Name: 살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 FRET 기반 장력 센서와 FRAP 기술을 결합하여 힘에 민감한 단백질 역학을 측정하는 방법을. 이 기법은 빈칼린 같은 역학적 민감 단백질의 분자 수준 정보를 제공합니다.

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이 작품에서 미국 심장 협회 (16GRNT30930019) 및 건강의 국가 학회 (R01GM121739-01) 박사 Brenton 호프만 국민에 게 수 여 교부 금 뿐만 아니라 국립 과학 재단 경력 포상 (NSF-CMMI-14-54257)에 의해 지원 되었다 과학 재단 대학원 연구 장학금 Katheryn 다니는에 수 여. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NSF 나 NIH의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

저자는 공개 없다.

무서 워 졸라 메서드 힘에 민감한 단백질 역동성, 살아있는 세포 내부 직접 조사 하기 어려운 속성의 직접 측정 하기 위한 수 있습니다. 분자 중에 단백질 역동성의 감도 힘 송신기 또는 변환기로 단백질의 기능에 중대 하다. 로드는 내부적으로 생성 된 둘 다의 전송에 대 한 필요 그리고 외부에서 적용 된 힘, mechanotransmission, 라는 화학적 감지 신호로 그 세력의 변환에 대 한 mechanotransduction 라는. 그러나, 부하에 변경 단백질 바인딩된 유지 기간에 영향을, 따라서, 더 적은 시간 단백질 지출 베어링 부하, 힘 다른 단백질 전송 또는 화학적 감지 신호에 불리고 및 감지 하는 적은 기회가. 무서 워 졸라 메서드 교량에 광범위 한 셀룰러 컨텍스트 내에서 액세스할 수 힘 민감한 역학의 분자 규모 측정 함으로써 분자 및 세포 수준 사이 간격. 또한, 세포내 또는 세포 외 환경 화학적 또는 기계적으로 perturbing 동안 주의가 이러한 측정에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 다양 한 subcellul...

세포 외 셀 동작을 지정 하는 생 화 학적 및 물리적 단서의 풍부한 원천입니다. 특히,는 microenvironment의 물리적 특성 키 세포 기능, 세포 성장, 감 별 법1,2,3,4, 마이그레이션, 등 중재 수 있습니다. microenvironment의 역학의 Dysregulation 아직 없는 암5, 아 테 롬6, 섬유 증7등 적절 한 치료는 많은 질병에 중요 한 구성 요소입니다. 세포 화학적 감지 신호에 물리적 자극을 변환 하는 방법의 완벽 한 이해, 프로세스 mechanotransduction 되 나, 필요 힘 전송, 모두에 세포에서 중재 하는 분자 메커니즘의 해명 및 내 여러 subcellular 구조.
Subcellular 구조, 내부 단백질은 지속적으로 선회; 바인딩 고 강도 바인딩 파트너8와 그들의 상호 작용에 따라 바인딩. 물리적 거리에 걸쳐 성공적으로 전송 될 세력 단백질 단백질 상호 작용, 단백질의 매출 유지 하 고 그것의 바인딩 파트너9힘을 전송 하는 속도가 느린 해야 의미의 파손 되지 않는 사슬 해야 합니다. 상호 작용 다른 조건10, 에서 언바운드 상태로 전환 수 바인딩된 상태로 종종 개념 동안 단백질 단백질 상호 작용은 일반적으로의 여러 비-공유 결합 사이 단백질 도메인 구성, 11. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용을 위해 힘 "이상적인 본드" 라고 하는 상호 작용의 수명에 영향을, "슬립 본드" 라고 하는 상호 작용의 수명을 감소 또는 상호 작용의 수명을 늘릴 수는 가능 하다 "캐치 본드"10로 알려진. 따라서, 단백질 로드와 힘 민감한 역학 지칭 단백질 역동성 사이 복잡 한 관계가 이다.
채권 역학에 부하의 영향을 이해, 향해 매우 유익한 실험의 수 단일 분자 수준에서 수행 되었습니다. 고립 된 단백질, 또는 단백질 및 조작 기술이 자기 핀셋, 광학 핀셋, 원자 힘 현미경 검사 법의 파편을 사용 하 여,이 학문은 설명 했다 힘에 민감한 단백질 단백질 상호 작용에 관련 단백질11,12. 두 integrins13 및 cadherins14이 막 횡단 단백질 형성 세포-매트릭스와 세포 세포 상호 작용, 각각에 대 한 중요 한, 역학 때문에 변경 로드 설명 했다. 셀 내에, vinculin 힘 종속 방식에서 모두 중부15 와 α-catenin16 보충 하 고 말라17, 초점 유착 (FAs)와 외화 접합 (AJs에서 vinculin에 대 한 중요 한 역할을 나타내는 캐치 유대를 형성 수 있습니다. ) 부하. 단일 분자 연구 특정 단백질-단백질 상호 작용의 격리에 대 한 허용 하 고 모호 하지 않은 결과, 하지만 그들은 세포 환경의 복잡성에 대 한 계정을 하지 않습니다.
획기적인 실험 시연 AJs, FAs 등 여러 subcellular 구조, mechanosensitive, 고 전시 내부적으로 생성 또는 외부 적용 부하18,19에 향상 된 어셈블리 20,,2122. 또한, 몇 가지 이론적 모델 mechanosensitive 어셈블리 힘에 민감한 단백질 역동성23,,2425에 의해 구동 될 수 있는 제안 했다. 살아있는 세포 내에서 이러한 힘 민감한 역학 검사, 몇 가지 간접 접근 촬영 되었습니다. FRAP 및 관련된 기술 셀26,27,,2829단백질 역학을 측정 하기 위한 비교적 간단한 방법론을 제공 합니다. 그러나, 단백질 부하의 측정 더 제한 되었습니다. 일반적인 방법은 셀 전체 세포 수축8,,3031을 줄이기 위해 사용 cytoskeletal 억제제에 노출 없이 단백질 역동성을 비교할 것입니다. 개념적으로, 이것은 높은 부하와 낮은 부하 상태 사이의 비교입니다. 그러나, 거기 아무 정량화 부하의 단백질에서 어느 상태에 이며 억제제, F 걸 필 라 멘 트에 따라 키 바인딩 사이트의 손실 등의 의도 하지 않은 생 화 확 적인 효과 있을 수 있습니다. 또 다른 방법은, FAs, 관련 FA 견인 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 분자 부하 대략적인 FA32내 단일 단백질의 역학 관계를 조사 하 여 기판에 총 힘 노력을 측정 하고있다. 총 힘의 부 량이 접근이 방식을 사용 하면, 그것은 분자로 특정 정보를 제공 하지 않습니다. FAs는 많은 부하33을 견딜 수 있는 200 개 이상의 서로 다른 단백질의 구성 되어 있습니다. 따라서, 잠재적으로 FA의 총 힘 출력을 측정 여러 힘 전송 경로 가능성을 가린다 고 안정적으로 부하의 측정을 특정 단백질에 제공 하지 않습니다.
Mechanobiology에 이전 접근, 달리 무서 워 기반 긴장 센서의 출현 수 직접 생활 안에 특정 단백질에 의해 발생 하는 부하의 측정 셀34,,3536. 여기, 선물이 FRAP 기반 측정 단백질 역동성의 긴장 초조해 기반 센서를 결합 하는 프로토콜. 우리 졸라 무서 워 서이 기술을 참조 하십시오. 이 방법은 단백질 부하 및 살아있는 세포 (그림 1)의 힘에 민감한 단백질 역학 평가 되므로 단백질 역동성의 동시 측정을 수 있습니다. 이미, 무서 워 졸라 기술 기계 링커 단백질 vinculin37의 힘-민감한 역학의 연구에 적용 되었습니다. 장력 센서 다양 한 subcellular 구조에에서 관련 된 수많은 단백질을 위해 개발 되었습니다. 예를 들어 센서 vinculin34 와 중부38,39 FAs, cadherins 및 AJs40,,4142, 복잡 한 핵 링컨에서 nesprin에에서 catenins에 개발 되었습니다. 43, α-actinin44 , filamin36 , 골격 및 MUC-1는 glycocalyx45, 다른 사람 사이에46. 마찬가지로, FRAP 초점 유착8,31, 외화 접속점47, 말라 피26, 및 핵48mechanosensitive 단백질에 일반적으로 사용 되는 기술 사용 되었습니다입니다. 이러한 기존의 센서 또는 새로 무서 워 졸라 기술에 광범위 하 게 적용 해야 앞으로, 이동 센서, 다양 한 subcellular 구조 및 상황에에서 힘 민감한 역학의 측정에 대 한 수 있도록 개발. 이 끝, 무서 워 졸라 기술 적용이 다른 시스템에 구현 하기 위한 상세한, 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다. 바라 건 대,이 다양 한 실험 elucidating 다양 한 mechanosensitive 단백질 힘 전송 규제 및 셀 행동 중재의 역할을 수 있게 된다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>60x Objective NA1.35</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액(100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>자동화 단계</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIX3</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 이색성 거울</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>T450/514rpc</td></tr><tr><td>맞춤형 mTFP1 방출 필터</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET485/20m</td></tr><tr><td>맞춤형 mTFP1 여기 필터</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET450/30x</td></tr><tr><td>맞춤형 금성 여기 필터</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>ET514/10x</td></tr><tr><td>DMEM-gfp 라이브 셀 시각화 매체</td><td>사파이어</td><td>MC102</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td>, <td>L-글루타민 및 중탄산나트륨</td></tr><tr><td>태아 혈청</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, Human</td><td>Corning</td><td>47743-654</td><td></td></tr><tr><td>FRAPPA 캘리브레이션 슬라이드</td><td>Andor</td><td></td><td>, 515nm</td></tr><tr>레이저 <td>Andor</td><td></td><td></td>유리 바닥 플루오로 접시<td>가 있는 FRAPPA 시스템 FRAPPA 시스템과</td></tr> 함께 제공 <tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>HEK293-T 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>헥사디메트린 브로마이드, 폴리브레인</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>고포도당 Dulbecco의 변형 독수리 매체</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>JMP Pro 소프트웨어</td><td>SAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda 10-3 전동 필터 휠</td><td>Sutter Instruments</td><td>LB10-NW</td><td></td></tr><tr><td>LambdaLS 아크 램프 300W 오존이 없는 크세논 전구</td><td>Sutter Instruments</td><td>LS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Software</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph for Olympus</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 가습 시스템</td><td>Bioptechs</td><td>130708</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ 세포 분류기</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>대물 히터 매체</td><td>Bioptechs</td><td>150819-13</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 봉투 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRRL 벡터</td><td></td><td></td><td>선물 Kam Leong 박사 (컬럼비아 대학)</td></tr> <tr><td>psPax2 포장 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 카메라</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF 원심분리기</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Stable Z Stage Warmer</td><td>Bioptechs</td><td>403-1926</td><td></td></tr><tr><td>Venus Emission Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-571/72</td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

셀 감지 하 고 mechanotransduction를 호출 하는 과정에서 화학적 감지 신호에 기계적 자극을 변환 하 여 그들의 환경에서 실제 신호에 응답. Mechanotransduction에 중요 한 단계는 외부와 내부 환경 사이 힘의 전송 이다. 전송 세력, 지속적인된 끊어지지 물리적 결합 단백질-단백질 상호 작용의 일련에 의해 생성 되어야 합니다. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용에 대 한 기계적 부하 중 상호 작용에 아무런 영향을 가질 수 있습니다, 그리고 상호 작용의 더 빠른 분열에 또는 안정화 상호 작용. 살아있는 세포에 있는 단백질 회전율 차례로 elucidating mechanotransduction에서의 역할, 단백질의 기계적 상태에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다 지시 어떻게 분자 부하를 이해 한다. 힘에 민감한 단백질 역학을 측정 하기 위한 기존의 기술 단백질 부하의 직접 측정을 부족 하거나 세포 컨텍스트 외부에서 수행 하는 측정에 의존 합니다. 여기, 우리는 photobleaching (무서 워 졸라) 기술, 살아있는 세포 내에서 힘에 민감한 단백질 역학의 측정을 가능 하 게 후 포스터 공명 에너지 전송 형광 복구에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 잠재적으로 다양 한 subcellular 구조와 다른 세포 유형 힘에 민감한 단백질 역학의 연구를 촉진 어떤 긴장 무서 워 기반 센서에 적용 됩니다.

무서 워 FRAP 두 형광 기술 조합 구성, 무서 워 및 FRAP. 우리가 단백질 부하의 효과에 초점을 맞춘, 우리 무서 워 기반 긴장 센서34,46을 사용 하 고. 이 센서는 종종 긴장의 mTFP1와 VenusA206K, flagelliform 링커 (그림 1A)로 연결 하 여 두 개의 형광 단백질으로 구성 된 모듈을 감지 기반으로 합니다. 모듈 단백질의 머리와 꼬리 도메인 사이 위치 하는 경우는 단백질에 걸쳐가 해지는 부하를 측정 가능 하다. 무서 워 데이터를 분석할 때 수락자 채널에서 촬영 한 이미지는 긴장 센서 지역화 평가 및 농도,이 신호는 마세요 (그림 1B)의 독립. 무서 워 효율성의 계산 후 단백질 부하 쿨러 색상으로 무서 워 효율 감소 단백질 부...

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

이 방법은 세포와 그들의 환경 사이뿐만 아니라 세포 내에서 힘이 전염되고 감지되는 방법과 같은 메카노생물학 분야의 주요 질문에 대답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질이 살아있는 세포의 네이티브 문맥 내부의 기계적 힘에 어떻게 반응하는지에 관한 분자 규모 정보에 대한 액세스를 허용한다는 것입니다. 이 방법은 초점 접착 단백질 빈쿨린을 연구하기 위해 특별히 적용되었지만 탈린, 카데린 또는 네스프린과 같은 다른 기계적으로 민감한 단백질에도 적용될 수 있습니다.적절한 이미징 설정은 어렵지만 분석의 성공을 위해 필요하기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 원하는 셀 유형에서 장력 센서 구조의 안정적인 발현으로 이 절차를 시작합니다. 세포 시딩을 위해 기판을 준비하려면 35mm 유리 바닥 접시 4기를 획득하십시오.세포 배양 후드에서 일하는 15 밀리리터 원내 튜브에서 멸균 인산염 완충식식염용액 또는 PBS에서 밀리리터 섬유네틴 당 10 마이크로그램의 4밀리리터를 만듭니다. 튜브를 한 번 부드럽게 반전하여 혼합하고 용액이 세포 배양 후드에 5 분 동안 앉게하십시오. 그런 다음 각 유리 바닥 접시에 섬유 네틴 용액의 1 밀리리터를 파이펫.섬유네틴 용액을 실온에서 1시간 또는 하룻밤 동안 섭씨 4도에 둡니다. 그런 다음 섬유 네틴 용액을 흡인하고 PBS로 한 번 헹구세요. 세포가 파종 할 준비가 될 때까지 요리에 PBS의 1 밀리리터를 둡니다.세포를 세고 후, 종자 30, 000 세포는 1.5 밀리리터의 최종 부피에 적합한 완전한 매체를 가진 각 fibronectin 코팅 유리 접시에. 세포가 시드 후 4시간 동안 퍼지도록 합니다. 확산의 두 시간에, 성장 미디어를 흡인하고 이미징 미디어와 한 번 헹요.이미징 미디어의 1.5 밀리리터를 남겨주세요. 교정을 시작하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 현미경을 예열합니다. FRAP 레이저를 보정하려면 먼저 레이저 구성 창을 엽니다.샘플에 레이저 노출을 위한 적절한 FRAP 조명 설정으로 조명 설정을 설정합니다. 그런 다음 조명 설정을 수용자 형광소만 이미징에 적합한 조명 설정으로 설정합니다. 좌표 시스템 설정에서 보정할 목표를 선택합니다.교정 지점을 수동으로 클릭하고 보정 중에 이미지 표시를 확인합니다. Dwell 시간을 10, 000 마이크로초로 설정하고 펄스 수를 100으로 설정합니다. 이제 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 밀봉 된 에티듐 브로마이드로 만든 교정 슬라이드를 커버 슬립 사이드가있는 무대 어댑터에 놓습니다.수용자 조명 설정을 사용하여 슬라이드 표면에 초점을 맞추고 가장 밝은 신호가 있는 초점 평면으로 식별할 수 있습니다. 코팅의 작은 결함은 초점을 돕기 위해 볼 수 있습니다. 슬라이드를 이미징 평면을 가로질러 균일한 형광이 있는 영역으로 이동합니다.후속 교정을 위한 첫 번째 교정 또는 업데이트 설정에 대한 설정 만들기를 클릭합니다. 이 소프트웨어는 교정 프로세스를 초기화하여 표백된 점의 위치를 자동으로 표백하고 감지합니다. 최종 이미지를 평가하여 성공적인 교정을 보장하며, 이는 균일하게 분포되고 집중해야 하는 표백된 점의 3대 3 그리드가 됩니다.향후 참조를 위해 교정 이미지를 저장합니다. 교정 슬라이드를 제거하고 안전하게 보관합니다. 교정은 각 실험을 시작하기 전에 수행해야하지만 샘플 간에 수행 할 필요가 없습니다.살아있는 세포 화상 진찰을 위한 현미경 설정을 준비합니다, 바람직하게는 가열된 단계 및 객관적으로, 뿐만 아니라 이산화탄소 통제. 20분 동안 평형화합니다. 이제 장력 센서를 발현하는 세포의 생성 된 샘플 중 하나를 이미징을 위한 현미경 홀더에 배치하십시오.세포가 10분 동안 평형화되도록 합니다. 이미지 된 세포의 건강을 보장하기 위해 이미징 챔버에서 섭씨 37도에서 온도를 유지합니다. 연동 펌프를 사용하여 분당 15 밀리리터의 시료위에 가습된 5%의 이산화탄소를 전달하여 pH를 유지합니다.다차원 수집 또는 MDA 도구를 열고 다양한 필터 세트를 포함하여 FRET 이미징 매개 변수로 설정합니다. 이 MDA를 MDA_FRET_date 이름으로 실험 폴더에 저장합니다. 다양한 필터 세트, 타임랩스 설정 및 저널을 포함하여 FRAP 이미징 매개 변수를 사용하여 다른 MDA를 설정하여 표백제 전 획득 후 레이저를 펄스합니다.이 MDA를 MDA_FRAP_date 이름으로 실험 폴더에 저장합니다. 화면 상단의 도구 모음에서 저널을 선택하고 녹음을 시작합니다. MDA 창을 열고 MDA_FRET_date 상태를 로드하고 획득을 누릅니다.그런 다음 MDA_FRAP_date 상태를 로드하고 획득을 누릅니다. 수집이 끝나면 화면 상단의 도구 모음에서 저널을 선택하고 녹화를 중지합니다. 이 저널을 FRETFRAP_date 이름으로 실험 폴더에 저장하고 쉽게 액세스할 수 있도록 도구 모음에 추가합니다.MDA 창을 닫습니다. 획득에서 이미지 수집을 사용하여 샘플을 탐색하고 노출 시간을 최소화하고 중립 밀도 필터를 획득하여 관심 있는 셀을 식별합니다. 장치, 초점으로 이동하여 연속 자동 초점을 설정합니다.올바른 이미징 평면에 도달할 때까지 샘플을 수동으로 집중합니다. 연속 초점 집합을 클릭하고 시스템이 조정될 때까지 기다립니다. 시스템이 조정되면 연속 초점 시작을 클릭합니다.그런 다음 관심 있는 구조에 명확한 국소화를 사용하여 장력 센서를 표현하는 셀을 찾아 이미지를 스냅합니다. 표백위치를 강조하기 위해 직사각형 관심 영역(ROI)을 그립니다. 이 ROI 위치를 저장합니다.이제 FRET 이미지 의 수집을 시작하고 FRAP 타임랩스의 초기화가 시작되는 FRETFRAP_date 저널을 초기화합니다. 10~15개의 이미지 집합을 획득할 때까지 이러한 단계를 반복합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 FRET-FRAP 데이터를 분석합니다.여기에 비쿨린 장력 센서의 FRET 이미징에 대한 대표적인 결과이며, 세분화 및 마스킹을 통해 초점 접착을 분리합니다. 빈쿨린 하중의 간격 적 변화는 셀 전체에서 볼 수 있습니다. FRAP 이미징 및 분석은 초점 접착 안정성에 의해 영향을 받을 수 있습니다.이미징 기간 동안 빠르게 배분되는 초점 접착은 정확하게 추적하기가 어려울 수 있습니다. 종종 이것은 불연속성을 포함하고 해석할 수 없는 FRAP 곡선으로 표시됩니다. 야생 형 빈큘린의 경우, 단백질 부하와 이직률 사이에 는 비분별 상관 관계가 있으며, 이는 비카린이 힘에 의해 안정화되었음을 나타냅니다.탈린에 대한 결합을 발휘하기 위해 빈쿨린에 돌연변이를 도입하면 상관 관계의 반전이 초래되며, 이는 탈신을 결합할 수 없는 빈분린이 힘에 의해 불안정하다는 것을 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안, 제대로 샘플을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다, 세포가 내인성 수준에서 센서를 표현하고 신중하게 이미징 매개 변수를 선택하는 것을 확인. 이 절차에 이어, 면역형광, 세포 규모 역학 측정 또는 다양한 억제제로 도전적인 세포와 같은 다른 방법은 관심의 단백질이 다른 아세포 구성 요소와 상호 작용하는 방법과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 동영상은 형광 변동 분광법(fluorescence fluctuation spectroscopy)을 사용하여 세포 간 접촉에서 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 형광 단백질로 표지된 관심 대상인 막관통 접착 수용체를 발현하고 스펙트럼으로 분리된 두 개의 형광 표지를 가진 두 개의 서로 다른 세포 집단을 혼합함으로써, 서로 다른 색의 형광을 가진 두 인접 세포의 수용체 간의 trans-interaction은 형광 강도 변동의 교차 상관관계를 통해 평가됩니다.

세포 접촉에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

이 비디오는 폴리에틸렌 글리콜 고정 금 나노 입자와 DNA 헤어핀 장력 프로브를 사용하여 면역 세포가 가하는 수용체를 평가하는 방법을 보여줍니다. CD8 양성 T 세포 상호 작용은 프로브 풀림을 트리거하여 형광을 방출하는 반면 잠금 가닥은 면역 세포가 가하는 힘을 정량화하기 위한 신호를 유지합니다.

DNA 기반 장력 프로브를 사용하여 면역 세포가 가하는 수용체 힘 평가

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

이 문서는 와이드필드 형광 현미경 검사를 사용하여 모바일, 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET) 기반 프로브의 현면 분석을위한 방법을 제시한다. 새로 개발된 소프트웨어 툴킷을 사용하면 정확한 FRET 효율과 분자 위치를 포함한 움직이는 프로브의 smFRET 시간 추적을 시간의 함수로 판단할 수 있습니다.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

배우세요 살아있는 세포에서 FRET 기반 장력 센서와 FRAP 기술을 결합하여 힘에 민감한 단백질 역학을 측정하는 방법을. 이 기법은 빈칼린 같은 역학적 민감 단백질의 분자 수준 정보를 제공합니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

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