 전체 신장 nephron 수의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 추정을 허용하는 산 성 메이션 방법의 숙달을 얻어야 한다.미세 한 수술 가위를 사용하여 중간선을 따라 마우스 복강을 열어 시작합니다. 창자와 생식 지방을 동물의 오른쪽으로 조심스럽게 옮길 수 있습니다. 총 해부를 사용하여 왼쪽 신장을 분리하고 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 잘라 내어 장기를 PBS의 적절하게 표시된 계량 보트로 배치한 신장을 조심스럽게 제거합니다.같은 방식으로 올바른 신장을 수집하고 PBS로 미리 촉촉한 수술 거즈에 신장을 배치합니다. 어떤 부착된 비 신장 조직 및 신장 캡슐을 신속하게 제거하십시오. 그런 다음 각 신장에 개별적으로 좌우 기관의 무게를 별도로 기록합니다.계량 후 각 신장을 PBS 없이 적절하게 표시된 계량 보트에 다시 넣고 깨끗한 면도날을 사용하여 각 장기를 반길이로 자릅니다. 각 신장 반컷 측면을 놓고 각 절반을 2밀리미터 또는 작은 조각으로 자른다. 동일한 면도날을 사용하여 다진 신장 조각을 적절하게 표시된 15 밀리리터 원판 튜브로 조심스럽게 옮기십시오.통풍이 잘 되는 연기 후드에 각 튜브에 6개의 어금다 염산 5밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 90 분 동안 37섭씨 수조에 튜브를 넣기 전에 신장산 혼합물을 부드럽게 교반합니다. 산성 메이션의 끝에서, 신장 당 하나의 5 밀리리터 주사기에 하나의 18 게이지 바늘을 부착하고 신중하게 주사기 플런지를 제거합니다.주사기를 개별 50 밀리리터 원추형 튜브에 연기 후드에 넣고 각 주사기의 열린 끝에 신장 솔루션을 부어 빈 튜브를 테스트 튜브 랙에 따로 놓습니다. 그런 다음 바늘을 통해 50 밀리리터 튜브로 각 용액의 느린 압출을 위해 플런서를 조심스럽게 교체하십시오. 15 밀리리터 원옥 튜브를 튜브 당 PBS 용액 5밀리리터로 세척하여 PBS를 소용돌이시면 남은 신장 조직을 용해시합니다.방금 입증 된 대로 적절한 50 밀리리터 튜브에 세척 내용을 돌출하십시오. 세 번째 세척을 압출 한 후 각 주사기를 21 게이지 바늘로 장착하십시오. 50 밀리리터 튜브의 내용을 작은 보어 바늘 세척을 통해 50 밀리리터 튜브의 두 번째 세트로 돌출하고 신선한 PBS로 처음 50 밀리리터 튜브 내용을 세 번 압출합니다.세 번째 세척 및 압출 후, 추가 PBS와 각 튜브에 총 볼륨을 가지고 하룻밤 4 섭씨에서 로커 플레이트에 랙에 튜브를 배치합니다. 처리 5일 이내에 12개의 웰 플레이트의 6개의 우물 바닥에 16개의 별도의 섹션이 포함된 그리드를 배치합니다. 부드럽게 펠릿 조직을 다시 중단 신장 용액의 튜브를 여러 번 반전.신장당 각 균질화 용액의 500마이크로리터 알리쿼트 3개를 신장당 3개의 웰 각 에 12개의 웰 플레이트에 조심스럽게 추가합니다. PBS의 동일한 볼륨으로 각 우물의 내용을 희석. 반전 된 현미경의 단계에 접시를 배치합니다.구형 구조, 붉은 색조 및 개별 글로메룰리 의 몸에 부착 된 동맥 이전 또는 포스트 동맥에 의해 구물물기를 식별합니다. 각 그리드섹션당 글로메룰리 수를 계산하여 그리드당 수를 계산하여 음부당 총 구물수 수를 계산합니다. 그런 다음 신장 당 글로메룰리의 평균 수를 얻기 위해 100 번 잘 당 글로메룰리의 수를 곱합니다.본 대표적인 실험에서, 14일 동안 차량으로 주입된 마우스의 전체 네프론 수는 신장당 약 12, 500개의 네프론이었다. 그러나 안지오텐신2주주입은 심방 압력을 약 40mm의 수은으로 증가시켰으며, 전체 네프론 수의 거의 26% 감소와 관련이 있었다. 쥐 신장 기발생의 이 유전 모형에서는, 2개의 신장으로 품어진 동물은 입증된 바와 같이 산 성 maceration 후에 신장 당 약 27, 500의 신장당 신장당 신장을 포함하는 계산되었습니다, 고독한 신장으로 품어진 쥐는 현저하게 더 낮은 총 신장 수를 가지고 있는 동안.두 실험에서 추정쥐에서 이전에 보고 된 범위와 일치 했다. 산성 메이세레이션 방법은 전체 신장에서 신장 의 니프론 수를 추정하는 데 이상적입니다, 특히 디섹터 분수 방법 또는 자기 공명 영상과 같은 nephrons을 계산하기위한 더 많은 노동 집약적 및 비용 금지 기술을 갖추고 있지 않은 실험실에서. 이 방법은 자기 공명 화상 진찰에 의해 결정된 숫자의 5% 이내인 전체 신장 신장 신장 수의 높은 처리량, 능률, 그리고 재현가능한 추정을 허용합니다.신장의 수의 평가는 감소된 nephron 수가 만성 신장 병과 같은 심장 혈관 질병의 증가한 리스크와 연관되었기 때문에 임상 관련성입니다. 염산으로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑, 보호 안경 및 실험실 코트 착용과 같은 예방 조치를 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Acid Maceration Method를 사용한 Whole Kidney의 네프론 수 추정

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산 성 침 용 법을 사용 하 여 전체 신장의 네 프 론의 수 추정

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