Acid Maceration Method를 사용한 Whole Kidney의 네프론 수 추정

산성 침용법은 신장에 대한 주요 질문과 특정 유전자가 네프론 발달에 어떻게 기여하거나 영향을 미치는지, 당뇨병이나 고혈압과 같은 특정 질환이 네프론 수에 어떤 영향을 미치는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 개인이 태아 발달 과정에서 가지고 태어난 네프론의 총 수가 결정되고 네프론의 손실이 신장 병리학과 관련이 있기 때문에 중요합니다. 산 침용 방법의 주요 장점은 자기 공명 영상과 같은 다른 네프론 계수 방법보다 빠르고, 재현 가능성이 높고, 저렴하고, 시간이 덜 걸린다는 것입니다.

이 기술은 네프론 수가 신장 기능에 미치는 영향의 상관 관계를 용이하게 하며, 이는 특정 유전자가 네프론 기능과 발달에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 이해를 심화하는 데 중요합니다. 전체 네프론 수에 영향을 미치는 유전자 또는 요인에 대한 연구는 질병 관련 네프론 손실을 제한하기 위해 고안된 약리학적 또는 유전적 접근 방식의 개발에 중요한 역할을 할 것입니다. 좋은 실험 기법과 연습을 통해 이 방법을 처음 접하는 개인은 전체 신장 네프론 수를 신뢰할 수 있고 재현 가능한 추정을 가능하게 하는 산 침용 방법에 쉽게 숙달될 것입니다.

미세한 수술 용 가위를 사용하여 정중선을 따라 마우스의 복강을 여는 것으로 시작하십시오. 장과 생식 지방을 동물의 오른쪽으로 조심스럽게 이동시킵니다. 총박리를 사용하여 왼쪽 신장을 분리하고 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 절단하여 신장을 조심스럽게 제거한 다음 장기를 적절하게 라벨링된 PBS의 계량 보트에 넣습니다.

같은 방법으로 올바른 신장을 채취하고 PBS가 미리 적신 수술용 거즈에 양쪽 신장을 놓습니다. 부착된 비신장 조직과 신낭을 빠르게 제거합니다. 그런 다음 각 신장의 무게를 개별적으로 측정하여 왼쪽과 오른쪽 장기의 무게를 따로 기록합니다.

칭량 후 각 신장을 PBS가 없는 적절하게 표시된 계량 보트에 다시 넣고 깨끗한 면도날을 사용하여 각 장기를 세로로 반으로 자릅니다. 신장 반쪽을 자른 면이 아래로 향하게 놓고 각 반쪽을 2mm 이하로 자릅니다. 동일한 면도날을 사용하여 다진 신장 조각을 적절하게 표시된 15ml 원추형 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.

통풍이 잘 되는 흄 후드에서 각 튜브에 6몰 염산 5밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 튜브를 섭씨 37도의 수조에 90분 동안 넣기 전에 신장 산 혼합물을 부드럽게 저어줍니다. 산성 침용이 끝나면 신장 당 5ml 주사기 1개에 18게이지 바늘 1개를 부착하고 주사기 플런저를 조심스럽게 제거합니다.

흄 후드에 있는 개별 50ml 원뿔형 튜브에 주사기를 놓고 각 주사기의 열린 끝에 신장 용액을 붓고 빈 튜브는 시험관 랙에 따로 보관합니다. 그런 다음 바늘을 통해 각 용액을 50ml 튜브로 천천히 압출하기 위해 플런저를 조심스럽게 교체하십시오. 15ml 원뿔형 튜브를 튜브당 5ml의 PBS 용액으로 세척하고 PBS를 소용돌이치며 남아 있는 신장 조직을 용해시킵니다.

방금 보여준 것처럼 세척 내용물을 적절한 50ml 튜브로 밀어 넣습니다. 세 번째 세척을 압출한 후 각 주사기에 21게이지 바늘을 장착합니다. 50 밀리리터 튜브의 내용물을 더 작은 보어 바늘을 통해 두 번째 50 밀리리터 튜브 세트로 밀어 넣고, 시연된 바와 같이 새 PBS로 첫 번째 50 밀리리터 튜브 내용물을 세 번 세척하고 압출합니다.

세 번째 세척 및 압출 후 추가 PBS를 사용하여 각 튜브의 총 부피를 최대 50ml까지 가져오고 튜브를 섭씨 4도의 로커 플레이트의 랙에 밤새 놓습니다. 처리 후 5일 이내에 16개의 개별 섹션을 포함하는 그리드를 12개의 웰 플레이트의 6개 웰 바닥에 배치합니다. 신장 용액이 담긴 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 펠릿 조직을 다시 현탁시킵니다.

신장당 균질화된 각 용액의 500마이크로리터 분취량 3개를 12웰 플레이트의 웰 3개 각각에 조심스럽게 추가합니다. 각 웰의 내용물을 동일한 부피의 PBS로 희석합니다. 플레이트를 무대에 놓습니다.tage 도립 현미경의.

사구체는 구형 구조, 붉은 색조, 개별 사구체의 몸체에 부착된 사전 또는 사후 동맥으로 식별합니다. 각 그리드 섹션당 사구체의 수를 계산하여 우물당 사구체의 총 수를 계산하기 위해 그리드당 수를 합산합니다. 그런 다음 웰당 사구체 수에 100을 곱하여 신장당 평균 사구체 수를 구합니다.

이 대표적인 실험에서는, 14 일 동안 비히클을 주입한 쥐에 있는 총 네프론 수는 대략 12, 신장 당 500개의 네프론이었다. 그러나 안지오텐신 2 주입은 심방 압력을 약 40mm 수은 증가시켰으며 총 네프론 수를 거의 26% 감소시키는 것과 관련이 있었습니다. 이 쥐의 신장 무형성 유전자 모델에서, 두 개의 신장을 가지고 태어난 동물은 산성 침식 후 신장 당 약 27,500개의 네프론을 함유하는 것으로 계산되었으며, 단독신장을 가지고 태어난 쥐는 총 네프론 수가 현저히 낮은 것으로 밝혀졌습니다.

두 실험의 추정치는 이전에 쥐에서 보고된 범위와 일치했습니다. acid maceration 방법은 전체 신장에서 네프론 수를 추정하는 데 이상적이며, 특히 disector fractionator 방법 또는 자기 공명 이미징과 같이 네프론을 계수하기 위한 노동 집약적이고 비용이 많이 드는 기술을 갖추지 않은 실험실에서 특히 그렇습니다. 이 방법을 사용하면 자기 공명 영상에 의해 결정된 수치의 5% 이내에 있는 전체 신장 네프론 수에 대한 높은 처리량, 효율적이고 재현 가능한 추정을 할 수 있습니다.

네프론 수의 평가는 네프론 수의 감소가 만성 신장 질환과 같은 심혈관 질환의 위험 증가와 관련이 있기 때문에 임상적 관련성이 있습니다. 염산으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 장갑, 보호 안경, 실험실 가운을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.