Name: 쥐 메 틸-Seq 플랫폼 관련 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 Methyl-Seq 방법을 이용하여 쥐 모델에서 만성 스트레스로 인한 DNA 메틸화 변화를 정량적으로 분석하는 기법을. 이 방법은 다양한 생리학적 조건에서 후성유전학적 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 NIH 그랜트 MH101392 (RSL) 및 다음 수상 및 재단에서 지원에 의해 투자 되었다: NARSAD 젊은 수 사관 상, 마가렛 앤 가격 조사 기금, 찰스 T. 바 우 어 재단, 베이커를 통해 제임스 Wah 기분 장애 학자 기금 재단, 그리고 프로젝트 일치 재단 (RSL).

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+DNA+methylation+maps+of+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells.</a> Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).</li>
<li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+DNA+methylation+array+with+single+CpG+site+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">High density DNA methylation array with single CpG site resolution.</a> Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).</li>
<li>Naumov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+analysis+of+DNA+methylation+in+colorectal+cancer+using+Infinium+HumanMethylation450+BeadChips%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips.</a> Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).</li>
<li>Wockner, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+methylation+analysis+of+human+brain+tissue+from+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients.</a> Translational Psychiatry. 4, e339(2014).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+representation+bisulfite+sequencing+for+comparative+high-resolution+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).</li>
<li>Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+bisulfite+sequencing+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes.</a> Methods. 48 (3), 226-232 (2009).</li>
<li>Slieker, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+systematic+annotation+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+using+the+Illumina+450k+array%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26(2013).</li>
<li>Hing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+targeted+capture+Methyl-Seq+platform+for+the+mouse+genome+identifies+novel+tissue-specific+DNA+methylation+patterns+of+genes+involved+in+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment.</a> Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).</li>
<li>Seifuddin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Methyl-Seq+analysis+of+blood-brain+targets+of+glucocorticoid+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure.</a> Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).</li>
<li>Irizarry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+colon+cancer+methylome+shows+similar+hypo-+and+hypermethylation+at+conserved+tissue-specific+CpG+island+shores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores.</a> Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+CHARM+DNA+methylation+platform+for+the+rat+genome+reveals+novel+brain+region-specific+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences.</a> Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).</li>
<li>Jankord, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+vulnerability+during+adolescent+development+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stress vulnerability during adolescent development in rats.</a> Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).</li>
<li>Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+open%3Aclosed+arm+entries+in+an+elevated+plus-maze+as+a+measure+of+anxiety+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).</li>
<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSmooth%3A+from+whole+genome+bisulfite+sequencing+reads+to+differentially+methylated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions.</a> Genome Biology. 13 (10), R83(2012).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+corticosterone+exposure+increases+expression+and+decreases+deoxyribonucleic+acid+methylation+of+Fkbp5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice.</a> Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+measure+of+glucocorticoid+load+provided+by+DNA+methylation+of+Fkbp5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice.</a> Psychopharmacology. , (2011).</li>
<li>Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+obesity%3A+the+role+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes%2C+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).</li>
<li>Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%2C+coronary+heart+disease%2C+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Platelets, coronary heart disease, and stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).</li>
<li>McKlveen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Stress+Increases+Prefrontal+Inhibition%3A+A+Mechanism+for+Stress-Induced+Prefrontal+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction.</a> Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).</li>
<li>Akalin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((methylKit%3A+a+comprehensive+R+package+for+the+analysis+of+genome-wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles.</a> Genome Biology. 13 (10), R87(2012).</li>
<li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol-dose-dependent+DNA+methylation+and+expression+in+the+nucleus+accumbens+identifies+coordinated+regulation+of+synaptic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes.</a> Translational Psychiatry. 7 (1), e994(2017).</li>
<li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+nucleus+accumbens+identifies+DNA+methylation+signals+differentiating+low%2Fbinge+from+heavy+alcohol+drinking%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking.</a> Alcohol. 60, 103-113 (2017).</li>
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원고는 Agilent 기술에서 경연 대회 상금의 일부입니다.

이 연구에서 우리는 설계 및 쥐 게놈에 대 한 메 틸-Seq 플랫폼 구현. 스트레스의 쥐 모델의 유틸리티를 시연 함으로써 우리는 실험 및 분석 파이프라인 두 비교 그룹 사이 차동 갠 영역을 제공할 수 있습니다 설명 했다.
플랫폼의 성공적인 구현을 보장 하기 위해, 몇 가지 중요 한 단계를 관찰 해야 합니다. 첫 번째, 초기 DNA 품질 및 수량 최종 메 틸-Seq 라이브러리의 양과 품질에 큰 영향을 있다. 우리는 fluorometer 보다는 분 광 광도 계, 우리의 DNA 측정 현재 이중 가닥 DNA의 수량을 반영 되도록 사용. 분자 크기와 어댑터 결 찰 후 전단에 따라 DNA의 수량을 측정 하는 bioanalyzer 사용 되었다. 분자 크기 다음이 단계 사이 "변화"를 확인 하는 것은 후속 단계에서 PCR 어댑터 중재를 받게 될 것 이다 각 DNA 파편의 끝에 어댑터의 존재를 확인 중요 합니다. DNA는 어댑터 결 찰 단계의 끝에 남은 수량 또한 중요 하다, 적어도 100부터 ng 라이브러리 제품의 충분 한 수량 대상 농축 황산 변환 단계 후 사용할 수 있도록 하려면이 단계에서 필요 하다. 최종 높은 감도 측정 라이브러리는 제대로 다음-세대 시퀀서에 후속 클러스터링에 대 한 희석 수 있도록 생성 된 메 틸-Seq 라이브러리에서 수행 되었다. 마지막으로, 황산 pyrosequencing 높은 양적, 독립적인 방법으로 분석 파이프라인의 정확도 평가 하기 위해 고용 되었다. 원래 샘플 및 추가적인 동물을 사용 하 여 복제를 사용 하 여 최종 검증은 실험 DNA 메 틸 화에 생물학적으로 상당한 변화를 감지할 수 있도록 중요 한 단계입니다.
우리는 또한 프로토콜에서 편차 또는 경우 문제 발생 시 몇 가지 지침을 포함 합니다. 첫째, 그것은 최종 수리, 어댑터 결 찰, 또는 자석 구슬 정화 단계 동안 너무 많은 DNA를 잃을 수입니다. 시작 하는 양의 DNA 작은 수 또는 (< 200 ng) 제한 된 조직/DNA 가용성 또는 형광 활성화 된 세포 분류 등 다양 한 농축 방법의 구현. DNA의 과도 한 손실에 대 한 보상을 수 또는 도서관 건설 프로토콜에 걸쳐 DNA 양을 시작 낮은 사이클 수를 증가 하는 두 개의 라이브러리 증폭 단계 수 있습니다. 그러나, 더 이상 추가 2-3 주기는 권장, 과도 한 템플릿 증폭 시퀀싱 되 고 중복 읽기의 증가를 끌 것입니다. 이러한 중복 백분율 메 틸 화 계산에 바이어스를 방지 하기 위해 맞춤 단계에서 제외 됩니다. 둘째, 평균 DNA 크기 30 bps 이상으로 증가 하지 않습니다, 경우는 시 약은 새로운 T4 DNA 중 합 효소, Klenow, 또는 T4로 리가 나이가 있을 수 있습니다 있는지 확인 합니다. 상업적으로 이용 가능한 대체 시 약을 사용할 수 있습니다.
또한, 예측된 DMRs pyrosequencing, DNA 메 틸 화 차이 존재 하지 않는 또는 분석에 의해 예측 보다 훨씬 적은 있다 의해 확인 하지 수도 가능 하다. 후보 지역 가난한 정품 확인은 너무 때 pyrosequencing 결과 차동 메 틸 화를 확인 하지 않습니다 같은 많은 게놈 넓은 분석에 대 한 일반적인 문제 또는 효과 크기는 분석에 의해 예측 보다 훨씬 작습니다. BSmooth 여러 cpgs 내 겠 창 한 분석 패키지는 "부드럽게" 메 틸 화 수준입니다. 현재 실험에 대 한 BSmooth 연루는 DMR의 메 틸 화 수준의 황산 pyrosequencing에 의해 확인 되었다. 그러나, 거기 있을 것 이다 메 틸 화 수준 예측 BSmooth와 pyrosequencing에 의해 확인 사이의 불일치. 모든 연속 DNA 메 틸 화에 50% 이상 차이가 날 수 있습니다 cpgs 내 겠 또는 메 틸 화 값으로 인해 제외 된 cpgs 내 겠은 DMR 내 cpgs 내 겠 평균 메 틸 화 값을 추정 다듬기 기능에서 발생 하는 불일치 하위 임계값 깊이 읽기. R-패키지 MethylKit24 cpgs 내 겠 또는 심지어 단일 cpgs 내 겠 그 메 틸 화 수준 연관 강하게 pyrosequencing의 유효성을 검사 하는 그의 작은 윈도우를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다른 패키지를 구현 하 고 pyrosequencing에 의해 그들의 예측된 영역 또는 차동 메 틸 화의 cpgs 내 겠 테스트 데이터의 안정성을 보장 합니다. 또는, 원래 메 틸-Seq 라이브러리 resequenced 하 고 읽기 깊이 증가 읽기 파일에 추가 될 수 있습니다. 때문에 메 틸 화 수준의 결정 반 양적 및 구술 읽기 수로 [(# of CpGs) / (TpGs + cpgs 내 겠 #)], 주어진된 포장 소비재의 백분율 메 틸 화 값의 정확도 높일 것에 대 한 읽기 깊이 증가. 이 연구에서 우리 메 틸 화 값 적어도 10 읽기에 의해 결정 되었다 고 각 포장 소비재에 대 한 19 x의 전체 읽기 범위 달성 cpgs 내 겠 고려.
쥐 메 틸-Seq 플랫폼의 제한 없이 아니다. 전체 게놈 황산 시퀀싱 보다 비용 효과적인 동안, 그것은 상당히 다른 방법 보다 더 비싸다입니다. 그럼에도 불구 하 고, 비용의 대부분을 캡처 시스템 그리고 시퀀서에 차선을 구매 했다. 크로스-조직 비교 덜 큰 (25-70%) 차이12 DNA 메 틸 화에 따른 요구와 필요한 읽기 깊이 따라 레인 당 더 많은 샘플을 멀티플렉싱 높은 용량 플랫폼을 사용 하 여 비용을 줄일 수 있습니다. 또한, 샘플 준비는 다른 방법 보다 더 많은 시간이 걸리는. 차세대 시퀀싱을 통합 하는 다른 풀 다운 방식와 마찬가지로, 하는 동안 추가 황산 변환 및 정화 단계 작업 부하를 추가 합니다. 전반적으로, 메 틸-Seq 플랫폼 전체 게놈 시퀀싱에 대 한 비용 효율적인 대안 이며 상당히 microarray 기반 플랫폼 분석 보다 더 이상의 2.3 백만 cpgs 내 겠에서 기본적인 쌍 해상도 제공. 날짜 하려면, 상용 인간과 마우스 메 틸-Seq 플랫폼 알코올 의존 변화 원숭이 뇌25,26, 마우스 뇌9, 및 혈액 neurodevelopmental 유전자를 사용 되었습니다. 스테로이드 제제10대상 또한, 제한 효소에 의해 시퀀스 인식에 특정 영역을 대상으로 기능 그것은 종 간 비교에 대 한 이상적인 플랫폼을 통해 있습니다. 이 연구를 위해 우리는 많은 약리학, 대사, 행동 실험 게놈 넓은 methylomic 도구의 이점 없이 수행 되는 쥐에 대 한 메 틸-Seq 플랫폼을 설계 되었습니다. 우리의 데이터는 스트레스의 쥐 모델에서 DMRs를 검색 하기 위해 사용할 수 있습니다을 전체 플라즈마 CORT 수준 같은 다른 생리 적인 매개 변수 상관을 보여준다.
메 틸-Seq 플랫폼 규제 영역을 문서화 하는 충분 한 실험적 증거를 없을 수 있습니다 시퀀스 유전자와 동물에 있는 후 성적인 실험에 이상적입니다. 이러한 영역은 사용할 수 있습니다 때 추가 지역 맞춤형 고 현재 버전에 연결 된 수 있습니다. 또한, 플랫폼 대상 농축 제한 효소 인식에 의해 제약 되지 않습니다 때문에, 비교 유전체학에 이상적입니다. 예를 들어, 그것은 특정 제한 사이트를 비호 하는 여부에 관심사의 어떤 유전자의 발기인 지구를 캡처할 수 있습니다. 마찬가지로, 마우스 또는 관심의 게놈에 보존은 인간에서 확인 된 그들과 같은 어떤 규제 영역을 캡처할 수 있다.

높 처리량 연속에 발전은 다양 한 모델 및 비 모형 유기 체 게놈 시퀀스에 이르렀다. 같은 시퀀스의 여부 유전학, 비교 유전체학, 및 transcriptomics 연구를 촉진 했다. 예를 들어, 사용 가능한 게놈 시퀀스는 매우 풍요롭게 히스톤 수정1또는 황산 시퀀싱와 연결에 따라 DNA 칩 Seq 실험에서 시퀀싱 데이터를 정렬 하는 데 유용는 DNA 메 틸 화에 의해 측정 unmethylated cytosines2의 황산 변환에서 형성 uracil 감지. 그러나, 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있는 종의 규제 시퀀스의 주석된 데이터의 부족 때문에 그들의 디자인에서 사용 가능한 게놈 시퀀싱 데이터를 통합 하는 epigenomic 플랫폼의 구현에서 지연 되었습니다.
특히, DNA 메 틸 화 methylomic 플랫폼을 구축 하기 위한 사용 가능한 게놈 데이터를 활용할 수 있는 DNA에 가장 널리 공부 후 성적인 수정 중 하나입니다. 1 개의 그런 보기는 인간 methylome3, 정신과4,5종양학에서 다양 한 분야에서 널리 사용 되었습니다 배열 기반 플랫폼입니다. 불행 하 게도, 비인간적인 동물 모델에 대 한 비슷한 플랫폼은 거의 아무 널리 사용 플랫폼을 그들의 초기 디자인에서 게놈 시퀀스의 장점을 받아들으로 부족, 있습니다.
비 인간 동물 모델의 methylomic 프리를 평가 하는 일반적인 방법은 이다 감소 표현 황산 시퀀싱 (RRBS)6. 이 접근 방식을 제공 하는 포괄적인 methylomic 풍경, 낮은 읽기-심층 취재 비용 및 게놈2의 큰 유전자 가난한 지역에서 제한 된 기능 정보를 제공 하는 전체 게놈 황산 시퀀싱 비용 극복 . RRBS 제한 다이제스트 및 일반적으로 유전자 발기인 근처 발견 하 고 유전자 규칙7에 역할을 생각 하는 CpG 섬 등 매우 다양 한 GC 시퀀스에 대 한 풍부 하 게 genomic DNA의 크기 선택 포함 한다. 중요 한 연구의 숫자에 RRBS 메서드를 사용 하는 동안 제한 효소에 의존이 아니다 주목할 만한 도전과 한계 없이. 예를 들어, GC 풍부한 시퀀스 RRBS의 농축은 전기 이동 법에 의해 제한 효소와 후속 크기 선택에 의해 인식 하는 특정 순서의 존재에 전적으로 의존. 즉, 이러한 금지 사이트를 포함 하지 않는 모든 게놈 영역 크기 선택 시 제외 됩니다. 또한, 크로스-종 비교 동일한 제한 사이트는 다른 종 중 동일한 loci에 존재 하지 않는 도전 하.
RRBS의 한계를 극복 하는 한 가지 방법은 사용 하는 플랫폼의 설계에 게시 된 게놈 시퀀스를 활용 하는 농축 방법. 어레이 기반 인간 플랫폼 뇌관 프로브 대립 유전자 특정 (황산 변환 후 TG 대 CG) 대상 어 닐 링 및 뇌관 확장을 위한 특정 cpgs 내 겠에 대 한 설계를 사용 합니다. 그것의 디자인 뿐만 아니라 사용할 수 있는 인간 게놈 시퀀스, 하지만 실험적으로 확인 된 규제 영역 문의 인코딩 및 합8등의 여러 줄에서 인수를 반영 한다. 인간 methylomic 조사에 그것의 광범위 한 사용에도 불구 하 고 비슷한 플랫폼 모델 동물에 대 한 존재 하지 않습니다. 또한, 배열 기반 형식 프로브 배치에 사용할 수 있는 영역에 중요 한 제약 조건을 배치합니다. 지난 몇 년 동안, 노력 캡처 프로브 설계 및 차세대 시퀀싱의 높은 처리량 기능 제공 대상-특이성 결합 되었습니다. 이러한 노력 결과 마우스 게놈 (마우스 메 틸-Seq), 메 틸 화9,10에 두뇌 또는 glucocorticoid 유발 차이 식별 하는 데 사용 했다의 시퀀싱 기반 대상 농축 시스템입니다. 다른 모델과 아닌 모델 동물에 대 한 비슷한 플랫폼이이 동물에 epigenomic 연구를 촉진 하기 위하여 필요 합니다.
여기, 우리는 쥐에 methylomic 분석을 소설이 플랫폼의 구현 방법을 보여 줍니다. 쥐는 약리학, 신진 대사, 내분비학, 동작에 중요 한 동물 모델을 역임 했다. 예를 들어 약물 독성, 비만, 스트레스 반응, 또는 마약 중독을 기본 메커니즘을 이해 하는 증가 필요가 있다. 이러한 조건과 관련 된 methylomic 변경 캡처 수 있는 높은 처리량 플랫폼 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 증가할 것입니다. 쥐 게놈은 아직 규제 지역에 대 한 주석 부족, 이후 비 중복 발기인, CpG 섬, 섬 해안11, 통합 하 고 이전 쥐 메 틸-Seq 플랫폼12GC 풍부한 시퀀스를 식별 합니다.
쥐 게놈에 대 한 SureSelect 대상 농축 (일반적으로 메 틸-Seq 라고도 함) 플랫폼의 성공적인 설계 및 구현 평가, 우리는 만성 변수 스트레스 (CVS)13 차동 methylated 식별 하의 쥐 모델 고용 강세와 스트레스 동물 사이의 영역입니다. 우리의 플랫폼, 프로토콜, 디자인과 구현 체 누구의 게놈 시퀀스는 이미 사용할 수 있지만 제대로 주석이 남아에 포괄적이 고 편견 후 조사를 실시 하 고 싶은 수 있습니다 수사에 대 한 유용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>방사성 면역 분석(RIA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>7120126</td><td>Corticosterone, 125I labeled</td></tr><tr><td>Master Pure DNA Purification Kit</td><td>Epicentre/Illumina</td><td>MC85200</td><td></td></tr><tr><td>Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath</td><td>USA Scientific</td><td>2510-1102</td><td>1.5 mL 튜브와 함께 사용</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td>Vortex Mixer</td></tr><tr><td>에틸 알코올, 순수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>100% 에탄올, 분자 등급</td></tr><tr><td>원심분리기 5424 R</td> Eppendorf-20,000 <td></td><td></td><td>x g</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>형광측정기</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 어세이 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>고감도 DNA 검출 시약</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>SureSelectXT Rat Methyl-Seq 시약 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>G9651A</td><td>Methyl-Seq 라이브러리 준비를 위한 시약</td></tr><tr><td>SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library</td><td>Agilent Technologies</td><td>931143</td><td>rat target IDTE</td></tr><tr><td>, pH 농축을 위한 RNA 미끼 8.0</td><td>IDT DNA</td><td>11-05-01-09</td><td>10 mM TE, 0.1 mM EDTA</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Covaris E-series 또는 S-series</td><td>Covaris-Isothermal</td><td></td> <td>Sonicator</td></tr><tr><td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>Water, Ultra Pure (Molecular Biology grade)</td><td>Quality Biological</td><td>351-029-721</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 Well-Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA 결합 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>96S Super Magnet</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td>정제 단계용 마그네틱 플레이트</td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td>전기영동 기반 바이오분석기</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape 고감도</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>D1000 시약</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 시약 고감도</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>DNA110 SpeedVac</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td>Vacuum</td><td> 농축기</td></tr><tr><td>, Dynabeads, MyOne, Streptavidin T1, 마그네틱 비드,</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td>, <td>Streptavidin 마그네틱 비드,</td></tr><tr><td>Labquake Tube Rotator,</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>415110Q</td><td>Nutator Mixer도 사용할 수 있습니다</td></tr>: <tr><td>EZ DNA 메틸화-금 키트</td><td>, Zymo Research</td><td>D5006</td><td>Bisulfite 변환 키트. 결합, 세척, 탈황 및 용리 완충액 포함</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2500</td><td>Illumina</td><td>-</td><td>차세대 염기서열분석 기계</td></tr><tr><td>PCR 및 파이로시퀀싱 프라이머</td><td>IDT DNA</td><td>가변</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소 with ThermoPol 완충액 - 2,000 단위</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) 용액 세트</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark MD96</td><td>QIAGEN-Pyrosequencing</td><td></td> <td>machine</td></tr><tr><td>에틸 알코올 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>70% 에탄올 용액</td></tr><tr><td>수산화나트륨 펠릿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>0.2 M NaOH 변성 완충 용액</td></tr><tr><td>J.T. Baker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-508</td><td>10 mM Tris Acetate Buffer Wash Buffer solution</td></tr><tr><td>PyroMark Gold Q96 시약(50x96)</td><td>QIAGEN</td><td>972807</td><td>PyroMark</td></tr><tr><td>어닐링 버퍼</td>에 필요한 시약 <td>QIAGEN</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark 결합 버퍼(200mL)</td><td>QIAGEN</td><td>979006</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-01</td><td>Streptavidin-coated sepharose beads</td></tr><tr><td>PyroMark Q96 HS 플레이트</td><td>QIAGEN</td><td>979101</td><td>파이로시퀀싱 분석 플레이트</td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-205</td><td>플레이트 믹서. 96웰 블록 별도 판매(cat. 번호 05-400-207)</td></tr><tr><td>SureDesign 웹사이트</td><td>Agilent</td> <td>Technologies-Target</td> <td>capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser</td><td>University of California Santa Cruz-rat</td><td></td> <td>Nov 2004 rn4 assembly</td></tr><tr><td>Agilent Methyl-Seq Protocol</td><td>Agilent</td> <td>Technologies-https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 메 틸-seq 플랫폼 관련 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인 하

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

다양 한 동물의 게놈을 사용할 수 있게,이 동물 모델에 동적 epigenetic 변화를 캡처할 수 있는 도구에 대 한 증가 필요가 있다. 쥐 epigenetic 도구 통찰력 기계 정보를 제공 하는 많은 약리학 및 행동 연구를 보완 수 있는 하나의 특정 모델 동물입니다. 이 위해, 우리는 쥐 쥐 게놈에서 DNA 메 틸 화 수준을 평가할 수 있는 SureSelect 캡처 시스템 (메 틸-Seq 라고 함)를 적응. 쥐 디자인 대상 발기인, CpG 섬, 섬 해안, 및 모든 RefSeq 유전자에서 GC 풍부한 지역.
쥐 실험에는 플랫폼을 구현 하기 위해 남성 Sprague Dawley 쥐 혈액 샘플 게놈 DNA 추출에 대 한 수집 된 후 3 주 동안 만성 변수 스트레스에 노출 되었다. 메 틸-Seq 라이브러리는 전단, 어댑터 결 찰, 대상 농축, 황산 변환 및 멀티플렉싱 하 여 쥐 DNA 견본에서 건설 되었다. 라이브러리는 다음-세대 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱 했다 고 시퀀스 읽기 강조 하 고 강세가 없는 쥐의 DNA 사이 DMRs를 식별 하기 위해 분석 했다. 최고 후보자 DMRs 했다 독립적으로 유효성을 검사 하지 황산 pyrosequencing 플랫폼의 견고성을 확인 하 여.
결과 쥐 메 틸-Seq 플랫폼은 스트레스에 노출에 의해 유도 된 메 틸 화 변화를 캡처할 수 있는 유용한 epigenetic 도구를 보여 줍니다.

여기, 우리 프로토콜 및 관련 만성 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인을 쥐 모델을 사용 하 여 메 틸 Seq, epigenomic 플랫폼의 구현을 설명 합니다. 결과 쥐 메 틸-Seq 플랫폼은 쥐에서 스트레스 노출에서 발생 하는 메 틸 화 차이 감지 수를 보여 줍니다.

쥐 메 틸-Seq 플랫폼 관련 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인 하

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

이 방법은 DNA 메틸화에 대한 환경 요인의 영향을 평가하기 위해 시퀀싱 기반 도구를 설계하고 구현하는 방법을 보여 줌으로써 에피소드 학분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배열 기반 플랫폼에 비해 DNA 메틸화 수준을 평가하는 보다 포괄적이고 정량적인 방법을 제공할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 서열 데이터가 유효한 어떤 유기체에 있는 생리적인 프로세스의 다른 모형 때문에 DNA 메틸화 변경의 확인으로 확장합니다.이 방법은 DNA 메틸화에 대한 스트레스의 영향에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 고지방 식단에서 환경 독성물질에 노출되고 당뇨병및 심혈관 질환과 같은 조건과 같은 다른 환경 적 요인 또는 생리적 조건에도 적용 될 수 있습니다. DNA를 전단하고 생체 분석기를 통해 크기를 확인한 후 각 샘플에 DNA 결합 자기 구슬 180 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 마그네틱 플레이트에 구슬을 펠트하고 상체판을 제거합니다.70%에탄올의 200 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다음으로, 마그네틱 플레이트를 사용하여 구슬을 펠릿하고 가능한 한 많은 에탄올을 제거하십시오. 3~5분 동안 37°C의 열 블록에서 구슬을 건조시다.이어서, 뉴클레아제 없는 물의 44마이크로리터에서 펠릿을 회수하고, 상류제의 약 42마이크로리터를 수집한다. 어댑터를 리게팅하고 생체 분석기를 통해 결찰을 확인한 후 샘플을 낮은 DNA 결합 미세 원심 분리튜브로 이송합니다. 그런 다음 가열 된 진공 농축기를 사용하여 3.4 마이크로 리터 미만의 샘플 볼륨을 줄입니다.그 후 각 샘플에 5.6 마이크로리터의 메틸-세크 블록 믹스를 추가하고 열 사이클러에 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 라이브러리 혼성화 캡처를 준비합니다. 그런 다음 각 샘플에 캡처 라이브러리 혼성화 믹스 20 마이크로리터를 추가하고 16시간 동안 섭씨 65도에서 배양합니다.인큐베이션 기간이 끝날 때까지, 새로운 8웰 스트립 튜브에 샘플 당 스트렙타비딘 자기 비드 50 마이크로리터를 추가하여 스트렙타비딘 자기 구슬을 준비한다. 메틸-세크 바인딩 버퍼의 200 마이크로 리터와 구슬을 세척. 스트립 튜브를 마그네틱 플레이트에 놓고 구슬에서 상수체를 제거합니다.그런 다음 메틸-세크 바인딩 버퍼의 200 마이크로 리터에서 구슬을 다시 일시 중지합니다. 세척 된 스트렙타비딘 구슬에 샘플을 추가하고 회전 믹서에 30 분 동안 실온에서 배양하십시오. 샘플이 혼합되는 동안, 메틸-세크 워시 버퍼 2의 알리쿼트 200 마이크로리터는 96웰 플레이트의 삼중 웰에 넣고 섭씨 65도까지 미리 따뜻합니다.시료가 인큐베이션된 후 마그네틱 구슬을 마그네틱 플레이트로 펠릿하고 상체를 제거합니다. 그런 다음, 메틸-세크 워시 버퍼 원의 200 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다. 실온에서 15분 동안 구슬을 배양하고 마그네틱 플레이트를 사용하여 상수판을 제거합니다.그 후, 미리 데워진 워시 버퍼 2의 200 마이크로리터에서 비드 펠릿을 다시 놓습니다. 그런 다음, 구슬을 펠렛하기 위해 마그네틱 플레이트를 사용하기 전에 열 사이클러에서 구슬을 배양한다. 메틸-세크 용출 버퍼 20 마이크로리터를 세척된 구슬에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다.마그네틱 플레이트를 사용하여 구슬을 펠릿하고 상체를 새로운 스트립 튜브로 옮기십시오. 먼저, 이전에 수집된 상체에 비황피변환 시약 130마이크로리터를 추가한다. 150 마이크로리터 반응을 두 개의 우물로 균등하게 나눕니다.그런 다음 열 사이클러에서 반응을 배양합니다. 600 마이크로리터의 바인딩 버퍼를 사용하여 샘플을 스핀 컬럼에 바인딩하고 100 마이크로리터의 Wash 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 열을 원심분리하고 흐름을 폐기합니다.그 후, 열에 200 마이크로리터의 황량 버퍼를 추가합니다. 실온에서 15~20분 동안 기둥을 배양합니다. 워시 버퍼 200 마이크로리터로 컬럼을 두 번 씻으시다.그런 다음 열에 용출 버퍼 10 마이크로리터를 추가합니다. 실온 및 원심분리기에서 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 PCR 반응 마스터 믹스를 준비합니다.그런 다음 각 샘플에 마스터 믹스의 82 마이크로리터를 추가하고 열 사이클러에서 샘플을 배양합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 PCR 마스터 믹스 2를 얼음 위에 준비합니다. 그런 다음 각 샘플에 PCR 마스터 믹스 2와 상업용 인덱싱 프라이머의 5 마이크로리터의 25.5 마이크로리터를 추가하고 열 사이클러에서 샘플을 배양합니다.생체 분석기에서 고감도 DNA 검출 시약으로 샘플의 DNA 농도를 평가합니다. 그런 다음 메틸-세크 라이브러리는 차세대 시퀀서에 대한 시퀀싱을 위해 제출됩니다. 비설피테 변환 및 PCR 증폭 유효성 검사 샘플 후 바인딩 버퍼, 물 및 스트렙타비딘 코팅 세파로즈 구슬로스 구슬로 마스터 믹스를 준비합니다.그런 다음 마스터 믹스 75마이크로리터와 중첩PCR 제품의 5마이크로리터를 96웰 플레이트에 넣고 플레이트 셰이커에 15~60분 동안 흔들어 줍니다. 플레이트가 흔들리는 동안, 불꽃 분석 분석 플레이트의 우물에 프라이머 12 마이크로 리터를 추가합니다. 흔들린 후, 물로 채워진 통에 진공 공구를 놓고 공구를 바인딩 반응으로 접시에 놓습니다.다음으로, 진공 공구를 70%에탄올, 수산화나트륨 및 트리스 아세테이트 버퍼를 포함하는 반쯤 채워진 트로프에 담급한다. 진공을 분리하고, 비즈를 전송하는 HS 피로즈퀀싱 분석 플레이트에 진공 도구를 배치합니다. 접시를 열 블록에 놓고 섭씨 80도에서 2 분 동안 배양하십시오.마지막으로 파이로 프로그램을 시작하기 전에 접시를 5분 동안 식힙니다. 이 프로토콜에서, 메틸-세크 도서관의 분석은 스트레스와 스트레스가 없는 동물과 DM의 그래픽 플롯 사이의 차별화된 메틸화 지역 또는 DM의 순위 목록을 제공했습니다.CpG 10의 메틸화 수준은 또한 각 동물에 대한 평균 3 주 CORT 수준에 비교되었다. 결과는 내분비와 메틸화 데이터 사이에 겸손한 상관 관계가 있음을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 DNA 전단과 어댑터 결찰 단계 사이의 평균 DNA 크기 증가를 비교하고 시퀀싱 전에 충분한 라이브러리 양을 보장하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 쥐 신경 개발에 환경 독성물질의 영향과 같은 새로운 질문에 대답하기 위해 다른 유사한 접근 법을 구현할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 후성 유전학 분야의 연구자들이 게놈 서열을 사용할 수 있는 비모델 또는 모델 유기체에 있는 게놈 전체 DNA 메틸화 변경을 탐구하는 수단을 제공했습니다. 온도에 민감한 효소를 사용하여 사용 중얼음에 보관하고 영하 20도 냉동고에 보관해야 한다는 것을 잊지 마십시오.표적 포획에 사용되는 RNA 구슬은 영하 80도 냉동고에서 사용 및 장기 저장 상태에서 얼음에 해동 및 저장이 필요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 PTSD 환자의 특징 neuroendocrine 기능의 영구적 인 변경 및 지연, 장기, 과장된 공포 반응을 보여 후 외상 후 스트레스 장애 (PTSD)의 쥐 모델을 설명합니다. 동물 모델과 여기에 설명 된 방법은 기계론의이지만 주변 흰색 혈액 세포의 생체과 함께, 환자로 측정 할 수없는 뇌 핵에 생체, 수를 상호 연관 유용합니다.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing은 시토신 중아황산염 변환과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 DNA 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 준비하는 방법입니다. 이 프로토콜은 50ng의 시작 물질이 필요하며 GC가 풍부한 게놈 영역에서 염기쌍 분해능 데이터를 생성합니다.

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

스트레스 저항은 장수의 특징 중 하나이며 유 전적으로 규율하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 장수 연구에 마우스 모델을 개발하기 위해있는 배아 줄기 세포에 스트레스 저항을 부여 돌연변이 선별 편견 높은 처리량 방법을 개발했다.

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면

자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.

화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

본 연구는 마이크로어레이 기술로 얻은 DNA 메틸화 데이터를 관리하기 위한 워크플로우를 기술한다. 이 프로토콜은 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르는 단계를 보여 줍니다. 모든 절차가 자세히 설명되어 있으며 비디오에서는 중요한 단계를 보여줍니다.

DNA 메틸화의 생물 정보학 분석에 대한 샘플 준비 : 비만 및 관련 특성 연구를위한 협회 전략

여기에 제시된 것은 뉴클레아제를 사용한 표적 절단 및 방출에 의한 근육 섬유의 전사 조절 연구에 적합한 마우스 사지 근육 위성 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분리를 위한 효율적인 프로토콜입니다(CUT&amp;RUN).

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&amp;RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

이 기사에서는 생쥐와 쥐에서 물리적 구속 스트레스를 사용하여 스트레스 반응을 유도하는 절차를 다룹니다. 설치류 모델에서 구속 응력을 선택하고 사용할 때 관찰해야 하는 추가 고려 사항에 대해 설명합니다.

생쥐와 쥐에 스트레스를 유발하기 위한 억제

이 프로토콜은 악티노마이신 D 처리, RT-qPCR, 비선형 회귀분석을 사용하여 마우스 배아 줄기세포 내 유전자 간 및 유전자 내 강화자 RNA의 안정성과 반감기를 정량적으로 측정합니다. 위치별 정규화 전략이 eRNA 붕괴 역학을 맥락 의존적으로 정확하게 모델링하기 위해 도입됩니다.

마우스 배아 줄기세포에서 증강제 RNA 안정성의 최적화된 정량적 평가

학습하세요 Methyl-Seq 방법을 이용하여 쥐 모델에서 만성 스트레스로 인한 DNA 메틸화 변화를 정량적으로 분석하는 기법을. 이 방법은 다양한 생리학적 조건에서 후성유전학적 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

쥐 메 틸-Seq 플랫폼 관련 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인 하

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