Name: 흡수 성 Microbiopsy 샘플링 및 최소 침 습, 동시 혈액 및 피부 분석을 위한 RNA 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 배우세요 흡수성 마이크로바이옵시 기법으로 최소 침습적 피부 및 혈액 동시 샘플링과 RNA 추출 방법을 익히세요. 이 기술은 피부 질환 바이오마커 발굴에 활용되며 임상 연구 참여자의 안전성을 높입니다.

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우리는 NHMRC 동호회 APP1109749 및 APP1111216, 퀸즐랜드의 대학 센테니얼 장학금 및 국제 대학원 연구 장학금을 인정 하 고 싶습니다.

연구는 지하철 남쪽 인간 연구 윤리 위원회 및 대학의 퀸즐랜드 인간의 연구 윤리 위원회 (HREC-13-QPAH-551 및 UQ2013001551) 및 대학의 사우스 오스트레일리아 인간의 윤리 위원회 (200607)에 의해 승인 되었다.
1. 흡수 성 Microbiopsy 제조
<ol><li>레이저 각각 50 µ m 의료 학년 스테인레스 스틸 시트 및 흡수 성 레이어 (지), 미세 바늘 부분을 잘라 (그림 1). 참고: 플런저와 소자의 경우를 포함 하 여 다른 부분 3D 인쇄와 같은 급속 한-프로토 타입 기술로 조작 됩니다.</li>
	<li>공기 건조 30 분 후와 5 분 동안 70% 에탄올 (EtOH)에서 흡수 성 레이어를 제외한 모든 부분을 담근 다.</li>
	<li>(그림 1a) 중간에 흡수 층으로 3 층 미세 바늘을 조립.</li>
	<li>플런저의 슬릿에 조립된 미세 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>봄에 넣고 경우 (그림 1c)에 플런저를 삽입. 바늘 질을 보장 하기 위해 조립 절차에 만지기 microneedle을 하지 마십시오.</li>
	<li>사용 하기 전에 γ 방사선 살 균에 대 한 패키지 조립된 흡수 성 microbiopsy 인감.</li>
</ol>2입니다. 흡수 성 Microbiopsy 샘플링
<ol><li>일회용 장갑, 그리고 스프레이 손과 도구를 70%로 겸 등 착용 EtOH.</li>
	<li>알코올 닦아 응용 프로그램 사이트를 청소.</li>
	<li>과정에서 미세 바늘을 건드리지 않고는 γ 방사선 멸 균 패키지에 microbiopsy를 제거 합니다.</li>
	<li>때까지 '클릭' 소리 봄, 플런저 자물쇠 장소에 압축을 플런저를 당겨 장치를 로드 합니다.</li>
	<li>샘플링 영역 고정된 위치에 되도록 샘플 수를 피부에 장치를 목표로 합니다.</li>
	<li>장치는 피부에 수직으로 약 인지 확인 다음 피부에 장치에 힘의 ≥1 kg을 적용 합니다. 참고: 아래쪽 피부에 힘을 적용 해야는 미세 바늘의 충분 한 침투를 보장 합니다.</li>
	<li>방 아 쇠를 누르고 장치 최소 10 자리에 흡수 될 혈액 샘플에 대 한 s. 참고: 장치 10 전에 해제 되 면 s, 캡처한 적은 샘플입니다.</li>
</ol>3. RNA 추출
참고: RNA 추출 절차는 microbiopsied 샘플에서 RNA의 최적의 절연에 대 한 제조 업체의 프로토콜에서 수정 되었다. 달리 명시 되지 않는 한 모든 시 약 및 RNA 추출에 사용 되는 열 키트에 포함 되어 있습니다.
<ol><li>당겨 플런저 및 흡수 성 미세 바늘 케이스에서 밖으로 손을 부드럽게. 제거 하는 동안에 미세 바늘의 팁 아무것도 접촉으로 제공 되지 않습니다 확인 하십시오.</li>
	<li>플런저에서 흡수 성 미세 바늘을 제거 합니다. 소독 집게의 쌍은 미세 바늘에 두 개의 구멍에 누른 그것을 꺼내.</li>
	<li>2 mL microcentrifuge 튜브에 그대로 미세 바늘을 넣어 (RNA 격리 키트;에서 재료의 표참조) 하단 쪽으로 바늘 면 추출 버퍼의 50 µ L로 prefilled. 샘플 손실을 최소화 하기 위해 샘플을 처리 하기 전에 5 분 동안 드라이 아이스에 튜브를 둡니다.</li>
	<li>소용돌이 짧게 (3-5 s) 끝에서 샘플된 자료의 일부를 제거 하.</li>
	<li>42 ° c.에 30 분 동안 로커에 튜브에서 미세 바늘을 품 어 참고: 버퍼 솔루션 흡수 됩니다 흡수 층으로 즉시.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 2 mL microfuge 관의 위쪽 가장자리와 미세 바늘 (바늘에서 반대 측) 레벨의 상단 부분을 배치 합니다.</li>
	<li>미세 바늘의 상단 캡과 튜브 사이에 개최 되는 튜브의 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>튜브 또는 최대 속도 30 g x 16, 000에서 스핀 소자의 흡수 층에서 샘플된 자료를 제거 하는 s.</li>
	<li>제거는 microneedle 신중 하 게 집게로 다시 버퍼 솔루션에 담 그 기 없이. 튜브를 유지 하 고는 미세 바늘을 삭제.</li>
	<li>원심에서 3000 x g 2 분 피 펫에 대 한 샘플 신중 하 게 새로운 microcentrifuge 관으로 추출 된 RNA를 포함 하는 상쾌한.</li>
	<li>정화 열 필터 멤브레인에 컨디셔닝 버퍼의 250 µ L을 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>열 g x 16, 000 또는 1 분에 최대 속도로 컬렉션 튜브에 원심</li>
	<li>70%의 50 µ L 추가 EtOH 단계 3.9에서 수집 된 샘플으로. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.</li>
	<li>Preconditioned 정화 열에 혼합물 (~ 100 µ L)를 전송 합니다.</li>
	<li>30 16000 x g에서 원심 분리 뒤 즉시, 100 x g에서 2 분 동안 원심 분리기 통해 흐름을 제거 하는 s.</li>
	<li>8000 x g에서 정화 열과 1 분 동안 원심 분리기에 워시 버퍼 1 (W1) 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>나 별도 microcentrifuge에 버퍼 RDD의 35 µ L 재고 솔루션 각 샘플에 대 한 튜브 DNase의 5 µ L을 추가 하 여 DNase 솔루션을 준비 합니다. 부드럽게 반전에 의해 혼합. 참고: DNase 치료 않고 수행 될 정화 열에 PCR 접시에 나중에, 샘플의 수량 때문에 것입니다.</li>
	<li>정화 열 막에 직접 DNase 인큐베이션 믹스의 40 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>정화 열 막으로 W1의 40 µ L를 추가 합니다. 15 8000 x g에서 원심 분리기 s.</li>
	<li>DNase 치료 후 8000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기 정화 열에 워시 버퍼 2 (W2) 100 µ L를 플라스틱.</li>
	<li>정화 열에 W2의 또 다른 100 µ L을 추가 하 고 16000 x g. 확인 모든 잔여 워시 버퍼에 대 한 정화 열에서 2 분 동안 원심. 어떤 워시 버퍼가 남아 있으면 다시 1 분 동안 16000 x g에서 원심.</li>
	<li>키트에 제공 된 새로운 0.5 mL microcentrifuge 관을 정화 열을 전송.</li>
	<li>RNase 무료 물 (RNA 격리 키트에 제공 되지 않음), 차입 버퍼 (EB) 대신 정화 열의 막에 직접 11 µ L 플라스틱 부드럽게 RNase 무료 물 막으로 RNase 무료 물의 최대 흡수 되도록 분배 하는 동안 막의 표면에 피 펫의 끝을 터치 합니다. 2 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>1000 x g 열에서 RNase 무료 물 배포 다음 16000 x g elute RNA를 1 분에 대 한 원심에 1 분 동안 열 원심 참고: RNA 정량화는 샘플의 작은 수량으로 인해 권장 하지 않습니다.</li>
	<li>중지 포인트 #1: cDNA 합성 즉시 수행 되지 않은 경우-80 ° C에서 총 RNA 샘플을 저장. 참고:는 RNA 샘플의 낮은 농도 주어진 경우 필요 하지 않은 고정 하지 마십시오.</li>
</ol>4입니다. cDNA 합성
<ol><li>(단계 3.25)에서 얼음에 냉동된 샘플 녹여</li>
	<li>다음 절차에 따라 cDNA 합성 키트 총 RNA 로부터 cDNA를 음성 합성.</li>
	<li>반응 혼합 준비: 총 RNA, TransAmp 버퍼, 역전사의 1 µ L, DNase/RNase 무료 물 4 µ L x 5의 4 µ L의 11 µ L. 부드럽게 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>열 cycler 기구에 반전 녹음 방송 실행: 10 분, 15 분 동안 42 ° C 25 ° C에서 85 ° C 5 분 최종 역전사 비활성화 단계 뒤.</li>
	<li>중지 포인트 #2:-80 ° C에서 역방향 베낀된 샘플 사용까지 저장.</li>
</ol>5. 정량 반응 및 데이터 분석
참고: 정량 Pcr 반응 위한 뇌관 intron 경계 NCBI 뇌관 폭발 (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용 하 여 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위해 되도록 설계 되었습니다. 이 연구에 사용 된 참조 유전자는 RPLP0 (에 대 한 자세한 토론 섹션 참조).
<ol><li>(단계 4.5)에서 얼음에 냉동된 샘플 녹여</li>
	<li>아래 절차에 따라 정량 마스터 믹스 키트와 함께 정량 Pcr을 수행 합니다.</li>
	<li>반응 당 다음을 포함 하는 마스터 믹스 준비: 2 x qPCR 반응 혼합, 10 µ M 앞으로 뇌관, 10 µ M 역 뇌관의 0.4 µ L, 2.2 µ L DNase 무료 물 0.4 µ L의 5 µ L. 부드럽게 pipetting으로 혼합. Triplicates에서 예제를 설정 합니다.</li>
	<li>384-잘 PCR 플레이트 첫번째와 2 µ L 각 샘플 (잘 당 10 µ L의 총)에서 cDNA의의 각 음에 마스터 믹스의 8 µ L 플라스틱 참고: 서식 파일 제어 (NTC)와 역전사 제어 (-RT) 부정적인 컨트롤로 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>접착 필름, 접시를 봉인 하 고 짧게 원심.</li>
	<li>증폭 반응 실시간 열 cycler에 실행: 5 95 ° C의 40 주기 다음 2 분 (중 합 효소 활성화), 95 ° C s (변성), 10 60 ° C (열 처리) s와 10 위한 72 ° C s (확장).</li>
	<li>알려진된 농도와 템플릿에서 준비 표준 곡선에서 보간에 의해 샘플의 RNA 농도 계산 합니다.<ol>
<li>소프트웨어에는 새 실험 을 만듭니다.</li>
		<li>정 및 기준을 설정 직렬 희석 번호판에 대 한 설정을 클릭 합니다.</li>
		<li>선택 하 고 표준 및 샘플에 대 한 우물을 정렬. 적용을 클릭 합니다.</li>
		<li>표준 곡선을 평가 하기 위해 결과 탭에서 분석 을 클릭 합니다. 기울기, R2 값을 확인 하, 증폭 효율과 오류 실험 기준을 충족.</li>
		<li>Ct 값에 따라 표준 곡선에 시각적으로 알 수 없는 샘플의 수량을 확인 합니다. 참고: 표준 곡선, 희석 비율의 선택 등의 건설 게시 프로토콜11,,1213에 따라 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Ct refence 유전자 정규화) ΔCt 메서드를 사용 하 여 유전자의 mRNA 표정 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>ΔCt 값을 가져오는 참조 유전자의 Ct 값에서 대상 유전자의 Ct 값을 뺍니다.</li>
		<li>기술 복제의 ΔCt 값을 평균입니다.</li>
		<li>플롯 및 통계 소프트웨어11,14 유전자 발현 분석 ( 재료의 표참조). 참고: 또는 유전자 표정 분석 게시 프로토콜13에 따라 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

이 결과 분자 특성에 대 한 피부와 혈액 혼합물의 간단 하 고 최소한 침략 적 샘플링에 대 한 흡수 성 microbiopsy 도구로 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 프로토콜에 따라 장치 응용 프로그램은 다른 응용 프로그램 프로토콜 (그림 3)를 사용 하 여 복구할 RNA 금액에 차이 의해와 같이 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 필수적. 샘플 추출 되 면 RNA 추출에 대 한 단계를 처리 하는 다음 샘플은 설립된 프로토콜15,16와 매우 비슷합니다. 게다가 초기 단계에서 RNA 추출 흡수 성 microbiopsy에 대 한 수정, 또 다른 주요 변화 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 결과 개선 하기 위해 RNase 무료 물의 사용 이다. 또한,이 연구에 사용 된 참조 유전자 RPLP0는 언급 가치가 있다.입니다. RPLP0, 그 함수는 다른 세포와 조직 유형17, 비 흑색 종 피부 암 및 전 암 병 변18에 사용 하기 위해 적합 한 참조 유전자로 보고 되었습니다.
소자의 주요 한계 중 하나는 시간이 많이 걸리는 이며 잠재적으로 샘플 손실, 특히 RNA 같은 민감한 샘플의 기회를 증가 장치에서 microbiopsy의 제거 이다. 그럼에도 불구 하 고, 문제는 미리 2 mL microcentrifuge 튜브 드라이 아이스 등 모든 살 균 처리 도구, 냉각에 의해 극복할 수 있습니다.
흡수 성 microbiopsy 사용 하 여 간단 하 고 집중적인 훈련을 필요로 하지 않습니다. 기존의 생 microbiopsy 허용 설립된 분자 진단 기법, 실시간 정량 Pcr 등 분자 특성으로 필요 하지 않습니다. 추가 계량 하 고 흡수 성 microbiopsy의 샘플링 능력, 인간의 피부 조직에서 RNA 추출 관련 이전 문학 조사 했다. 3 연구 50에서 200에 배열 했다 추출 된 RNA 금액 보고, 전형적인 3.0 또는 4.0 m m 스킨에서 펀치 생 검 피부 조직19,,2021밀리 그램 당 ng. 비교는 1.43 평균 (그림 3), 샘플된 피부 조직의 무게에 흡수 성 microbiopsy에서 복구 된 RNA의 ng 0.29-115에서 범위 것으로 예상 된다 µ g 피부 펀치 생 검 연구에서 동일한 RNA 조직의 비율에 따라.
이 프로토콜은 아니다 잠재적인 함정 없이 문제 들을 쉽게 극복 될 수 있다. 예를 들어 RNA 추출 데이터 10의 보유 시간 (그림 3)와 상당한 변이 제안 했다. 문제를 해결 하려면 하나의 잠재적인 솔루션 응용 프로그램 프로토콜 최적화 포함 됩니다. 힘 등 피부에 적용 하 고 시간 잡고 해야 테스트 하 고 샘플 추출에 변화를 줄이기 위해 최적화. 다른 잠재적인 문제는 샘플 무결성 및 복구에 영향을 줄 수 있는 장치에서 microbiopsy의 제거. 비록 RNA 추출에 대 한 microbiopsy를 제거 하는 것은 효과적인 접근, 전체 절차는 지루한, 그리고 샘플 과정에서 오염에 노출 될 수 있습니다. 따라서, 샘플 처리 프로토콜의 수정 샘플 무결성 보장 및 샘플 손실을 방지 하기 위해 원하는 높은 이다.
위의 두 가지 문제 해결은 일단 장치 임상 연구를 위한 표준 도구가 될 것입니다 예상 된다. 장치는 동시에 피부와 혈액 샘플을 캡처 및이 수 고려 한다 유전자 표현 데이터를 분석할 때 중요 하다. 결론적으로,이 프로토콜 결합 된 피부와 혈액 샘플링 및 상대 진 식 프로 파일링에 대 한 처리 이후 샘플에 대 한 간단 하 고 최소한 침략 적 도구로 흡수 성 microbiopsy을 수행의 세부 사항을 설명 합니다.

피부 생 검 후속 진단 histopathological 평가 통해 피부 질환 및 피부 샘플링에 대 한 피부과에서 가장 필수적인 기술 중 하나입니다. 생 검 기술은 블레이드 또는 펀치 생 검 검사1에 대 한 환자의 피부에 의심 스러운 병 변 제거를 사용 하 여 의료 전문가 포함 한다. 기술은 효과적 이다, 하지만 매우 침략 적 하 고 끝점은 일반적으로 분자 생물학 기법2,3관련 된 임상 연구를 제한 합니다. 피부 질환의 분자 분석은 histopathological 분석 수 없습니다, 따라서 촉진 약물 발견과 질병 진단4,5매우 특정 생물 학적 정보를 제공할 가능성이 있다. 게다가, 가장 분자 기법에서 샘플 수요는 비교적 작은 수 있습니다 동물 사용에서 감소로 이어질 고 많은 수의 복제를 허용. 따라서, 거기는 명확한 임상 연구에 분자 분석을 가능 하 게 하 고 참가자에 대 한 위험을 낮춘 다는 대체 기술에 대 한 필요.
필드에 이러한 필요를 해결 하기 위해 우리의 그룹 소설 microneedle 기반 진단 플랫폼, 흡수 성 microbiopsy, 피부 간단 하 고 최소 침 습 방식으로6에 피가 섞인의 작은 금액의 수집을 가능 하 게 개발 했다. 이 간행물의 목적은 임상 연구에서 RNA 추출 통해 분자 분석을 촉진 하는 샘플링 도구로 흡수 성 microbiopsy를 설명 하기 위해.
이전에, 우리는 microbiopsy, 피부 조직7의 작은 조각을 추출 하는 3 층 강판 디자인의 미세 바늘으로 구성 되어 피부 microbiopsy의 첫 번째 버전을 설명 했습니다. 이 소자의 참신 효율적인 조직 추출3허용 microneedle에서 여러 접점에서 온다. 반면, 원형 피부 펀치 생 검 단 하나의 접점을 제공 하 고 어떤 경우에 어떤 샘플을 캡처 없이 피부를 단순히 눈물. 피부 microbiopsy을 바탕으로, 우리 최근 흡수 성 microbiopsy 피와 피부 샘플링 기능을 개발 했다. 장치 최근 역학 연구6자원이 부족 한 지역에 사용 하기 위해 실현 되도록 표시 되었습니다.
그것의 간단한 설계, 흡수 성 microbiopsy 몇 초 이내에 수행할 수 있습니다 하 고 광범위 한 훈련을 필요로 하지 않습니다. 또한, 로컬 마 취가 필요 하지 않습니다, 그리고 응용 프로그램 사이트에 흉터가 발생 하지 않습니다. 현재 프로토콜 관련 샘플링 대상된 피부 분자 분석에 대 한 데이터를 얻기 위해 교육 없이 연구원 또는 의료 전문가 수 있습니다. 우리는 피부 연구에 루틴을 미래에 될 microsampling 장치를 기대 합니다.
Microbiopsy는 분자 진단 기술6,,89,10, 인간 유 두 종 바이러스 DNA 탐지,이 프로토콜에 관련 된 다른 피부 질환 연구에 보고 되어 샘플 추출 및 처리 기술을 흡수 성 microbiopsy에 대 한 세부 정보를 설명 하기 위해 처음이 이다. 또한, 이것은 피부 및 microbiopsy 샘플에서 혈액 세포의 상대 진 식 프로 파일링 설명 첫 번째 보고서 이다.

<table><tbody><tr><td>Absorbent microbiopsy fabrication and sampling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorbent Microbiopsy</td><td>Trajan Scientific and Medical N</td><td>/A</td><td>https://www.trajanscimed.com/</td></tr> <tr><td>Whatman Filter Paper, Grade 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001325</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNA extraction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA 분리 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>KIT0214</td> UltraPure DNase/RNase-Free 증류수 <td>프로토콜에 설명된 모든 완충액 용액 포함</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>10977015</td><td>RNA 용리 단계에서 RNA 품질 개선</td></tr><tr><td>2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브, Sterile</td><td>Thomas Scientific</td><td>1226S74</td><td>N/A</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td>N/A</td></tr><tr><td>cDNA 합성</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiFAST cDNA 합성 키트</td><td>Bioline</td><td>BIO-65053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>CFX96 터치 Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td>N/A</td></tr><tr><td>qPCR 반응 및 데이터 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR Lo-ROX 키트</td><td>Bioline</td><td>BIO-94005</td><td>qPCR 반응 단계에 설명된 시약 포함</td></tr><tr><td>: MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>, ThermoFisher Scinentific</td><td>4311971</td><td>N/A</td></tr>, <tr><td>MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate</td><td>, ThermoFisher Scinentific</td><td>4343370</td><td>N/A</td></tr>, <tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>, ThermoFisher Scinentific 4485694</td><td></td><td>N/A</td></tr>, <tr><td>GraphPad Prism (v6.04)</td><td>GraphPad</td><td>N/A; </td><td>qPCR 데이터 분석 단계</td></tr><tr><td>PCR 프라이머<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>RPLP0 F</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N/A</td><td>ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC</td></tr><tr><td>RPLP0 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N/A</td><td>CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG</td></tr><tr><td>TYR F</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N/ A</td><td>TCA GCA, CCA, CAC, AAA, TCC, TAA</td></tr><tr><td>TYR R</td>, <td>시그마 알드리치</td><td>해당 없음</td><td>AAT, CGG CTA CAG ACA ATC TGC</td></tr><tr><td>KRT14 F</td><td>시그마 알드리치</td><td>해당 없음</td><td>CCT CCT CCC AGT TCT CCT</td></tr><tr><td>KRT14 R</td><td>시그마 알드리치</td><td>해당 없음</td><td>ACA, CCA CCT TGC CAT CG</td></tr><<tr><td>em>CD3E F</td><td>시그마 알드리치</td><td>해당</td> <td>없음CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG</td></tr><tr><td>CD3E R</td><td>시그마 알드리치</td><td>해당 없음</td><td>GTT CTC CAG 집계 GTC AGA TG</td></tr><<tr><td>em>CD19 F</td><td>시그마 알드리치</td><td>해당 없음</td><td>TTC TGC CTG TGT TCC CTT G</td></tr><tr><td>CD19 R</td><td>시그마 알드리치</td><td>해당 없음</td><td>GGCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T</td></tr></tbody></table>

흡수 성 microbiopsy 샘플링 및 최소 침 습, 동시 혈액 및 피부 분석을 위한 rna 추출

Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

기존의 피부 생 검 임상 연구 관련 cosmetically 민감한 부분 또는 그것의 침입으로 인해 소아 응용 프로그램 제한 합니다. 여기, 우리 피부와 혈액 혼합물의 최소 침 습 샘플링에 대 한 흡수 성 미세 바늘 기반 장치, 흡수 성 microbiopsy를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 목표는 임상 연구, 임상 연구 참가자에 대 한 위험을 감소 하 고 피부 질환에 대 한 생체의 설립에에서 급속 한 진행을 촉진 하는 데 도움이. 기존의 피부 생 검 기술, 달리 흡수 성 microbiopsy 초 이내에 수행할 수 있습니다 그리고 그것의 간단한 설계 집중 훈련을 필요로 하지 않습니다. 이 보고서에서 우리는 흡수 성 microbiopsy, 로드 및 응용 프로그램, 자원 봉사자 등의 사용을 설명 합니다. 다음, 우리는 흡수 샘플에서 RNA를 분리 하는 방법을 보여 줍니다. 마지막으로, 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량) mRNA 식 수준 혈액 (CD3E 와 CD19)과 피부 (KRT14 및 TYR)의 척도 사용 하 여를 설명 합니다. 우리가 설명 하는 방법을 선반 장비 및 시 약을 사용 합니다. 이 프로토콜 피부와 같은 흡수 성 microbiopsy 매트릭스 내에서 혈액의 동시 샘플링에 대 한 최소한 침략 적 접근을 제안 한다. 우리는 인간의 윤리 위원회, 임상 및 자원 봉사자가 피부과 연구이 접근의 지지를 발견 했다.

우리는 이전 피부 microbiopsy의 미세 바늘 침투 피부 약 500 µ m 깊은7을 보고 있다. 피부 microbiopsy의 미세 바늘 디자인 흡수 성 microbiopsy (그림 2a)에 대 한 매우 비슷합니다. 피 흡수에 대 한 중간에 흡수 성 층 흡수 성 microbiopsy에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 피부 microbiopsy 피부 조직의 기계적 캡처에 대 한 채널을 포함. 흡수 성 레이어를 사용 하 여 또한 이끌어 냈다 microneedle 차원에서 약간의 차이 (흡수 성: 1.50 x 0.50 x 0.21 m m vs 피부: 1.50 x 0.50 x 0.15 m m).
그림 2b 흡수 후 응용 프로그램 사이트 5 분을 보여줍니다 및 피부 microbiopsies 남성 자원 봉사자의 volar 왼쪽된 팔에 적용 했다. 두 개의 microneedle 디자인 간의 유사성으로 인해 두 장치에서 응용 프로그램 사이트 비교, 작은 홍 반으로 했다. 두 응용 프로그램 사이트 뒤에 아무 흉터 왼쪽 48 h 후 눈에 띄는 되지 않았다. 이이 최소한 침략 적 장치는 여러 응용 프로그램 사이트를 화면 하거나 정기적으로 수행 하는 가설을 지원 합니다.
그림 2 c 자원 봉사 남자의 volar 팔에 적용 되 고 후 흡수 microbiopsy의 흡수 성 층의 대표적인 그림을 보여줍니다. 피부에 대 한 몇 가지 작은 조각, 미세 바늘의 팁 근처 캡처된 그림 같이 그리고 일부 혈액 필터 종이에 흡수 되었다. 이 장치는 피부에 침투 하 고 피부와 같은 흡수 성 microbiopsy 매트릭스 내에서 동시에 혈액 나타냅니다. 그림 2d 보여줍니다 후 샘플링 피부 microbiopsy, 비교를 위해 microbiopsy의 이전 세대. 피부 microbiopsy의 채널 캡처, 피부의 작은 조각을 하지만 미세 바늘에 혈액의 양을 흡수 성 microbiopsy에 상대적으로 작은. 두 응용 프로그램 사이트 48 h 내 눈에 띄는 되지 않았다. 실험에서 흡수 성 microbiopsy 10의 개최와 함께 적용 된 후 응용 프로그램, 피부 동안 microbiopsy 즉시 이후에 릴리스된 디자인 차이로 인해 적용.
그림 3a같이 흡수 microbiopsy의 2 개 그룹 응용 프로그램 프로토콜에 따라이 실험에 참여 했다: '속보'와 ' 10의 지주 '. '속보' 그룹에 대 한 장치는 장치 응용 프로그램 사이트에서 신청 후 즉시 제거 되 고 동일한 원래 피부 microbiopsy 프로토콜을 사용 하 여 적용 되었다. 10 ' s 지주에 대 한 ' 그룹, 장치에서에서 열렸다 장소 10에 대 한 응용 프로그램 후 샘플 컬렉션을 개선 하는 s. 흡수 성 microbiopsy의 2 개 그룹 응용 프로그램 접근 샘플 금액에 영향을 미칠 수 어떻게 보여 주기 위해 설치 되었다. 10의 처리 시간 응용 프로그램 시간 복구 샘플의 크기에 영향을 보여 임상적으로 적절 한 시간으로 선정 되었다.
RNA의 양이 되었고 '속보' 0.33 0.39 ± ng 1.43 ± 0.88 ng ' 10의 지주에 대 한 두 개의 흡수 성 microbiopsy 그룹에서 회복 ' (그림 3a, n = 20), 추가 처리 시간을 4-fold 증가 제안. 이 더 많은 RNA 추출 결과 10-s 보유 시간 흡수 장치 적용을 나타냅니다. 차이 흡수 성 레이어 (그림 3c)에서 증가 혈액 샘플의 존재 때문일 수 있습니다. 실제로, '속보' 그룹 (그림 3b) ' 10-s 지주에 비해 흡수 층으로 혈액의 비슷한 금액을 수집 하지 못했습니다 ' 그룹 (그림 3c). 그것은 대부분은 즉시 출시 microbiopsies 제안 하는 그들은 부정적인 이벤트 또는 RNA의 매우 낮은 금액을 표시 하는 x 축에 가까운 했다 주목 해야한다. 따라서, 결과 처리 시간 소자의 성능에 영향을 미칠 혈액 흡수 층에 의해 흡수 될 시간이 걸릴 수 있습니다으로 가설 검증.
장치는 혈액 및 피부 샘플링 설계 되었다, 이후 정량 비교를 위해 두 장치에 대 한 피부와 혈액 biomarkers의 식을 감지 하 사용 되었다. 우리 melanocytes와 keratinocytes 가능한 표 피에 대 한 biomarker로 KRT14 에 대 한 바이오 마커 tyrosinase, TYR, 사용. 피부 microbiopsy 샘플 비교 실험에 포함 됐다. 그림 4에 표시 된, 비록 피부와 흡수 성 microbiopsies는 디자인, 차이로 인해 다르게 적용 된 식 레벨 모두 피부 생체 TYR 와 KRT14 에 표시 된 대로 두 장치에 대 한 비교 했다는 데이터입니다. 흰색 혈액 세포 생체 (CD3E, T 세포와 CD19, B 세포) 피부 microbiopsy 예제에서 보다 흡수 성 microbiopsy 예제에서 더 널리 퍼진 것을 발견 했다. 이 결과 제안 흡수 성 microbiopsy 혈액 수집에 더 나은 수행 하지만 여전히 피부에 비해 피부 microbiopsy 캡처에 대 한 용량을 유지 (n = 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig1.jpg"> 그림 1입니다. 흡수 성 microbiopsy의 제조. (a) 3 층 미세 바늘입니다. (장치의 b) 모든 부분입니다. (c) 조립된 흡수 성 microbiopsy입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig2.jpg"> 그림 2입니다. 흡수 성 microbiopsy 남성 자원 봉사자의 volar 왼쪽된 팔에 흉터를 남기지 않고 동시에 피부와 혈액 샘플을 캡처할 수 있었다. (a) 흡수 성 및 피부 microbiopsies의 바늘 사이 비교. (b) 응용 프로그램 신청 후 흡수 성 및 피부 microbiopsies 5 분에 의해 왼쪽 사이트. (c, d) 신청 후 흡수 성 및 피부 microbiopsies의 바늘입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig3.jpg"> 그림 3입니다. 흡수 성 microbiopsy 캡처 더 많은 혈액과 10 미에 대 한 적용 될 때 RNA 샘플 (장치를 즉시 발표 보다 RNA의 다량 귀착되 었 다 a) 10-s 후 응용 프로그램 처리 시간 (n = 20). 오차 막대는 뜻에서 사 우 스 다코타를 나타내는 (* * *p&lt; 0.0001). (b의 c) '속보'와 ' 10의 지주 신청 후 흡수 microbiopsies의 대표 사진을 ' 접근. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig4.jpg"> 그림 4입니다. 피부와 흡수 성 microbiopsies 사이 mRNA 식 레벨의 비교 (n = 5). 유전자 발현 참조 유전자 RPLP0와 정규화 되었습니다 했다. 오차 막대는 뜻에서 사 우 스 다코타를 나타내는 (*p&lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 문서에서는, 흡수 성 microbiopsy 기술을 수행 하는 방법 및 어떻게 샘플에서에서 사용할 수 있습니다 피부와 혈액의 간단 하 고 동시 샘플링에 대 한 RNA 추출에 대 한 최소 침 습 방식으로 보여 줍니다.

흡수 성 Microbiopsy 샘플링 및 최소 침 습, 동시 혈액 및 피부 분석을 위한 RNA 추출

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

이 방법은 피부 질환에 대한 바이오 마커의 설립을 용이하게하고 또한 임상 연구 참가자의 위험을 줄일 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 집중적인 훈련이 필요하지 않으며 흉터를 남기지 않는다는 것입니다. 미생물이 발생하기 5분 전에 는 5분 동안 마른 얼음에 빈 2밀리리터 원심분리기 튜브를 놓습니다.일회용 장갑을 착용하고 70%에탄올로 손과 도구를 분사한 후 피사체에 있는 적용 부위를 알코올 닦아로 소독합니다. 마이크로니들을 건드리지 않고 살균 된 감마 방사선 패키지에서 마이크로 생검을 제거하고 클릭이 들리고 플런저가 제자리에 잠길 때까지 플런저를 당깁니다. 샘플링할 피부에 대략 수직 각도로 적재된 장치를 조준하여 샘플링 부위가 고정된 위치에 있다는 것을 주의하고 장치를 최소 1킬로그램의 힘 내에서 피부에 적용합니다.그런 다음 트리거를 누르고 장치를 10초 이상 제자리에 고정합니다. 장치가 10 초 전에 풀어 놓인 경우에, 혈액 흡수에 있는 변이의 더 높은 기회 및 또한 후속 분석이 있습니다. 시료가 흡수되면 플런저와 흡수성 마이크로니를 케이스에서 부드럽게 당기고 멸균 포셉을 사용하여 마이크로니들의 두 구멍을 당겨 플런저에서 제거합니다.50 마이크로리터의 추출 버퍼를 드라이 아이스의 튜브에 추가하고 손상되지 않은 마이크로니들을 튜브에 넣고 드라이 아이스 니들 측에 놓습니다. 제거 과정에서 마이크로니들 끝이 아무것도 닿지 않도록 주의하십시오. 마이크로니들 팁에서 일부 샘플링 된 재료를 수집하고 42섭씨에서 30 분 동안 열 블록 이나 수조에서 튜브를 배양하기 위해 튜브를 3 ~ 5 초 동안 소용돌이.인큐베이션의 끝에서, 멸균 집게를 사용하여 마이크로퓨지 튜브의 상단 가장자리와 마이크로니들 수준의 백 엔드를 배치하고 마이크로니들 상단이 캡과 튜브 사이에 제자리에 유지되는 튜브의 뚜껑을 닫습니다. 원심분리기 튜브는 장치의 흡수층으로부터 샘플링된 물질을 수집하고 집게를 사용하여 팁을 버퍼 용액에 다시 담그지 않고 마이크로니를 조심스럽게 제거합니다. 샘플을 다시 원심 분리하고 서퍼러를 새로운 미세 원심분리기 튜브로 조심스럽게 이송합니다.다음으로 250마이크로리터의 컨디셔닝 버퍼를 실온에서 5분간 배양하기 위해 정화 열 필터 멤브레인에 추가하고 원심분리로 버퍼를 희석시킵니다. 추출된 RNA 샘플에 70%에탄올50마이크로리터를 넣고 부드러운 혼합을 하고 혼합물을 사전 처리된 정제 열로 옮킨다. 즉시 튜브를 두 번 원심 분리하여 흐름을 제거하고 100 마이크로리터의 세척 버퍼 1개로 세척합니다.DNA 소화의 경우, 갓 준비된 DNA 인큐베이션 믹스 40마이크로리터를 실온에서 15분 간 잠복한 다음 40마이크로리터의 워시 버퍼 1개를 세척합니다. 원심분리가 끝나면 100마이크로리터의 워시 버퍼 2로 컬럼을 세척하고 잔류 세척 버퍼에 대한 정화 열을 확인합니다. 정제 컬럼을 RNA 추출 키트에 제공된 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 파이펫 끝을 정제 컬럼의 멤브레인에 직접 배치하여 RNA sPRE 물 11마이크로리터를 컬럼에 첨가한다.실온에서 2분 간 배양한 후, 컬럼을 원심분리하여 기둥 전체에 RNA sPRE 물을 분배하고, RNA를 한 번 분리한다. 그런 다음 cDNA 합성이 즉시 수행되지 않으면 총 RNA 샘플을 영하 80도에서 저장합니다. 흡수성 미생물 미생물은 피부와 혈액의 동시 샘플링을 위해 흡수층을 가진 강철 판의 두 층으로 구성됩니다.흡수성 미생물의 사용은 48 시간 후에 눈에 띄지 않는 사소한 홍반을 유도합니다. 펑크 후, 피부의 몇 가지 작은 조각은 마이크로 니들 끝 근처에 캡처하고 혈액은 필터 종이에 흡수된다. 흡수성 마이크로니들은 펑크 직후 제거되면, 시료 부피 및 추출된 mRNA의 후속 양은 천개 후 10초 동안 유지한 후 얻은 것보다 현저히 낮습니다.양적 PCR 분석에 의해 흡수성 미생물및 그 이전 피부 미생물을 사용한 후 피부 마커 발현의 유사한 수준이 검출된다. 그러나 흡수성 미생물 샘플링 후 백혈구 바이오 마커 발현이 현저히 높은 수준으로 검출되며, 흡수성 미생물체가 피부 미생물과 동일한 용량의 피부 샘플 캡처를 위해 동일한 용량을 유지하면서 혈액 수집에 더 잘 수행된다는 것을 시사합니다. 따라서 기술을 적용하는 동안 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 장치를 적용하는 것이 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.따라서 이 절차에 따라 실시간 PCR과 같은 다른 방법은 상대적으로 유전자 발현 프로파일링을 위해 따를 수 있습니다. 우리는 아직도 장치를 개발하고 있더라도, 우리는 기술이 단지 너무 간단하고 최소 침략이기 때문에 피부과 화장품 또는 소아 응용을 위해 샘플링을 수행하기위한 임상 연구를위한 길을 열었다고 확신합니다.

absorbent-microbiopsy-sampling-rna-extraction-for-minimally-invasive

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연구

JoVE Journal

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흡수 성 Microbiopsy 샘플링 및 최소 침 습, 동시 혈액 및 피부 분석을 위한 RNA 추출

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