Name: 3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 학습하세요 다층 중간엽 줄기세포 시트 구축 방법을 동적 관류 시스템과 DBP 스캐폴드를 활용하여. 이 기술은 세포 영양 공급을 개선하고 재생의학에서 치료 효과를 높입니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 31771064);에 의해 지원 되었다 과학 및 기술 계획 프로젝트의 광 동성 (보조금 번호 2013B010404030, 2014A010105029, 및 2016A020214012); 과학 및 기술 계획 프로젝트의 광저우 (보조금 번호 201607010063); 그리고 학부 혁신 및 기업가 정신 교육 프로그램 (보조금 번호 201610559028); 젊은 과학자의 중국 (부여 번호 31800819)는 국립 과학 재단.

모든 줄기 세포 및 동물 실험 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가 가이드의 윤리 지침에 따라 실시 되었고 제 남 대학교 동물 관리 및 사용 위원회 (광저우, 중국)에 의해 승인.
1. PLA2 Decellularization와 DPP 발판의 준비 방법14
주: PLA2 decellularization 방법의 회로도 대 한 그림 1A 를 참조 하십시오.
<ol><li>100 mL 200 U/mL PLA2 솔루션의 준비. 탄산 버퍼 솔루션의 198 mL에 0.5 g의 나트륨 deoxycholate 및 PLA2 의 2 개 mL를 추가 합니다. 이 솔루션의 준비 후 24 시간 안에 사용 되어야 한다.</li>
	<li>도살에서 신선한 돼지 심장 막 (FPP)을 얻습니다 그리고 1 시간 이내 실험실 돌아갑니다. 참고:는 FPP 저장 되어야 한다 4 ° C에서 수송 하는 동안. 단계 1.2 1.10 온도 제어 물 욕조에 지속적인 동요와 함께 실시 한다.</li>
	<li>철저 하 게 세척 1% 페니실린-스 10 ° Cfor 10 분에 500 mL 비 커에 포함 된 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)의 200 mL와 FPP 2 x이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>FPP는 2 개의 층으로 분할 하 고 집게와가 위 지방 조직 제거 합니다. 참고: 모든 20 분의 지방 조직을 제거 하는 동안 PBS의 50 mL를 추가 하 여 젖은 FPP 유지.</li>
	<li>가 위는 FPP 10 x 10 cm2 조각으로 모양. 워시 200ml 탄산 버퍼 솔루션 (CBS)의 2 배가이 단계를 반복 하는 10 분에 대 한 1% 페니실린-10 ° C에서 500 mL 비 커에 스를 포함와 FPP.</li>
	<li>순수한 물에는 FPP를 전송 하 고 12 h 10 ° C에서 그것을 담가.</li>
	<li>200 U/mL PLA2 와 6 h 37 ° C에서 0.5% (w/v) 나트륨 deoxycholate 솔루션을 포함 하는 CBS의 50 mL 10 x 10 cm2 샘플을 담근 다.</li>
	<li>이 단계 2 x 10 분 반복 10 ° C에서 1% 페니실린-스를 포함 하는 CBS와 샘플을 씻으십시오.</li>
	<li>200 U/mL PLA2 , 2 h 37 ° C에서 0.5% (w/v) 나트륨 deoxycholate 솔루션을 포함 하는 CBS의 50 mL에 각 샘플을 담근 다.</li>
	<li>워시 샘플 2 h. 반복 10 ° C에서 1% 페니실린-스를 포함 하는 CBS와 10 x에 대 한이 단계 적어도. 샘플 평면 접시에 놓고 55 ° c.에 오븐을 일정 한 온도에서 일정 무게를 건조 참고: 샘플 완전히 건조 해야 합니다. 무게 DPP 샘플 마다 10 분 하 고 반복 하는 3 배 또는 무게까지 더 이상 변경.</li>
	<li>판형으로 각 DPP 샘플 10.5 m m 직경 원형으로 모양. 살 균 밀봉된 봉투에 각 DPP를 팩.</li>
	<li>감마 방사선 (kGy 25)에 의해 DPP 샘플을 소독. 사용 하기 전에 4 ° C에서 DPP 샘플을 저장. 참고: 모든 샘플은 4 ° c.에 6 달까지 동안 저장 될 수 있다</li>
</ol>2. 셀에 대 한 준비 시트 건설
<ol><li>오토 클레이 브 모든 악기와 121 ° C에서 조직 캐리어 구성 요소 1.5 mL 원심 튜브, 겸 자를 포함 하 여 30 분, 집게가 위, 이빨에 대 한 흑인 기지 (조직 캐리어 구성 요소), 그리고 백색 긴장 반지 (조직 캐리어 구성 요소).</li>
	<li>무 균 10% 자당 해결책의 20 mL를 준비 합니다. 자당의 2 세대 무게와 초순 물 18 mL에 자당 분해. 30 분 또는 0.22 μ m 필터 필터 솔루션에 대 한 121 ° C에서 10% 자당 해결책 압력솥.</li>
	<li>고압 가스를 포함 하 여 30 분 동안 121 ° C에서 동적 관류 시스템 장치 교환 장비, 500ml 유리병, 관류 문화 컨테이너 및 연결 튜브.</li>
	<li>압력가 마로 소독 기기 및 조직 캐리어 구성 요소를 준비 합니다. 문화 접시에 조직 캐리어의 검은 기본 부분을 넣어.</li>
	<li>말린된 DPP 비 계를 선택 하 고 검은 기지의 중심에 그것을 넣어. 민 비 계에 흰색 긴장 반지를 넣고 조직 캐리어에 그것을 해결. 참고: 확인 발판은 완전히 조직 캐리어에 고정 블랙 기지와 흰색 긴장 반지 사이 차이가 있다. 그렇지 않다면 조직 캐리어를 분리 하 고 다시 발판을 해결.</li>
	<li>재 위한 DPP 발판에 문화 매체의 100 µ L를 추가 합니다. 참고: 발판 조직 캐리어에 잘 고정 하지 않습니다, 경우 문화 매체 문화 접시에 침투 됩니다.</li>
	<li>37 ° C 배양 기에는 비 계를 넣고 15 분 동안 담가 수 있습니다.</li>
</ol>3. 셀 시트 건설에 대 한 셀의 준비
참고:이 프로토콜은 100 mm 접시를 사용 하 여 세포 배양. 다층된 셀 구조 건설의 회로도 그림 1B 를 참조 하십시오.
<ol><li>BMSCs13를 격리 합니다. 참고:이 메서드는 다중된 MSC 셀 시트를 건설 하기 위한 설계 되었습니다. 쥐 BMSCs이이 프로토콜에 사용 됩니다. BMSCs는 전체 골 부착 방법을 사용 하 여 격리 되며는 BMSCs 확장 된 시험관에 충분 한 셀 크기를.<ol>
<li>고압 121 ° C에서 30 분, 집게,가 위, 이빨된 집게, 등 악기. 2 mL 주입 주사기와 BMSC 문화 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 [DMEM], 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 및 1% 페니실린-스)를 준비 합니다.</li>
		<li>자 궁 경부 척추 전위에 의해 3 주 된 남성 Sprague-Dawley (SD) 쥐를 안락사. 100 mL 비 커 5 분에 75% 알코올 솔루션의 동물을 담근 다.</li>
		<li>비 커에서 동물을가지고 고 작업 테이블에 발생 하기 쉬운 장소. 집게와가 위는 동물의 뒷면에 피부를 incise. 피부와 근육 조직을 노출 허벅지 화관을 격리 합니다.</li>
		<li>허벅지 화관을 분리 하 고 30 mL PBS의 50 mL 원심 분리기 튜브에서에 넣어. 1 개의 관으로 두 허벅지 화관을 놓습니다. 원심 분리기 튜브 조직을 철저 하 게 씻어 소용돌이. 2 x이이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>가 위는 화관의 양쪽 끝을 잘라 고 골 수 구멍을 노출.</li>
		<li>BMSC 문화 매체의 2 개 mL를 주입 주사기와 발음. 골 수 구멍에 바늘을 삽입 하 고 문화 매체와 골 수 밖으로 플러시. 한 100 m m 문화 접시에 모든 두 허벅지 화관 밖으로 플러시.</li>
		<li>각 100 m m 문화 요리 문화 접시에 배양의 2 개 mL를 추가 합니다. 문화 요리 72 h에 대 한 정적 문화와 37 ° C 배양 기에 넣어.</li>
		<li>인큐베이터에서 문화 접시를 꺼내. 신선한 문화 매체의 6 mL에는 상쾌한을 바꿉니다.</li>
		<li>기본 BMSCs 현미경으로 관찰 합니다. 이것 다음, 모든 5-7 d는 BMSCs 통로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인큐베이터에서 세포를 가져가 라. 현미경으로 세포를 관찰 하 고 셀 시트 건설에 대 한 적합 한 셀을 선택 합니다. BMSCs에 도달 80%-90% 합류, 시드 셀으로 셀을 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>문화 요리에서 문화 매체를 제거 합니다. 부드럽게 따뜻한 PBS의 2 mL로 세포 세척. 문화 요리에서 모든 PBS를 제거 하 고 확실히 더 액체 남아. 접시에 0.25 %trypsin (또는 다른 출신과 솔루션)의 2 개 mL를 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>문화 매체의 2 개 mL를 추가 하 여 트립 신 효과 중지 하 고 부드럽게 씻어 접시에서 셀. 새로운 15ml 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. Centrifugate 225 x g 5 분에 셀.</li>
	<li>제거는 상쾌한. 10% (w/v) 자당 솔루션의 3 mL와 함께 셀 resuspend 참고: 다음 단계에서 균일 한 셀-히드로 혼합물을 얻기 위하여 세포를 씻어 10% (w/v) 자당 솔루션 사용 됩니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 10 µ L 발음과 hemocytometer와 셀 번호. 다음 단계에 필요한 볼륨을 계산 합니다. 한 셀 시트, 3 백만 BMSCs 사용 됩니다.</li>
	<li>3 백만 세포를 추출 하 고 새로운 15ml 원심 관으로 그들을 전송. 5 분에 대 한 225 x g 에서 셀 원심</li>
	<li>제거는 상쾌한. 10% (w/v) 자당 해결책의 1 mL와 함께 셀 resuspend 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 참고: 셀 하이드로 겔 혼합물을 준비 도움이 됩니다 1.5 mL 원심 튜브를 사용 하 여.</li>
	<li>원심 260 xg 에서 셀에 대 일 분 완전히 제거는 상쾌한 셀 앙금을 얻을.</li>
</ol>4. 준비는 BMSCs는 RAD16의-나 펩 티 드 히드로 혼합물
주: 다층된 셀 구조 건축의 설계도 대 한 그림 1B 를 참조 하십시오.
<ol><li>1.5 mL 원심 관에 10% (w/v) 자당 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 resuspend는 BMSCs 하 고 균일 한 현 탁 액. 참고:는 물의 resuspension 동안 모든 거품을 생성 하지 않습니다.</li>
	<li>RAD16의 20 µ L 추가-난 펩 티 드 하이드로 겔 현 탁 액의 상단에. 부드럽게 저 어는 RAD16-나 피 펫 팁과 펩 티 드와 셀 서 스 펜 션. 세포 현 탁 액 및 히드로 함께 혼합 되어, 부드럽게 플라스틱 혼합물 몇 번.</li>
	<li>조직 캐리어에서 DPP 발판에 밖으로가 고 부드럽게 피 펫 팁 문화 매체를 발음. 주: DPP 비 계는 완전히 셀 하이드로 겔 혼합물을 추가 하기 전에 리하이드레이션 된 확인 하십시오.</li>
	<li>혼합물을 발음 하 고 균등 하 게 DPP 비 계에 그것을 추가. 참고: 혼합물의 전체 볼륨에 대 한 될 것 이라고 40-50 µ L. 발판의 외부에는 센터에서 한 번에 혼합 10 µ L을 추가 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>조직 캐리어의 하단에 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다. 5 분 동안 37 ° C 배양 기에서 셀 시트를 넣어.</li>
	<li>인큐베이터에서 셀 시트를 꺼내. 부드럽게 문화 접시에 배양의 4 mL를 추가 하 고 셀 시트를 담가. 정적 문화의 2 h 37 ° C 배양 기에서 셀 시트를 넣어.</li>
</ol>5. 동적 문화 시스템을 사용 하 여 3 차원 다층된 셀 시트의 생체 외에서 문화
참고: 3D 동적 시스템의 회로도 그림 1C 참조.
<ol><li>연동 펌프, 가스 교환 장비, 500ml 유리병, 관류 문화 컨테이너 및 연결 튜브를 포함 하 여 동적 관류 시스템을 준비 합니다. 그림 2와 같이 동적 관류 시스템을 조립.</li>
	<li>문화 매체의 200 mL 소독 유리 병에 추가 합니다. 문화 컨테이너의 챔버에 셀 시트를 삽입 합니다. 참고: 셀 시트의 상부 표면 방향에 주의.</li>
	<li>조직 컨테이너에 문화 매체의 3 개 mL를 추가 하 고 컨테이너를 닫습니다. 인큐베이터에서 동적 관류 시스템을 넣고 펌프를 시작. 연동 펌프의 유량 8 mL/분 문화에로 설정 셀 시트 48 h에 대 한 동적 관류 시스템.</li>
</ol>6. 취득 다층된 MSC 셀 시트
<ol><li>고압 기기 및 조직 캐리어 구성 요소 1.5 mL 원심 관, 이빨된 집게, 집게, 등 30 분 동안 121 ° C에서.</li>
	<li>컨테이너에 문화 매체의 공급 중지 유리 병에서 입력된 덕트를 당겨. 참고: 때 문화 컨테이너 비어 연동 펌프를 중지 합니다.</li>
	<li>문화 컨테이너에서 셀 시트를 꺼내와 문화 접시에 그것을 넣어.</li>
	<li>한 집게를 사용 하 여 조직 캐리어를 고정 하 고 다른 이빨된 집게를 사용 하 여 검은 기지에서 흰색 긴장 반지를 구분. 마지막으로, 다중된 BMSCs 셀 시트를 구하십시오.</li>
	<li>짧은 보존에 대 한 각 셀 시트는 집게와 원심 1.5 mL 튜브에 전송 수 있습니다. 민 비 계 원심 튜브의 내부 벽에 붙어 있어야 한다 고 셀 시트 전파 한다 원심 분리기 튜브에 가능한 한 많이 밖으로.</li>
	<li>부드럽게 셀 시트 몰입할 원심 관에 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다. 원심 관의 뚜껑을 닫고 4 ° c.에 셀 시트 저장 참고: 셀 시트 이식 하거나 최대한 빨리 분석 되어야 한다. 4 h 이내 셀 시트를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

현재 프로토콜 다층된 MSC 시트를 생성 하는 효율적인 방법을 보고 합니다. 이 셀 시트는 최적의 기계적 강도, 높은 셀 시드 밀도, 및 유리한 줄기 세포 bioactivity를 전시 한다. 예를 들어 BMSCs를 사용 하 여, 3 차원 셀 구조는 신속 하 게 구성 RAD16-나 펩타이드 하이드로 겔. 동적 관류 시스템에서 경작 되 고, 후 다층된 BMSC 시트 성공적으로 획득 하 고는 BMSCs 줄기 세포 표식의 높은 식 유지.
임시 다층된 셀 구조를 건설 하는 것은 프로토콜의 중요 한 단계입니다. RAD16-난 상업 히드로 펩 티 드, 그리고 1% 아미노산 및 99% 물으로 구성 됩니다. 여러 연구 보고이 펩 티 드 히드로 ECM 자연을 모방 수 있습니다 줄기 세포 증식과 생존15,,1617에 대 한 도움이 됩...

줄기 세포 치료; 많은 질병에 대 한 효과적인 치료로 보고 되었습니다. 그러나, 낮은 세포 보존 및 대상 영역 내에서 가난한 생존 기존의 줄기 세포 주입을 다음과 같은 중요 한 문제 남아 있다. 이 문제를 해결 하려면 조직 공학 과학자 셀 시트 기술 개발. 그대로 세포 외 매트릭스 monolayered 셀 시트 온도 응답 문화 접시1을 사용 하 여 첫째로 준비 되었다 그리고 그것의 후속 연구 보고 줄기 세포 보존 및 infarcted는 내 생존의 중요 한 개선 지역2,3. 방법 중에서 다층된 셀 시트 구성 보고 되었습니다 셀 생존과 셀 시트 치료 효과3,4를 개선 하기 위한 효과적인 전략으로. 그 이후, 과학자 들은 셀 금액, 줄기 세포 속성 및 셀 시트의 기계적 성질을 향상 시키기 위해 다른 셀 시트 공법을 개발 했습니다. 지금까지 특정 유형의 셀 시트 건설 되 고 심근 경색5, 연골 부상6, 치료에서 공부 하 고 피부 상처7.
줄기 세포 이식 전에 bioactivity 손상된 조직 재생에 새로운 영향 그리고 다른 셀 시트 건설 전략 줄기 세포에 다른 효과가지고. 한 손으로, confluent 셀 시트, 고밀도 줄기 세포만 이루어져 고 자연 세포 외 매트릭스 스태킹 monolayered 셀 시트8 하거나 자기 조직 공학 기법9를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 다른 한편으로, 연구원은 적절 한 기계적 강도 제공 하 여 세포 성장10,11,12, 허용 되도록 영양 밀도 시드 낮은 줄기 세포 지원 다른 건설 기계 개발 공급. 그러나, 이러한 방법에도 불구 하 고 다층된 셀 시트 구조 내에서 낮은 효율적인 영양 공급 체 외에 건설 기간 동안 주요 관심사 남아 있습니다. 따라서, 효율적이 고 실현 가능한 셀 시트 건설 시스템이 급히 필요 합니다.
이 프로토콜 multilayeredmesenchymal 줄기 세포 (MSC) 셀 시트를 준비 하는 단계를 설명 합니다. 이 건설 시스템에서 셀 시트 기계적 강도 DPP에 의해 제공 됩니다. 이 비 계에 따라, 3D 셀 구조 건설 수 있습니다 신속 하 게 RAD16와 함께-난 펩 티 드 히드로, 동적 관류 시스템 문화 다층된 셀 시트 3D 셀 시트 구조를 안정화 하 고 충분 한 영양을 제공 하기 위해 사용 된다 셀에 대 한 공급입니다. 이 시스템을 사용 하 여, 다층된 BMSC 시트 성공적으로 준비 하 고 쥐 심근 경색 모델13에 대 한 최적의 치료 효과 전시.

<table><tbody><tr><td>포스포리파제 A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6534</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충제</td><td>Gibco BRL</td><td>89033</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 / 암포테리신&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>15640055</td><td></td></tr><tr><td>완충기 중탄산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>테이블 농축기</td><td>Changzhou Aohua Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KT20183 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>남미 태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>10270-106/P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>코닝 셀그로</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신/2.21 mM EDTA</td><td>코닝 셀그로</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>바이오 안전성 캐비닛</td><td>에스코, 싱가포르</td><td>AC2-2S1</td><td></td></tr><tr><td>항온 인큐베이터&nbsp;</td><td>Esco, Singapore</td><td>CLS-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>EP 튜브</td><td>Axygen</td><td>31617934</td><td></td></tr><tr><td>원심 기계</td><td>TOMOS</td><td>1-16R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>푸라 매트릭스&nbsp;</td><td>BD</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>동적 관류 배양 시스템</td><td>Minucells 및 Minutissue</td><td>D-93077</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Ismatec</td><td>IPC N8</td><td></td></tr><tr><td>펌프 튜빙</td><td>Ismatec</td><td>Nr.1306</td><td></td></tr><tr><td>MINUSHEET 1300&nbsp;</td><td>레겐스부르크</td><td></td><td>티슈 캐리어 부품&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET</td><td>레겐스부르크</td><td></td><td>동적 관류 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0006</td><td>레겐스부르크</td><td></td><td>가스 교환 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0002</td><td>레겐스부르크</td><td></td><td>500 mL 유리병&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 1301</td><td></td><td></td><td>관류 배양 용기&nbsp;</td></tr></tbody></table>

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

줄기 세포 치료 보여줍니다 유망한 재생성 하는 손상 된 장기 및 조직, 미래 및 셀 시트 기술 낮은 세포 보존 및 대상 영역 내에서 가난한 생존을 향상 시키기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 생체 외에서 건설 과정 중 줄기 세포 bioactivity를 유지 하 고 셀 시트 내의 셀 금액 증가 대 한 솔루션은 절실히 필요 합니다. 여기,이 프로토콜은 유리한 줄기 세포 bioactivity와 최적의 운용성 다층된 셀 시트를 만들기 위한 메서드를 제공 합니다. Decellularized 돼지 심장 (DPP) 셀 시트 발판으로2 (PLA2) decellularization 메서드 phospholipase에 의해 준비 되 고 쥐 골 수 중간 엽 줄기 세포 (BMSCs) 절연 및 시드 셀으로 확장. 임시 다층된 셀 시트 구조는 RAD16를 사용 하 여 건설-나 펩타이드 하이드로 겔. 마지막으로, 셀 시트 동적 관류 시스템을 3 차원 (3D) 구조를 안정화할와 교양 그리고 셀 시트는 48 시간 문화에 체 외에얻을 수 있었습니다. 이 프로토콜 다층된 줄기 세포 시트를 건설 하기 위한 효율적이 고 실현 가능한 방법을 제공 하 고 셀 시트 유리한 줄기 세포 치료 제품으로 미래에 개발 될 수 있습니다.

다층된 줄기 세포 시트 건설의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. PLA2 decellularization 메서드에 의해 셀 시트 발판을 준비 하는 것은 첫 번째 단계입니다. 발판을 바탕으로, RAD16-1 펩 티 드 히드로와 줄기 세포를 혼합 하 여 임시 3D 셀 구조는 건설 한다. 유리한 줄기 세포 bioactivity와 최적의 기계적 강도 다층된 셀 시트를 얻으려면 셀 시트 동적 관류 시스템에 양식입니다. 동적 영양 공급에서 줄기 세포는 증식 하 고 다층된 셀 시트 셀 연락처 설정 허용 되 고 ~ 24-72 최종 안정 다층된 셀 시트 제품을 얻을 수 있습니다-시간 재배.
이 경우에, 셀 시트 발판 DPP PLA2 decellularization 방법에 의해 준비 된다. ...

이 문서에는 유리한 줄기 세포 재산으로 다층된 줄기 세포 시트를 건설 하기 위한 효율적이 고 실현 가능한 방법을 제공 합니다.

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

줄기 세포 치료는 널리 많은 질병에 대한 유망한 치료로보고되고있다. 그리고 세포 시트 기술은 세포의 유지및 표적 내의 생존을 향상시키기 위하여 개발되었습니다, 너무. 세포시트 시공 중, 영양 공급부족은 줄기세포의 기능 상실에 대한 주요 문제점으로 남아 있으며, 만족스럽지 못한 줄기세포 특성이 마침내 생체내 치료효과에 영향을 미칠 것이다.사용 가능한 다층 줄기 세포 시트 제품을 준비하는 우리의 목적, 우리 팀은 세포 극성, 심낭 및 세포 시트 스캐폴드를 개발했습니다. 스캐폴드에 기초하여 다층 세포 스타터는 비단펩티드 수소로 신속하게 시공될 것이며, 역학 관류 시스템은 체외에서 줄기 세포의 영양 공급을 보장하기 위해 사용된다. 말린 DBP 스캐폴드를 꺼내 검은 색 베이스의 중앙에 놓습니다.DBP 스캐폴드에 백색 장력 링을 넣고 조직 담체에 부착합니다. DBP 스캐폴드가 조직 담체에 완전히 고정되어 있는지 확인합니다. DBP 스캐폴드에 100마이크로리터 배양 배지를 추가합니다.비계를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣고 15분 간 담가 둡니다. 인큐베이터에서 세포를 꺼내 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 따뜻한 PBS의 2 밀리리터로 세포를 부드럽게 씻으십시오. 문화 접시에서 모든 PBS를 제거하고 액체가 남아 있지 않은지 확인하십시오.접시에 1.25%의 트립신 용액에 2밀리리터를 넣고 3분간 세포를 배양합니다. 두 밀리리터 배양 배지를 추가하여 트립신 효과를 중지합니다. 접시에서 셀을 부드럽게 씻습니다.새로운 15 밀리리터 원심 관에서 세포 현탁액을 전달합니다. 원심분리기는 5분 동안 220배의 중력으로 세포를 원심하여 세포 퇴적물을 얻습니다. 상체를 제거하고 셀 퇴적물을 닦아냅니다.다시 3 밀리 리터 10% 자당 용액으로 세포를 일시 중단. 흡면 10 마이크로 리터 세포 현탁액, 및 함량 세포 번호는 혈류계를 읽고, 3 백만 개의 세포를 추출하고 새로운 1.5 밀리리터 원심 튜브로 전송합니다. 원심분리기는 5분 동안 220배 제곱근으로 세포를 원심하여, 슈퍼나티를 완전히 제거하고 세포 퇴적물을 얻습니다.20 마이크로리터 10% 자당 용액을 준비합니다. 부드럽게 세포를 다시 중단하고 균일 한 현탁액을 얻을 수 있습니다. 서스펜션 상단에 20 마이크로리터 펩타이드 하이드로 젤을 부드럽게 혼합하고, 세포 현탁액을 T와 혼합하고, DBP 스캐폴드를 꺼내 티슈 캐리어를 떠난 다음, 혼합물을 T.Aspirate로 부드럽게 흡인한 다음 혼합물을 흡인시키고 DBP 스캐폴드에 고르게 첨가한다.티슈 캐리어 의 바닥에 1 밀리리터 칼슘을 넣습니다. 문화 접시에 밀리리터 문화 매체 4개부드럽게 넣은 다음 셀 시트를 나옵니다. 2 시간 동안 인큐베이터에 세포를 넣어 배양하자.동적 관류 시스템에는 가스 교환 재분과 유리 병이 있는 관류 배양 용기가 포함됩니다. 어셈블리는 그림과 같이 동적 관류 시스템입니다. 유리 병에 하이드로 밀리리터 배양 중앙분리대 2개를 추가합니다.배양 용기의 챔버에 셀 시트를 삽입하고, 용기에 3 밀리리터 배양 중앙값을 추가하고, 인큐베이터에 동적 관류 시스템을 넣고 펌프를 시작합니다. 양양성 리컴벤트에서 배양 용기를 엽니다. 배양 용기에서 셀 시트를 꺼내 배양 접시에 넣습니다.하나의 포셉을 사용하여 조직 담체를 고정하고 다른 두 개의 집게를 사용하여 흰색 장력 링을 검은 색 베이스에서 분리하십시오. 마지막으로 다층 셀 시트를 가져옵니다. DBP 스캐폴드는 투명합니다.SEM 재판매는 캡처된 대학과 구성 요소가 완전히 예약되어 있음을 보여줍니다. 세포 시트는 짧은 보존을 위해 집게에 의해 얻어지고 보유할 수 있다. 이 세포 시트는 1.5 밀리리터 실린드리폼 튜브로 전송될 수 있었다.예를 들어 줄기 세포 마커 CD 9O 및 CD(29)에 대한 BMFC의 매우 양성의 세포 표시로 시작하는 모델. 세포 건설 후 BMFC의 셀 시트를 떠나는 것은 CD 90 및 CD 29의 높은 확장 수준남아있다. 다계층 셀 구조를 구성하는 것은 프로토콜의 중요한 단계입니다.팬 시간은 PH 값이 SA에서 중립으로 변경될 때 4개의 하이드로 겔이 필요하므로, 표면 이온을 제거하기 위해 자당 용액으로 세포를 세척하는 것이 중요하다. 또한, 세포 현탁액과 판티하이드로겔의 부피 비율은 임시 다층 구조를 구성하는 데 좋은 친구가 아니다. 3D 줄기세포 구조의 형성 후, 다층 구조를 안정화하고 줄기세포 비부채를 유지하는 데 동적 관류 시스템이 중요하다는 것을 알 수 있다.배양 중앙값의 동적 침투는 줄기 세포가 다층 구조 내에서 세포 컨텍스트를 증식하고 추정하는 것을 용이하게 할 수 있으며 또한 다른 줄기 세포 유형에 따라 동적 배양 온도계를 조정해야 한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

이 비디오는 3차원 골격 내에서 인간 신경 줄기 세포의 발달과 분화를 보여줍니다. 골격의 라미닌 코팅은 세포 부착을 촉진하고, 성장 인자를 사용하지 않는 신경 매질은 세포가 신경 전구 세포로 분화되도록 유도하여 다공성 구조 내에서 여러 방향으로 프로세스를 확장하여 3차원 배양을...

다공성 스캐폴드를 사용하여 인간 신경 줄기 세포를 3D 배양으로 분화

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

이질적인 세포 집단을 가진 하중지지 조직의 엔지니어링 및 분석은 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 하나의 구조 내에서 다양한 세포 집단의 공동 배양을 위한 플랫폼으로서 이중층 알기네이트 하이드로겔 디스크를 만드는 방법을 설명합니다.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

여기에서는 힘줄 기초 연구를 위한 유망한 도구이자 힘줄 조직 공학을 위한 잠재적인 스캐폴드 없는 방법을 제공하는 3단계 오가노이드 모델(2차원[2D] 확장, 2D 자극, 3차원[3D] 성숙)을 시연합니다.

Human Dermal Fibroblast를 이용한 Self-Assembled Cell Sheet Culture 및 3D Tendon/Ligament-like Organoid의 수동 생성 시연

여기에서는 나노섬유막 기반 2층 시스템에서 섬유아세포로 배양된 상피 세포가 어떻게 막에 안정적으로 부착하고 성장할 수 있는지 보여줍니다.

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

학습하세요 다층 중간엽 줄기세포 시트 구축 방법을 동적 관류 시스템과 DBP 스캐폴드를 활용하여. 이 기술은 세포 영양 공급을 개선하고 재생의학에서 치료 효과를 높입니다.

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

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