Name: Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 배우세요 광표백 기법과 확률적 광학 재구성 현미경을 결합하여 Prochlorococcus의 FtsZ 단백질 링을 초고해상도로 시각화하는 방법을. 이 기술은 광합성 생물의 단백질 역학 연구에 활용됩니다.

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저자는 그녀의 기술 지원 및 원고에 대 한 의견 Daiying 쑤 감사합니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (프로젝트 번호 41476147)에서 교부 금 및 연구 보조금 위원회는 홍콩 특별 행정구, 중국 (프로젝트 번호 689813 및 16103414)의 의해 지원 됩니다.

1. 샘플 준비 및 고정
<ol><li>해 수 기반 Pro99 중간12의 5 mL을 axenic Prochlorococcus MED4의 1 mL 접종 5 일 후 35 µmol 광자/m2s의 진도 빛 아래 23 ° C에서 Prochlorococcus 문화 성장, 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 수집 합니다. 참고:는 접종 후 5 일 Prochlorococcus MED4 도달 한다 늦은 로그 단계, 약 108 셀/mL, 폭풍 이미징에 대 한 적절 한입니다.</li>
	<li>문화를 해결 하기 위해 1.5 mL 튜브에 갓 25 %paraformaldehyde (PFA) (w/v)에서 준비 하는 포름알데히드의 100 µ L, 50% 글의 2 µ L를 추가 합니다. 20 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 샘플을 품 어. 참고: 샘플은 유지 고정을 위한 어둠 속에도 빛 때문에 민감한.</li>
	<li>스핀 1 분; 13500 x g 에서 샘플 다운 그리고는 상쾌한 제거 resuspend Pro99 중간12의 100 µ L에 셀. Immunostaining까지 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>2. 폴리스 티 렌 구슬 Coverslip precoating
참고: 폴리스 티 렌 구슬 드리프트 보정을 위한 표준 표식으로 간주 됩니다.
<ol><li>소용돌이 원래 폴리스 티 렌 구슬의 유리병 및 준비 작업 슬러리로 50% 에탄올 1:20,000 희석.</li>
	<li>핫 플레이트, 온도 120 ° C를 설정 켜고 coverslips 뜨거운 접시에 놓습니다.</li>
	<li>각 coverslip에 작업 슬러리의 100 µ L를 로드 합니다. 10 분 동안 뜨거운 접시에 coverslip 품 어 하 고, 실내 온도에 저장에 대 한 접시에는 coverslips를 신중 하 게 전송. 참고: 그것에 붙어 있던 구슬 가진 측, 직면 한다 그리고 셀 같은 쪽에 붙어 있어야 한다. 구슬은 coverslips에 움직일 수 있으며 샘플에 떠도는 수정 사용 폭풍 이미징 동안 실시간. 구슬 immobilizing, 후에 coverslips는 불 수 없습니다.</li>
</ol>3. 폴 리-L-리 신 구슬 코팅 Coverslip에의 코팅
참고:이 cyanobacterial 셀의 동원 정지에 대 한 이루어집니다.
<ol><li>비드 코팅 면이는 coverslip의 중심으로 폴 리-L-리 신 (1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자.</li>
	<li>한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 첨부 되지 않은 폴 리-L-lysine을 열망 하 고 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. 폴 리-L-리 신 다시 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>60 mm 페 트리 접시에 coverslip 울트라 필터링 물 10 mL로 씻어 고 간단히 종이 타월에 coverslip 건조.</li>
	<li>coverslip 나중 사용을 위해 페 트리 접시 (100 mm)에 저장 합니다. 요리 하는 coverslip의 첨부 파일을 방지 하기 위해 라인 parafilm의 레이어와 페 트리 접시. 참고: 구슬와 폴 리-L-리 신, 도장된 coverslip 저장할 수 있습니다 실내 온도에 적어도 절반 년. 따라서, 사전에 coverslips의 배치를 준비 하 고 좋습니다.</li>
</ol>4입니다.는 Coverslip 셀의 동원 정지
<ol><li>도장된 coverslip parafilm 참조 됩니다 얼룩 접시로 이제부터 아래쪽으로 새로운 배양 접시에 전송. 하는 coverslip에 고정된 샘플의 100 µ L 로드 셀 첨부 파일을 허용 하도록 30 분 동안 앉아 보자.</li>
	<li>것입니다 라고를 세척 접시 이제부터 12-잘 접시의 우물에는 coverslip 전송. coverslip 씻어 잘에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (10 m m 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4, 137 m m NaCl, 그리고 2.7 m m KCl, pH 7.4)의 1 mL를 추가 합니다. PBS 버퍼를 제거 하 고 다시는 coverslip 씻어 새로운 PBS 버퍼를 추가 합니다.</li>
</ol>5입니다. permeabilization Cyanobacterial 셀의
<ol><li>피 펫을 사용 하 여 PBS 버퍼를 제거 합니다. 0.05% 비 이온 세제-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0), 및 0.2 mg/mL lysozyme 세척 접시의 우물에 갓된 permeabilization 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>20 분 동안 37 ° C에 세척 접시를 품 어. 그런 다음 permeabilization 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>1 mL의 PBS 버퍼를 추가 하 고 5 분 제거 PBS 버퍼에 대 한 부드럽게 세척 접시를 쉐이크 통에 세척 접시를 놓습니다. 이 단계는 coverslip 씻어 3 배를 반복 합니다.</li>
</ol>6. 엽록소의 Photobleaching 차단 단계에서 안료
<ol><li>얼룩 요리 하는 coverslip 전송. 0.2% (v/v) 비 이온 세제-100과는 coverslip 상단 3% (v/v) 염소 혈 청 블로킹 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>얼음에 플레이트를 얼룩 전체 놓고 1800 µmol 광자/m2·s에 광도와 크 세 논 빛 소스 적어도 60 분 동안 photobleaching에 대 한 이동 합니다.</li>
	<li>Photobleaching 후에 차단, 조심 스럽게 종이 타월의 가장자리와 adsorbing 여 블로킹 버퍼를 제거. 참고: 크 세 논 빛의 강도 너무 높은 적절 한 선글라스의 쌍 눈 보호를 위해 필요 하다. 한편, 광원 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 눈 손상 될 수 있는 빛의 누수를 방지 하려면 접시 포장. coverslip 촉촉한 유지 되도록 coverslip 매 15 분을 확인 합니다. 건조는 coverslip 이면 차단 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>7. 항 체 바인딩
<ol><li>안티-Anabaena FtsZ 항 체 제조업체의 지침에 따라 물 200 µ L에 녹.</li>
	<li>블로킹 버퍼의 99 µ L로 안티 FtsZ 항 체의 1 µ L를 희석. coverslip에 희석된 주 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
	<li>세척 접시는 coverslip 전송. 1 mL의 PBS 버퍼를 추가 하 고 쉐이크에 세척 접시를 놓습니다. 부드럽게 흔들어 세척 접시 5 분 반복에 대 한이 단계는 coverslip 씻어 3 배.</li>
	<li>얼룩 요리 하는 coverslip 전송. 블로킹 버퍼의 500 µ L로 이차 항 체의 1 µ L를 희석. coverslip에 희석된 이차 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 실 온에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>세척 접시는 coverslip 전송. 통에 PBS 버퍼의 1 mL와 함께 그것을 씻어. 부드럽게 흔들 5 분 랩에 대 한 세척 접시 광선이 있도록 알루미늄 종이로 세척 접시. 3 x이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>우물에 갓 4 %paraformaldehyde (PFA) (w/v)에서 준비 하는 포름알데히드의 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 15 분 동안 coverslip 품 어.</li>
	<li>포름알데히드를 제거 하 고 세척 단계 3를 반복.</li>
	<li>영상까지는 coverslip 어둠 속에서 4 ° C에서 PBS 버퍼에 저장 합니다.</li>
</ol>8입니다. 버퍼 이미징 폭풍의 준비
<ol><li>바로 폭풍 영상 앞 표 1에 따라 버퍼 이미징의 1 mL를 준비 합니다. 참고: 이미지 버퍼의 수명 약 2 시간으로, 준비 신선한 사용 하기 바로 전에. 포도 당 산화 효소 및 catalase의 추가 후에 vortexing를 하지 마십시오. 주의: 메 틸 비올로겐은 유독한 물자 이다. 특히 신경을 처리 하시기 바랍니다. Cyclooctatetraene는 고양이 발암 물질로 분류 된다. 1 화학입니다. 제발 흡입을 방지 하 고 피부 접촉 화학 후드에서 cyclooctatetraene 재고 솔루션 및 이미징 버퍼를 만들.</li>
</ol>9. 이미지 수집 스톰 데이터
<ol><li>로드 로드 챔버 (그림 1)에 coverslip. 부드럽게 cyanobacterial 세포 세척 피하려고 챔버로 갓된 이미징 버퍼를 로드 합니다. 공기에 있는 산소와의 반응을 방지 하기 위해 이미징 버퍼 상단 직사각형 coverslip 장소. 아래는 coverslip 트랩 공기 방울을 피하십시오.</li>
	<li>카메라, LED 조명과 레이저를 켭니다. 이미지 수집, 중심 위치 결정 및 보정13표류 하는 샘플에 대 한 오픈 폭풍 소프트웨어.</li>
	<li>렌즈 위에 침수 기름 반 방울을 추가 합니다. 챔버를 로드 하 고 있는지 확인 하십시오 목표의 렌즈는 coverslip와 접촉 하는 게.</li>
	<li>750 nm 레이저로 신호를 검사 합니다. 참고: 항상는 autofluorescence 감소 되도록 두 번째 항 체 마이너스 얼룩 네거티브 컨트롤을 포함 합니다.</li>
	<li>셀 및 표준 마커를 포함 하는 샘플 영역을 식별 합니다. 보정을 표류 하는 샘플에 대 한 소프트웨어를 시작 합니다. 참고: 일반적으로, 이상적인 샘플 영역 10-30 셀을 포함합니다. 한편, 셀 겹치는 셀을 피하기 위해를 잘 분리 되어야 한다.</li>
	<li>기준으로 한 넓은 필드 이미지 획득, 카메라 전자 곱셈 (EM)와 300와 30 ms (그림 2A)의 노출 시간에 얻을.</li>
	<li>높은 전력, 약 4.5 kW/c m2을 750 nm 여기 레이저 강도 증가. fluorophores 스파스 점멸 패턴으로 전환 했습니다, 일단 33 Hz (그림 2B)에서 10000 프레임을 수집 하 여 하나의 슈퍼 해상도 이미지를 얻을. 참고:는 fluorophores 절연 하지 않으면, 몇 분 더 fluorophores 어두운 상태로 전환 되 고 고립 된 단일 분자 순서 대로 깜박일 때까지 기다립니다. 여기에 설명 된 프레임 수 샘플에 적합 하 고 다른 대상된 구조에 대 한 최적화가 필요 합니다.</li>
</ol>10. 원시 데이터에서 슈퍼 해상도 이미지의 재구성
<ol><li>ImageJ QuickPALM (테이블의 재료)14 라는 플러그인을 사용 하 여 3 차원 컬러 슈퍼 해상도 이미지를 재구성 하. 참고:는 예비 색채 이미지 (그림 2C) 색된 스케일 바 (그림 2C) 나타납니다. 색에는 z 축 깊이 나타냅니다.</li>
	<li>3 차원 비디오, 구문에서 슈퍼 해상도의 스택 구조를 설명 하기 위해 z 축 이미지 구분 마다 10 nm QuickPALM14를 사용 하 여. 스택의 밝기를 조정 하 고 복제 한 대상 셀의 스택. ImageJ 3D 뷰어 (자료 테이블)15 라는 플러그인을 사용 하 여 셀의 3 차원 이미지를 생성. 데모에 대 한 3 차원 구조의 회전을 기록 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 설명 하는 cyanobacterium Prochlorococcus (그림 3C)의 autofluorescence를 크게 감소 하는 절차와, 다음, immunostain 공부 3 차원 FtsZ 폭풍을 활용 수 있게 세포에 있는 단백질 반지 Prochlorococcus (그림 4)에서 형태학. 이 프로토콜은 슈퍼 해상도 영상 다른 광합성 유기 체에 대 한 채택 될 수도 있습니다.
광합성 유기 체에 대 한 이전 연구 주로 슈퍼 해상도 이미징 SIM 높은 강도 레이저를 필요로 하지 않습니다 달성 하기 위해 SIM을 사용. 그러나, SIM의 공간 해상도가입니다만 ~ 100 nm1, 폭풍의 그것 보다 훨씬 낮은. 이 연구에서는 폭풍 이미지의 공간 해상도 9.6 도달할 수 z 축<sup class...

슈퍼 해상도 microscopies 빛의 회절 한계를 휴식 하 고 하위 회절 해상도 (< 200 nm) 내에서 이미지를 제공할 수 있습니다. 그들은 널리 사용 되었습니다 많은 유기 체에서 단백질 지 방화 및 subcellular 구조 공부 하. 슈퍼 해상도 현미경 방법 등 구조화 조명 현미경 (SIM)를 주요 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치), 폭풍, 그리고 photoactivated 지역화 현미경 검사 법 (종 려). 메커니즘 및 응용 프로그램의 이러한 슈퍼 해상도 현미경 되었습니다 다른1,2검토.
폭풍 10 높은 해상도 달성할 수 있다 공간 분리3,4nm. 폭풍, 회절 제한 된 지역 내에서 하나의 분자 ("에") 활성화 되 고 분자의 나머지 ("off") 사 유지 됩니다. 단일 분자의-와 급속 한 스위치에의 축적, "회절 무제한" 이미지 생성된3수 있습니다. 한편, 많은 종류의 유기 염료 및 형광 단백질 고해상도 현미경5,6일반 형광 현미경 검사 법에서 쉽게 업그레이드할 수 있도록 폭풍에 적용 됩니다.
폭풍은 널리 적용 되지 광합성 세포, 박테리아, 조류, 등에서 하며 식물 세포 엽록체7,8, 사실 그 폭풍은 드라이브 photoswitching 높은 레이저 강도. 고 강도 레이저 형편이 나쁘게 광합성 세포에 강한 autofluorescence 배경 흥분 하며 폭풍 영상에서 단일 분자 지역화 방해 합니다. 폭풍우를 사용 하 여 subcellular 구조 또는 광합성 세포에 있는 단백질 상호 작용을 조사 하려면, 우리는 배경 autofluorescence 신호9를 풀기 위해 photobleaching 프로토콜을 개발 했다. 일상적인 immunofluorescent 얼룩 절차에서는 표본 단계에서 차단, 폭풍에 대 한 요구 사항에 맞게 광합성 세포의 autofluorescence를 절감 하 고 강도의 하얀 빛에 노출 됩니다. 따라서,이 프로토콜은 폭풍 안료 생물 조사 가능 합니다.
여기, 우리는 폭풍 FtsZ 반지 조직 단 세포 picocyanobacterium Prochlorococcus에서 이미지를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. FtsZ 반지 구조 (Z 반지) 셀10 의 둘레를 polymerizes 이며11세포 분열 필수적인 매우 보존된 tubulin 같은 cytoskeletal 단백질 이다. Prochlorococcus 유지은 autofluorescent 배경 및 기본 안티-FtsZ 항 체와 immunostained을 줄이기 위해 첫 번째 photobleached와 보조 반대로 토끼 (H + L) IgG 항 체는 fluorophore와 활용은 다음 (예: , 알 렉 사 Fluor 750). 결국, 폭풍우는 다른 세포 주기 단계 동안 Prochlorococcus 에서 자세한 FtsZ 반지 단체를 관찰 하는 데 사용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>폴리스티렌 입자</td><td>Spherotech</td><td>PP-20-10</td><td>2.0-2.4 &micro; m</td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>Marienfeld</td><td>0111580</td><td>18mm &empty;, 두께 번호 1</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Scharlau</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 하이드로브로마이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9155</td><td>mol wt 70,000-150,000</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액, 50%</td><td>시그마-알드리치</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td><td>Gold 생명공학</td><td>E-210-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>항<> Anabaena FtsZ 항체</td><td>Agrisera</td><td>AS07217</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-21039</td><td>Alexa Fluor 750</td></tr><tr><td>D-Glucose 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>메틸 바이올로겐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>856177</tr><tr><td>시클로옥타테트라엔</td><td>시그마-알드리치</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)</td><td>시그마-알드리치</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>포도당 산화효소</td><td>시그마-알드리치</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아</td><td>제 시그마-알드리치</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>XD-300 제논 광원</td><td></td><td></td><td>250W</td></tr><tr><td>STORM 현미경</td><td>NBI</td><td>SRiS 현미경</td><td></td></tr><tr><td>Rohdea</td><td>NBI</td><td>SRiS 3.0</td><td>이미징 획득용 소프트웨어</td></tr><tr><td>, Luna</td><td>NBI</td><td>SRiS 3.0</td><td>드리프트 보정용 소프트웨어</td></tr>, <tr><td>QuickPALM</td><td></td><td></td><td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td></tr><tr><td>3D 뷰어</td><td></td><td></td><td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home</td></tr></tbody></table>

photobleaching은 cyanobacterium prochlorococcus 에서 ftsz 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

슈퍼 해상도 현미경은 단백질 상호 작용 및 많은 유기 체에서 subcellular 구조 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나 광합성 유기 체,, 슈퍼 해상도 영상의 가로 해상도만 ~ 100 nm. 낮은 해상도 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍) 등 슈퍼 해상도 영상에 필요한 고 강도 레이저에 의해 발생 하는 광합성 세포의 높은 autofluorescence 배경 때문 이다. 여기, 우리는 photobleaching 기반 폭풍 방법을 개발 된 최근 해양 picocyanobacterium Prochlorococcus이미징 기술. Photobleaching, 후 Prochlorococcus 의 autofluorescence는 효과적으로 감소 그 폭풍 ~ 10의 측면 분해능으로 수행할 수 있도록 nm. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 FtsZ 단백질의 조직에 vivo에서 3 차원 (3 차원)을 취득 하 고 Prochlorococcus의 세포 주기 동안 4 개의 다른 FtsZ 반지 형태학 특성. 우리는 여기에 설명 하는 방법 다른 광합성 유기 체의 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 채택 될 수도 있습니다.

폭풍 확률론 개별 photoswitchable fluorophores를 활성화 하 여 슈퍼 해상도 이미지를 달성 한다. 각 fluorophore의 위치를 기록 하 고 슈퍼 해상도 이미지 다음이 위치4에 따라 만들어집니다. 따라서, fluorophore 위치 정밀도 슈퍼 해상도 이미지 재건을 위해 중요 하다. 447 Prochlorococcus 의 흡수 스펙트럼 피크 및 680 nm,그리고 Prochlorococcus는 최소 흡수 700 nm16위 파장에. 그러나, Prochlorococcus MED4 세포는 여전히 높은 autofluorescence 750 nm 레이저 (그림 3A), 폭풍 영상 필요의 매우 높은 농도에 노출 될 경우 발생 합니다. 따라서, 높은 autofluoresce...

여기 우리는 박테리아의 autofluorescence를 줄이기 위해 photobleaching 메서드를 설명 합니다. Photobleaching, 후 확률적 광학 재건 현미경 cyanobacterial FtsZ 반지의 3 차원 슈퍼 해상도 이미지를 얻을 하는 데 사용 됩니다.

Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

이 방법은 단백질 국소화와 광합성 유기체의 역학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 광표백 방법과 초해상도 현미경을 결합하여 광합성 유기체의 단백질 역학을 놀라운 세부 사항으로 감지할 수 있습니다. 이 방법은 프로클로로코커스의 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.그것은 또한 무선 재 도프 노래 및 박테리오 클로로소필을 포함하는 많은 다른 유기체에 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 얀신 리우 (Yanxin Liu)가 될 것입니다. 우선, 배양 플라스크에 바닷물 기반 의 Pro99 배지 의 5 밀리리터를 추가하고 프로 클로로 코커스 MED4의 1 밀리리터로 접종.평방 미터당 35 마이크로몰 광자의 강도와 빛 아래 섭씨 23도에서 프로 클로로 코커스를 성장. 5 일 후, 1.5 밀리 리터 튜브에 문화의 1 밀리 리터를 수집합니다. 문화를 고치기 위해 새로 준비된 포름알데히드 100마이크로리터를 튜브에 추가합니다.실온에서 20분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 그런 다음 1 분 동안 13, 500 회 G에서 샘플을 회전시합니다. Pro99 배지의 100 마이크로리터에서 상체를 제거하고 세포를 다시 분리합니다.면역 염색을 수행 할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 첫째, 폴리스티렌 구슬의 유리병을 소용돌이. 50%에탄올을 사용하여 1대 20, 000 희석을 작동 슬러리로 준비합니다.핫플레이트를 켜고 온도를 섭씨 120도로 설정합니다. 다음으로 커버립을 핫 플레이트에 놓습니다. 작업 슬러리 100 마이크로리터를 각 커버슬립에 적재하고 핫플레이트의 커버립을 10분 동안 배양합니다.그런 다음 커버립을 페트리 접시비드 사이드위로 조심스럽게 옮겨 실온에서 보관합니다. 커버립을 코팅할 준비가 되면 하나를 검색하여 구단 쪽위로 위로 올라섭도록 합니다. 밀리리터 폴리-L-리신 용액 1밀리그램 100마이크로리터를 커버슬립 중앙에 넣고 30분 동안 실온에 앉게 합니다.그런 다음 파이펫을 사용하여 부착되지 않은 폴리 L-리신을 조심스럽게 흡인하고 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 이 폴리 L-리신을 섭씨 4도에 저장하여 나중에 사용할 수 있습니다. 60mm 페트리 접시에 울트라 여과된 물 10밀리리터로 커버슬립을 헹구고 종이 타월로 짧게 건조시다.코팅 된 커버 슬립을 바닥에 파라 필름과 함께 새로운 페트리 접시로 옮기면 염색 요리로 사용됩니다. 고정 된 샘플의 100 마이크로 리터를 커버 슬립에로드하고 세포 부착을 허용하기 위해 30 분 동안 앉아있게하십시오. 다음으로, 종이 타월을 사용하여 남은 용액을 흡수한 다음 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣고 세탁합니다.커버슬립을 세척하기 위해 PBS 버퍼 1밀리리터를 웰에 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 신선한 PBS의 밀리리터 를 추가하여 커버슬립을 두 번째로 씻어낸다. 파이펫을 사용하여 PBS를 제거하고 새로 준비된 충류 버퍼 1밀리리터로 교체하십시오.20분 동안 섭씨 37도에서 세탁접시를 배양합니다. 그런 다음 투과화 버퍼를 제거합니다. 신선한 PBS 버퍼의 1 밀리리터를 추가하여 세척 과정을 시작합니다.세척 접시를 셰이커에 놓고 5분간 부드럽게 접시를 어기십시오. 그 후 PBS를 제거하고 세번 세척 과정을 반복합니다. 세척된 커버슬립을 염색 접시에 옮기습니다.커버슬립 상단에 블로킹 버퍼 50마이크로리터를 추가합니다. 전체 염색 접시를 얼음 위에 놓고 크세논 광원 아래에 이동하여 최소 60분 동안 광표백을 합니다. 표백 및 차단 후 종이 타월 가장자리를 사용하여 차단 버퍼를 제거합니다.첫째, 안티 FtsZ 항체의 마이크로리터 1개를 블로킹 버퍼의 99 마이크로리터로 희석시. 희석된 1차 항체 50마이크로리터를 커버슬립에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 커버슬립을 세탁접시의 우물로 옮기.세척을 시작하려면 PBS 의 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 세척 접시를 셰이커에 옮기고 부드럽게 5 분간 흔들어 줍니다. PBS를 제거하고 전체 세척 과정을 세 번 반복합니다.다음으로, 커버슬립을 염색 접시에 옮기습니다. 희석된 이차 항체의 50마이크로리터를 커버슬립에 놓고 어둡고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 커버슬립을 세탁접시로 다시 옮기습니다.세척을 시작하려면 PBS 의 1 밀리리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 세척 접시를 감싸서 빛으로부터 보호합니다. 접시를 셰이커로 옮기고 부드럽게 흔들어 5분간 흔들어 줍니다.PBS를 제거하고 전체 세척 과정을 세 번 반복합니다. STORM 이미징 바로 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미징 버퍼 1밀리리터를 준비합니다. 커버슬립을 로딩 챔버에 로드합니다.새로 준비된 이미징 버퍼를 추가하여 시아노균 세포를 씻어내지 않도록 부드럽게 합니다. 그런 다음, 공기 중의 산소와 반응하지 않도록 이미징 버퍼 위에 직사각형 커버슬립을 놓습니다. 카메라, LED 라이트 및 레이저를 켜고 STORM 소프트웨어를 엽니다.렌즈 위에 반 방울의 침지 오일을 넣습니다. 챔버를 로드하여 객관적인 렌즈가 커버슬립과 접촉하고 있는지 확인합니다. 그리고 750 나노미터 레이저로 신호를 검사한다.셀과 수탁 마커를 모두 포함하는 샘플 영역을 식별합니다. 그런 다음 샘플 드리프트 보정을 위한 소프트웨어를 시작합니다. 카메라 전자 곱셈 이득이 300밀리초, 노출 시간 30밀리초로 한 개의 와이드 포동 된 이미지를 참조로 획득하십시오.750나노미터 의 흥분 레이저 강도를 평방 센티미터당 약 4.5km로 늘립니다. 형광이 희소한 깜박임 패턴으로 전환되면 33 hertz에서 10, 000 프레임을 수집하여 하나의 슈퍼 해상도 이미지를 얻습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원시 데이터에서 초해상도 이미지를 재구성합니다.이 연구에서 STORM은 개별 사진 전환 형광을 관적으로 활성화하여 초해상도 이미징을 달성하는 데 사용됩니다. 모든 불소의 위치가 기록되고 이러한 위치를 기반으로 초해상도 이미지가 구성됩니다. 프로클로로 코커스의 흡수 스펙트럼은 447 및 680 나노미터에서 피크하고 700 나노미터 이상의 최소 흡수를 가지고 있지만, Prochlorococcus MED4 세포는 여전히 STORM 이미징에 필요한 750 나노미터 레이저의 매우 높은 강도에 노출되면 높은 자동 불발성을 방출합니다.여기에 설명된 포토표백 방법을 30분 동안 사용한 후, 자가형광을 가진 여러 세포가 여전히 검출되더라도 세포의 자동 형광은 감소하는 것으로 보입니다. 광표백을 60분으로 연장하면 대부분의 세포가 자가 불화를 잃게 됩니다. 이러한 결과는 개발된 광표백 방법이 광합성 유기체의 자동 형광을 크게 감소시킬 수 있음을 나타낸다.포토표백 후 STORM은 세포 분열 단백질인 FtsZ를 세포에서 시각화하는 데 사용됩니다. STORM을 사용하여 FtsZ 링의 상세한 형태가 드러난다. 3D STORM 이미지를 회전하여 4가지 유형의 형태학, 클러스터, 불완전한 링, 완전한 링 및 이중 링이 확인되었습니다.광표백의 빛 강도와 지속 시간이 다른 유기체에 대해 다를 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 방법은 단백질 조직과 광합성 세포에서의 잠재적 기능을 자세히 연구하고자 하는 연구자들을 위한 길을 열어줍니다.

photobleaching-enables-super-resolution-imaging-ftsz-ring

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Weber, N. et. al., 필라멘트 시아노박테리움 포르미디움 라쿠나의 자연 변형, 단백질 발현 및 냉동 보존. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 사상체 시아노박테리아의 광주성을 연구하기 위한 집중된 LED 기반 분석을 보여줍니다. 박테리아는 광원을 향해 이동하여 조명 중심에 조밀한 축적물을 형성하며, 이는 캡처된 이미지의 픽셀 강도 분석을 통해 시각화되고 정량화됩니다.

집중광 조명을 이용한 사상체 시아노박테리아의 광주성 분석

출처: 잔, Y. 외 광표백은 시 아노박테리아 프로클로로코커스의 FtsZ 고리의 초해상도 이미징을 가능하게 합니다. J . Vis. Exp. (2018).이 영상은 저온 환경에서 제논 빛을 이용해 남세균 세포에서 광표백하는 과정을 시연하여 성장 조절 단백질의 형광 이미징을 개선합니다.

성장 조절 단백질 영상을 위한 시아노박테리아 색소 광표백

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

본 프로토콜은 스펙트럼 분석을 기반으로 홍조류의 phycobiliprotein 변화의 단계별 자가형광 이미징 및 평가를 설명합니다. 이것은 실험실 조건에서 희소한 물질만 사용할 수 있고 세포가 천천히 성장하거나 전혀 성장하지 않는 극한 서식지에 대한 세포 적응을 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴 방법입니다.

홍조류 생리학을 평가하기 위한 자가형광 이미징

우리는 XY 평면에서 필라멘트 시아노박테리아 시각화를 위한 간단하고 접근 가능한 방법을 제시합니다. 저융점 아가로스 매트릭스가 사용되어 수직 방향에서 분열에 관여하는 단백질의 이미지를 획득할 수 있었습니다. 따라서 이 방법론은 모든 필라멘트 유기체와 다양한 종류의 단백질에 적용할 수 있습니다.

필라멘트 시아노박테리아의 타임랩스 현미경 분석을 위한 수직 고정화 방법

이 논문은 Proteus mirabilis 생물막을 위해 특별히 설계된 확장 현미경 기술인 PmbExM에 대한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. PmbExM은 생물막 샘플의 단계적 효소 처리를 활용하여 등방성, 4.3배 팽창을 달성함으로써 이러한 고착 미생물 군집 내 세포 및 세포 내 구조의 공간 조직에 대한 초해상도 분석을 가능하게 합니다.

확장 현미경 검사법에 의한 Proteus mirabilis 생물막의 초고해상도 이미징

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

배우세요 광표백 기법과 확률적 광학 재구성 현미경을 결합하여 Prochlorococcus의 FtsZ 단백질 링을 초고해상도로 시각화하는 방법을. 이 기술은 광합성 생물의 단백질 역학 연구에 활용됩니다.

Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능

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