Name: 전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 학습하세요 혈장 샘플에서 순환 miRNA 발현을 평가하는 방법을 통해 암 환자의 바이오마커를 분석하는 기술입니다. 이 방법은 최소한의 입력 재료로 24개 miRNA 패널을 신뢰성 있게 평가하여 치료 모니터링과 예후 예측에 활용할 수 있습니다.

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이 연구로 기존과 이탈리아 약 기관 (AIFA)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

참고: 모든 소독된 연기 후드 좋은 연구실 관행 (GLP)에 따라 다음 단계를 수행 합니다.
1. 플라즈마 수집 및 저장
<ol><li>3 mL K3E EDTA 튜브에 주변 혈액 샘플을 수집 합니다.</li>
	<li>1880 x g 15 분 동안에 실내 온도에 튜브 원심</li>
	<li>450 µ L의 aliquots에서 표면에 뜨는 플라즈마를 복구 합니다.</li>
	<li>사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 참고: 말 초 혈 관 컬렉션의 2 시간 안에 처리 합니다. 튜브에서 플라즈마를 복구할 때 림프 구 레이어를 방해 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 플라즈마 샘플 (자료 테이블)에서 miRNAs 순환의 추출
<ol><li>
모든 필요한 솔루션을 준비 하 고 녹여 추출 단계에 대 한 샘플.
	<ol>
<li>2 x denaturating 솔루션 2-mercaptoethanol의 375 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.</li>
		<li>추가 ACS 학년 100% 에탄올의 21 mL 미르 세척 솔루션에 어 믹스 잘 합니다.</li>
		<li>세척 솔루션 2/3를 ACS 학년 100% 에탄올 40 mL를 추가 하 고 잘 혼합.</li>
		<li>플라즈마 aliquot 실 온에서 해 동 하 여 다음 추출 단계를 시작 하실 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
유기 추출
	<ol>
<li>RNase 무료 2 mL 튜브에 플라즈마 샘플의 400 µ L를 전송 합니다.</li>
		<li>2 x denaturating 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 짧게 원심.</li>
		<li>1 nM 스파이크에서의 4 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 짧게 원심.</li>
		<li>산 페 놀-클로 프롬의 800 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>60 s를 15 분에 대 한 최대 속도 (≥10, 000 x g)에서 원심 분리기와 동.</li>
		<li>신선한 튜브를 위 수성 단계를 전송 합니다. Interphase는 방해 하지 마십시오. 참고 볼륨 복구 및 폐기 비 acqueous 단계를 포함 하는 관. 참고: 솔루션을 변성 시키기 x 2는 4 ° C에 저장 되며이 온도에서 응고 될 수 있습니다. 사용 하기 전에 따뜻한 37 ° c, 10-15 분 위해 때때로 agitating 솔루션 조심 포함 하는 산 성 페 놀-클로 프롬, 혼합물의 위에 속 인 다 acqueous 버퍼 하지 아래 단계를 철회 하는 것. 차입 솔루션 또는 95 ° c 물 nuclease 무료 예 열 열 솔루션 (샘플 + 10% 초과 당 100 µ L)의 적절 한 볼륨을 주의 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
작은 RNA 농축
	<ol>
<li>2.2.6 단계에서 수성 단계로 에탄올 100%의 1/3 볼륨을 추가 하 고 철저 하 게 혼합.</li>
		<li>각 샘플에 대 한 신선한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 넣으십시오.</li>
		<li>필터 카트리지 및 30에 대 한 10000 x g 에서 원심 분리기로 단계 2.3.1과 에탄올에서 lysate의 최대 700 µ L를 전송 s.</li>
		<li>경우 > 왼쪽, 혼합물의 700 µ L는 filtrate에 신선한 튜브 고 반복 단계 2.3.3; 모든 혼합 필터 카트리지 통과 될 때까지 반복 합니다.</li>
		<li>통해 흐름의 전체 볼륨을 측정 합니다.</li>
		<li>여과 하 여 철저 하 게 혼합 에탄올 100%의 2/3 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>신선한 수집 관에서 두 번째 필터 카트리지를 놓습니다.</li>
		<li>카트리지에 샘플 볼륨의 최대 700 µ L를 전송 하 고 흐름 통해 30 s. 폐기를 위해 10000 x g 에서 원심.</li>
		<li>2.3.8 단계를 반복 하 여 모든 혼합 필터 카트리지를 통과 했다.</li>
		<li>필터 카트리지를 미르 세척 솔루션 1의 700 µ L을 적용 하 고 흐름 통해 15 s. 폐기를 위해 10000 x g 에서 컬렉션 튜브 필터 카트리지를 원심. 동일한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 놓습니다.</li>
		<li>통해 흐름 필터 카트리지 및 분리기 필터 카트리지 10000 x g 에서 컬렉션 튜브 세척 솔루션 2/3의 500 µ L 15 미 삭제 신청. 신선한 수집 튜브에서 필터 카트리지를 놓습니다.</li>
		<li>신선한 수집 튜브에서 필터 카트리지를 놓고 세척 솔루션 2/3의 2.3.11 500 µ L 단계를 반복 합니다. 통해 흐름 무시 하 고 신선한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 전송.</li>
		<li>1 분 동안 10000 x g 에서 필터 카트리지와 튜브 원심</li>
		<li>신선한 1.5 mL 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 전송 하 고 데워 (95 ° C) 차입 솔루션 또는 nuclease 무료 물 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>30에 대 한 10000 x g 에서 원심 분리기 miRNAs 복구-80 ° c.에 저장 하는 s 참고: 흰색 침전 세척 솔루션 2/3에에서 형성 수 있습니다. 이것은 초과 EDTA 솔루션에서 출시입니다. Pipetting 단계 동안 이러한 결정을 그리기 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수행 반전 녹음 방송 그리고 미르 사전 증폭 (자료 테이블)
<ol><li>
Polyadenylation 반응 수행
	<ol>
<li>짧게 소용돌이 회전 원심 분리기 아래 내용을 다음 얼음, 모든 시 약을 녹여. 또한, 해 동 50% 말뚝 8000, 실내 온도 도달할 수 있도록.</li>
		<li>0.5 mL 원심 분리기 튜브, 반응 각 샘플에 대 한 칵테일의 3 µ L의 최종 볼륨을 얻는 반응 혼합을 준비 합니다. 다음 볼륨 플러스 10% 초과 볼륨을 사용 하 여 각 시 약에 대 한.</li>
		<li>추가 RNase 무료 물 1.7 µ L, 10 배 많은 버퍼의 0.5 µ L, 0.5 µ L의 10mm ATP, 그리고 마지막으로 0.3 µ L 5 U / µ L PolyA 효소.</li>
		<li>짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.</li>
		<li>반응 판 또는 반응 관의 각 음에 2 µ L의 샘플을 전송 하 고 칵테일 반응의 3 µ L를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 회전 원심 분리기 다운과 내용을.</li>
		<li>열 cycler에 접시/튜브를 놓고 다음 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>45 분 (polyadenylation 단계) 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>10 분 (정지 반응), 65 ° C에서 4 ° c.에 다음 보류와 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
결 찰 반응을 수행 합니다.
	<ol>
<li>각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합을 준비 합니다.</li>
		<li>RNase 무료 물 0.4 µ L, DNA 리가 버퍼, 결 찰 어댑터 x 25의 0.6 µ L, 50%의 4.5 µ L x 5의 3 µ L 추가 말뚝 8000 그리고 RNA 리가의 마지막 1.5 µ L.</li>
		<li>짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 콘텐츠.</li>
		<li>많은 미행 제품에 포함 된 각 잘/반응 관에 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.</li>
		<li>다음 설정 가진 열 cycler에 접시/반응 관 장소: 부 화 다음으로 60 분 동안 60 ° C에서 4 ° c.에서 개최 참고: 50% 말뚝 8000 높은 점성 이다. 실내 온도에, 발음 하 고 천천히 분배 사용 합니다. 각 포부와 분배 단계 후 10 plugger 잡고 아래로 흐름에 시 약을 허용 하는 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반전 녹음 방송 반응을 수행 합니다.
	<ol>
<li>원심 분리기 튜브, 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨에에서 반응 혼합을 준비 합니다.</li>
		<li>3.3 µ L의 RNase 무료 물, RT 버퍼, dNTP 믹스 (각 25 mM)의 1.2 µ L, 보편적인 RT 뇌관, x 20의 1.5 µ L x 5의 6 µ L RT 효소 혼합 x 10의 마지막 3 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.</li>
		<li>각 잘/반응 관 결 찰 제품을 포함 하 게 믹스의 15 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.</li>
		<li>다음 설정 사용 하 여 열 cycler에 접시/반응 튜브를 배치 합니다.</li>
		<li>15 분 (반전 녹음 방송) 42 ° C에서 품 어.</li>
		<li>5 분 (정지 반응), 85 ° C에서 4 ° c.에 다음 보류와 품 어 참고: RT 제품-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다 하 고 최대 2 개월까지 안정적으로 유지 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미르-앰프 반응 (자료 테이블)을 수행 합니다.
	<ol>
<li>각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합을 준비 합니다.</li>
		<li>RNase 무료 물 17.5 µ L, 2 x 미르 앰프 마스터 믹스의 25 µ L 및 미르 앰프 뇌관 믹스 x 20의 2.5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.</li>
		<li>각 샘플에 대 한 새로운 반응 플레이트 또는 반응 관의 각 음에 반응 혼합의 45 µ L을 전송 합니다. 각 잘 반응 관에 RT 제품의 5 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.</li>
		<li>열 cycler에 접시/반응 튜브를 놓고 표 1에서 같이 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 실시간 PCR을 수행
<ol><li>각 cDNA 샘플 1:10 0.1 x TE 버퍼에 희석.</li>
	<li>각 샘플에 대 한 웰 스/복제의 수를 계산 합니다. 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합 초과에서 볼륨의 10%를 추가 하는 각 샘플에 대 한 준비.</li>
	<li>RNase 무료 물 4 µ L, 2 x 빠른 고급 마스터 믹스 (자료 테이블)의 10 µ L와 희석된 cDNA의 마지막으로 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Vortexing에 의해 혼합 하 고 간단히 내용을 아래로 회전 원심.</li>
	<li>각 잘 밀봉 하는 접시 고 짧게 원심 반응 혼합의 19 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>RT-PCR 시스템에 열 프로토콜 (표 2)를 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Luo, H. -Y., Xu, R. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서) 그들의 목표 메신저 RNA의 3' UTR 지역 바인딩 및 억제 및 그것을 타락 하는 것은 가능. 그들은 따라서 변환 수준에서 유전자 식 레 귤 레이 터를 간주 될 수 있습니다. 지난 10 년간, 몇몇 miRNAs 암 개시 및 개발, 진단, 예 후 및 치료에 대 한 유용한 임상 바이오 마커 들을 만들고 상관 되어 있다. RNases에 의해 보호, miRNAs은 혈액, 혈장, 혈 청, 소변과 타 액, 임상 연습10에 그들의 잠재적인 유용성에 성장 관심사를 주도하 고 있다 같은 생물 학적 체액에서 안정적 형태로 존재 한다.
그럼에도 불구 하 고, 순환 miRNAs의 평가 과제 이며 샘플 수집, 대상 추출, 플랫폼 선택 및 글로벌 표준화에 관한 어려움은 과학 지역 사회 내에서 뜨겁게 논쟁된 주제.
샘플 수집 및 저장에 대 ...

CRC 나타냅니다 3 가장 자주 악성 종양 및 암 관련 된 죽음은 전세계의 4 번째 원인 진단. 날짜 하려면, bevacizumab (B), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), cetuximab (C) 또는 panitumumab (P), 단일 클론 항 체 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 대 한 감독에 대 한 감독 단일 클론 항 체 승인에 대 한 첫 번째 라인 치료 (CT) 화학요법 식이요법과 함께.
K-RAS 및 N-RAS 유전자에 있는 돌연변이 유일한 임상적으로 유용한 생체 혜택 EGFR 기반 시작 안티 코네티컷에서 같다 적어도 환자 식별 가능 비록 B 기반 CT에 대 한 응답의 예측은 생체에 대 한 검색을 여러 연구를 실시 했습니다, 아직 임상 실습1에서 사용 하기 위해 안정적이 고 효과적인 약물의 상당한 부족이 이다.
miRNAs는 대상 유전자의 번역을 통제 하 고 embryogenesis와 발암을 포함 하 여 수많은 physiopathological 프로세스에서 중요 한 역할을 하는 작은 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서). 이 분자는 혈장/혈 청, 소변,가 래, 비-침략 적 샘플링2에 사용할 강력한 생체 그들을 렌더링 등 생물 학적 체액에서 매우 안정 된. 우리 식별 하기 위한 신생 통로에 관련 된 miRNAs의 패널을 사용 하 여, B 기반 CT 처방으로 치료 새로운 전이성 CRC (mCRC)를 가진 환자에 있는 임상 결과 예측할 수 있는 biomarkers를 순환.
52의 시리즈 분석 무작위로 예비 multicenter 내 B 기반 CT로 치료 하는 mCRC 환자 단계 III 예 심 "이탈리아 재판에 고급 대 장 암" (ITACa). 현재 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (Comitato Etico 지역 Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo 당 소호 스튜디오 e 라 Cura 데이 Tumori (IRST) IRCCS, no. 674) 19회 2007 년 9 월에. 모든 환자는 혈액 샘플 수집 하기 전에 동의 했다. 각 환자에 대 한 정 맥 혈액 샘플 기준선 미르 식 및 환자 결과 관하여 치료 하는 동안 그것의 변조 치료 전과 (8 주) 후 첫 번째 임상 평가에서 수집 되었습니다.
문학의 검색을 통해 우리는 인간 플라스마에서 감지 것으로 알려져 있다 21 miRNAs 신생 프로세스와 상관을 선택: 있다-미르-107, 미르-126-3 p는-미르-145-5 p, 있다-미르-194-5 p, 있다-미르-199a-5 p, 있다-미르-200b-3 p, 있다-미르-20b-5 p 은-미르-21-5 p,-미르-210-3 p,-미르-221-3 p,-미르-24-3 p, 있다-미르-27a-3 p, 있다-미르-29b-3 p, 있다-미르-335-5 p, 있다-미르-424-5 p, 있다-미르-497-5 p, 있다-미르-520 d-3 p, 있다-미르-92a-3 p, 있다-미르-17-5 p는-미르-155-5 p. 우리는 또한-미르-223-3 p를 선택 하 고 있다-미르-484 생 정규화3,,45,6, 및 cel-미르-39 세 정규화에 스파이크도 C. 선 충 에서 정화. 모든 데이터 정규화 2 ̂ ̄(ΔΔCt) 메서드를 사용 하 여 수행 했다.
순환 miRNAs의 검출 분자 플라즈마에 매우 낮은 수준에서 존재 하 고 그들의 증폭은 화학적 도전 그들의 짧은 순서를 부여 하기 때문에 몇 가지 기술적인 어려움을 선물 한다. 이러한 이유로, 우리는 페 놀과 유기 추출 및 유리 섬유 열 기반 방법론을 고려 하는 절차를 선택. 미르 추출 순환 액체 생 검의 분야에서 뜨거운 주제 이며 우리가 선택 중 가장 신뢰할 수 있는 표시는 상업 키트 복구 된 수익률7,8의 품질과 금액. 우리는 반대 하는 프로토콜을 선택 miRNAs의 선택도 향상 시키기 위해 5'과 3 ' 성숙한 miRNA의 많은 꼬리에서 어댑터 추가 및 반응의 특이성에 의해 속기.
방법의 견고성을 감안할 때, 우리는 미리 발견 프로브 RT-PCR 중복에서 각 샘플을 평가 대 한 사용자 지정 접시를 설계 하 고 그림 1에서 보듯이 각 배지 내의 2 환자를 분석.

<table><tbody><tr><td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-free Safe-lock 2 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.344</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-free 20 &micro; L 팁</td><td>Starlab</td><td>S1123-1810</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-free 200 &micro; L 팁</td><td>Starlab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-free 1,000 &micro; L 팁</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>mirVana PARIS RNA 및 네이티브 단백질 정제 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Advanced miRNA cDNA 합성 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>A28007</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올 anidrous ACS 등급</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>414605</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토-에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4444558</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td><td>Thermo Fisher</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>7500 Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 &micro; L 실험실용 피펫,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 벤치탑 가열 블록</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>흄 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>0.2 mL PCR 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

거기는 증가 액체 생 검 암 진단, 예 후 및 치료 모니터링에 대 한 관심이 임상 연습을 위한 안정적이 고 유용 생체에 대 한 필요성을 만들기. 여기, 선물이 추출, 프로토콜 반전 녹음 하 고 환자 대 장 암 (CRC)의 플라즈마 샘플에서 miRNAs 순환의 식 수준 평가. microRNAs (miRNAs)는 변환 수준에서 대상 유전자의 표정을 통제 하 고 중요 한 역할의 physiopathology에서 프로 및 안티 신생 함수를 포함 하는 길이 18-25 뉴클레오티드의 비 코딩 RNAs의 클래스 다양 한 기관입니다. miRNAs는 혈 청 및 플라즈마, 암 진단, 예 후 및 치료 결정에 대 한 생체 순환 고 모니터링 그들을 렌더링 같은 생물 학적 체액에 안정. 미르 추출 순환 유기 및 열 기반 방법론 관련 된 신속 하 고 효과적인 방법을 사용 하 여 수행 되었다. MiRNA retrotranscription, 고려에서 3' 5 ' 뒤에 임의의 미르 사전 증폭 성숙한 miRNAs의 어댑터의 결 찰 polyadenylation 멀티 단계 절차를 사용 했습니다. 우리 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 시험 될 24-미르 사용자 패널을 선택 하 고 배열 사용자 지정 접시에 미르 프로브를 발견. 우리는 실시간 PCR 시스템에서 실행 되는 qRT-PCR 플레이트를 수행. 정규화에 대 한 가사 miRNAs (3.2) 대 GeNorm 소프트웨어를 사용 하 여 선정 됐다. 데이터 식을 스위트 소프트웨어 (v 1.1)을 사용 하 여 분석 했다 고 통계 분석을 수행 했다. 메서드는 안정적이 고 기술적으로 강력한 것을 입증 하 고 플라즈마 혈 청 등 액체 샘플의 바이오 마커 수준 평가에 도움이 될 수 있습니다.

진행 성 자유로운 생존 (PFS) 관련 신생 관련 순환 miRNAs의 패널 분석, 전반적인 생존 (OS) 및 객관적인 응답 속도 (오 어) 52 mCRC 중부 B 기반으로 환자 치료에 플라즈마 샘플에서 이러한 바이오 마커의 평가 기술적인 어려움 때문에 도전 이다. 우리는 환자 혈장 샘플, 반전 녹음 방송 및 사전 증폭에서 미르 추출 설립된 메서드를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라과 추출 단계에서 특히 요구 하는 몇 가지 수정만 우리가 성공적으로 우리의 모든 대상 환자 인구 (그림 2)를 평가 한다.
특히, 우리 2 분석 플라즈마 샘플/환자, 기준선과 치료 수정 미르 식 환자 결과와 연관.
우...

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

이 방법은 순환 바이오마커와 환자 예후 사이의 관계와 같은 번역 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 양의 입력 재료로 쉽고 신뢰할 수있는 방법론으로 순환 바이오 마커 패널의 발현을 평가 할 수있는 기회입니다. 이 기술의 의미는 환자의 의사 결정 및 치료 모니터링에 유용한 순환 바이오 마커를 식별 할 수 있기 때문에 암 환자의 치료로 확장.또한,이 방법은 순환 바이오 마커 분석에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 질병의 분자 특성화를 위한 조직 바이오마커 발현 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있다. 추출 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다.먼저 플라즈마 샘플 400마이크로리터를 RNase 가 없는 2밀리리터 튜브로 이송합니다. 그런 다음 튜브에 400 마이크로리터의 데니어링 솔루션을 추가합니다. 1나노몰러 스파이크인의 마이크로리터 4개를 추가합니다.용액을 혼합 한 후 800 마이크로 리터의 산 페놀 클로로폼을 추가하십시오. 60초 동안 용액을 소용돌이치며, 원심분리기는 최대 속도로 15분 동안 사용됩니다. 다음으로, 상부 수성 단계에 포함된 리자이트들을 깨끗한 튜브로 옮기고, 단계 간을 방해하지 않도록 주의한다.복구된 수성 상의 부피를 측정하고 1/3 부피를 용액에 추가합니다. 그런 다음 필터 카트리지를 신선한 수집 튜브에 넣습니다. 에탄올-리세이트 혼합물의 최대 700마이크로리터를 필터 카트리지로 옮길 수 있습니다.10, 000배 의 중력에서 30초 동안 필터 카트리지를 원심분리합니다. 다음으로, 흐름 의 총 볼륨을 측정합니다. 그런 다음, 에탄올 부피의 2/3을 여과에 넣고 잘 섞는다.두 번째 필터 카트리지를 신선한 컬렉션 튜브에 넣습니다. 이어서, 최대 700마이크로리터의 카트리지로 옮기고, 원심분리기는 30초 동안 10, 000배 의 중력으로 유동을 폐기한다. 필터 카트리지에 700 마이크로리터의 마이크로리터를 추가하고 15초 동안 10, 000배 의 중력으로 수집 튜브로 원심분리기를 제공합니다.흐름을 버리고 필터 카트리지를 동일한 튜브에 다시 넣습니다. 이 후 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 이동합니다. 그런 다음 예열된 용용 용액 100마이크로리터를 카트리지에 추가합니다.필터 카트리지를 10, 000배 의 중력으로 30초 동안 원심분리하여 마이크로RNA를 복구합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 다각성 반응 혼합 칵테일을 준비합니다. 반응 플레이트의 각 웰에 샘플의 두 마이크로 리터를 전송합니다.그런 다음 반응 칵테일의 마이크로 리터 3 개를 각 우물에 추가합니다. 소용돌이와 원심분리기는 접시를 짧게 분리하여 내용물아래로 회전합니다. 다음으로 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다.원심분리기 튜브에서 리기션 반응 믹스 칵테일을 준비합니다. 다음으로 반응 플레이트의 각 웰에 칵테일 10 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음, 1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 반응 플레이트의 내용을 혼합한 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 혼합합니다.그 후 반응 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다. 역전사 반응을 수행하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 원심분리기 튜브에서 반응 혼합을 준비한다. 그런 다음, 리깅 생성물을 포함하는 플레이트의 각 웰에 믹스15 마이크로리터를 추가합니다.1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 플레이트의 내용기를 섞은 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 섞습니다. 다음으로 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다. 그런 다음 miR-Amp 반응 믹스를 준비하고, 새로운 반응 플레이트의 각 웰에 45 마이크로리터를 첨가한다.그 후 반응 플레이트의 각 웰에 RT 제품의 5마이크로리터를 추가합니다. 1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 접시를 섞은 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 섞습니다. 그런 다음 플레이트를 열 순환기에 넣고 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 절차를 따릅니다.첫째, 각 cDNA 샘플을 TE 버퍼로 희석시 희석시. 그런 다음 원심분리기 튜브에서 PCR 반응 믹스를 준비합니다. 볼륨의 10%를 초과하여 추가합니다.반응 믹스의 19 마이크로리터를 플레이트의 각 웰에 옮기. 접시를 밀봉하고 원심분리기를 짧게 밀봉합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 RT-PCR 시스템에서 열 프로토콜을 수행합니다.스파이크인 제어의 직렬 희석은 이 특정 케이스 시리즈의 모든 플라즈마 샘플에 첨가하는 가장 좋은 농도를 선택하기 위해 수행되었다. 이 프로토콜 덕분에 전체 케이스 시리즈에서 단일 바이오마커뿐만 아니라 모든 단일 환자에서 모든 바이오마커를 평가할 수 있었습니다. 본 프로토콜에서, 진행없는 생존, 전반적인 생존 및 객관적인 반응 비율과 관련하여 혈관 신생 관련 순환 miRNAs의 패널은 화학요법 요법으로 치료된 대장암 환자에서 분석되었다.기준선과 제1 임상 평가 사이의 miRNA의 발현 수준을 비교하면, 하스-miR-155-5p의 증가가 관찰되었다. 이 증가는 짧은 PFS 및 OS와 연관되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 연기 후드 에서 페놀 클로로폼을 사용하여 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 순환 단백질 또는 코딩 RNA의 격리 및 분석과 같은 다른 방법은 순환 바이오 마커의 보다 철저한 패널의 평가와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 액체 생검 분야의 연구원들이 암 환자의 순환 바이오마커의 발현을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 혈액 및 화학 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑과 실험실 코트와 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 유기 추출과 유리 섬유 컬럼 농축을 사용하여 대장암 환자의 혈장 샘플에서 순환 microRNA를 추출하는 방법을 설명합니다. miRNA는 혈청 및 혈장과 같은 생물학적 유체에서 안정적이므로 암 진단, 예후, 치료 의사 결정 및 모니터링을 위한 이상적인 순환 바이오마커입니다. 이 방법은 환자의 임상 결과를 예측할 수 있는 새로운 순환 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

순환 miRNA 추출: 유기 추출 및 Small RNA 농축을 통해 혈장 샘플에서 miRNA를 분리하는 방법

이 프로토콜은 순환하는 miRNA 오염을 방지하고 NSCLC에서 miRNA의 바이오마커 기능을 평가하기 위해 Proteinase K 및 RNAse 처리와 함께 상용 엑소좀 분리 키트를 통해 NSCLC 환자의 혈장에서 방출되는 엑소좀에서 miRNA 프로파일링을 수행할 수 있는 가능성을 설명합니다.

qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 &#39;플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

여기에서는 miRNA in situ hybridization을 사용하여 유방암 환자 샘플에서 miRNA 발현을 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

miRNA의를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현의 임상 병리학 적 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

염료 기반 화학 및 액적 디지털 PCR 기술을 사용한 cell-free microRNA 정량화를 위한 민감하고 정확한 방법에 대해 설명합니다.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

우리는 증폭 없이 생물학적 기질에서 분자를 바코딩하고 계수하여 유전자 발현을 정량화하는 multiplexed high-throughput 유전자 발현 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 과민성 대장 증후군이 있거나 없는 피험자의 전혈에서 microRNA(miRNA) 발현을 정량화했습니다.

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

여기, 우리 조기 폐 암 발견에 대 한 순환 예측에 관한 서명 분류자 테스트를 수행 하는 시험 검사는 BioMILD에 채택 하는 상세한 프로토콜 제시.

예측에 관한 기반 액체 생 검: 플라즈마 미르 폐 암 검 진에 대 한 서명 분류자 (MSC)의 경험

있도록 매우 민감한 탐지 목표 인간의 대 장 암 (CRC) 세포 조직 정착, 우리 여기 PDX 파생 CRC organoid 셀에 녹색 형광 단백질 (GFP) lentiviral 입자의 효율적인 변환에 대 한 프로토콜을 표시 스테레오-형광 현미경 관찰 받는 쥐로 그들의 주입에의...

GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

학습하세요 혈장 샘플에서 순환 miRNA 발현을 평가하는 방법을 통해 암 환자의 바이오마커를 분석하는 기술입니다. 이 방법은 최소한의 입력 재료로 24개 miRNA 패널을 신뢰성 있게 평가하여 치료 모니터링과 예후 예측에 활용할 수 있습니다.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

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