흡수 성 Microbiopsy 샘플링 및 최소 침 습, 동시 혈액 및 피부 분석을 위한 RNA 추출

이 방법은 피부 질환에 대한 바이오 마커의 설립을 용이하게하고 또한 임상 연구 참가자의 위험을 줄일 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 집중적인 훈련이 필요하지 않으며 흉터를 남기지 않는다는 것입니다. 미생물이 발생하기 5분 전에 는 5분 동안 마른 얼음에 빈 2밀리리터 원심분리기 튜브를 놓습니다.

일회용 장갑을 착용하고 70%에탄올로 손과 도구를 분사한 후 피사체에 있는 적용 부위를 알코올 닦아로 소독합니다. 마이크로니들을 건드리지 않고 살균 된 감마 방사선 패키지에서 마이크로 생검을 제거하고 클릭이 들리고 플런저가 제자리에 잠길 때까지 플런저를 당깁니다. 샘플링할 피부에 대략 수직 각도로 적재된 장치를 조준하여 샘플링 부위가 고정된 위치에 있다는 것을 주의하고 장치를 최소 1킬로그램의 힘 내에서 피부에 적용합니다.

그런 다음 트리거를 누르고 장치를 10초 이상 제자리에 고정합니다. 장치가 10 초 전에 풀어 놓인 경우에, 혈액 흡수에 있는 변이의 더 높은 기회 및 또한 후속 분석이 있습니다. 시료가 흡수되면 플런저와 흡수성 마이크로니를 케이스에서 부드럽게 당기고 멸균 포셉을 사용하여 마이크로니들의 두 구멍을 당겨 플런저에서 제거합니다.

50 마이크로리터의 추출 버퍼를 드라이 아이스의 튜브에 추가하고 손상되지 않은 마이크로니들을 튜브에 넣고 드라이 아이스 니들 측에 놓습니다. 제거 과정에서 마이크로니들 끝이 아무것도 닿지 않도록 주의하십시오. 마이크로니들 팁에서 일부 샘플링 된 재료를 수집하고 42섭씨에서 30 분 동안 열 블록 이나 수조에서 튜브를 배양하기 위해 튜브를 3 ~ 5 초 동안 소용돌이.

인큐베이션의 끝에서, 멸균 집게를 사용하여 마이크로퓨지 튜브의 상단 가장자리와 마이크로니들 수준의 백 엔드를 배치하고 마이크로니들 상단이 캡과 튜브 사이에 제자리에 유지되는 튜브의 뚜껑을 닫습니다. 원심분리기 튜브는 장치의 흡수층으로부터 샘플링된 물질을 수집하고 집게를 사용하여 팁을 버퍼 용액에 다시 담그지 않고 마이크로니를 조심스럽게 제거합니다. 샘플을 다시 원심 분리하고 서퍼러를 새로운 미세 원심분리기 튜브로 조심스럽게 이송합니다.

다음으로 250마이크로리터의 컨디셔닝 버퍼를 실온에서 5분간 배양하기 위해 정화 열 필터 멤브레인에 추가하고 원심분리로 버퍼를 희석시킵니다. 추출된 RNA 샘플에 70%에탄올50마이크로리터를 넣고 부드러운 혼합을 하고 혼합물을 사전 처리된 정제 열로 옮킨다. 즉시 튜브를 두 번 원심 분리하여 흐름을 제거하고 100 마이크로리터의 세척 버퍼 1개로 세척합니다.

DNA 소화의 경우, 갓 준비된 DNA 인큐베이션 믹스 40마이크로리터를 실온에서 15분 간 잠복한 다음 40마이크로리터의 워시 버퍼 1개를 세척합니다. 원심분리가 끝나면 100마이크로리터의 워시 버퍼 2로 컬럼을 세척하고 잔류 세척 버퍼에 대한 정화 열을 확인합니다. 정제 컬럼을 RNA 추출 키트에 제공된 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 파이펫 끝을 정제 컬럼의 멤브레인에 직접 배치하여 RNA sPRE 물 11마이크로리터를 컬럼에 첨가한다.

실온에서 2분 간 배양한 후, 컬럼을 원심분리하여 기둥 전체에 RNA sPRE 물을 분배하고, RNA를 한 번 분리한다. 그런 다음 cDNA 합성이 즉시 수행되지 않으면 총 RNA 샘플을 영하 80도에서 저장합니다. 흡수성 미생물 미생물은 피부와 혈액의 동시 샘플링을 위해 흡수층을 가진 강철 판의 두 층으로 구성됩니다.

흡수성 미생물의 사용은 48 시간 후에 눈에 띄지 않는 사소한 홍반을 유도합니다. 펑크 후, 피부의 몇 가지 작은 조각은 마이크로 니들 끝 근처에 캡처하고 혈액은 필터 종이에 흡수된다. 흡수성 마이크로니들은 펑크 직후 제거되면, 시료 부피 및 추출된 mRNA의 후속 양은 천개 후 10초 동안 유지한 후 얻은 것보다 현저히 낮습니다.

양적 PCR 분석에 의해 흡수성 미생물및 그 이전 피부 미생물을 사용한 후 피부 마커 발현의 유사한 수준이 검출된다. 그러나 흡수성 미생물 샘플링 후 백혈구 바이오 마커 발현이 현저히 높은 수준으로 검출되며, 흡수성 미생물체가 피부 미생물과 동일한 용량의 피부 샘플 캡처를 위해 동일한 용량을 유지하면서 혈액 수집에 더 잘 수행된다는 것을 시사합니다. 따라서 기술을 적용하는 동안 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 장치를 적용하는 것이 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 이 절차에 따라 실시간 PCR과 같은 다른 방법은 상대적으로 유전자 발현 프로파일링을 위해 따를 수 있습니다. 우리는 아직도 장치를 개발하고 있더라도, 우리는 기술이 단지 너무 간단하고 최소 침략이기 때문에 피부과 화장품 또는 소아 응용을 위해 샘플링을 수행하기위한 임상 연구를위한 길을 열었다고 확신합니다.