Name: 고해상도 무늬 Biofilm 증 착을 사용 하 여 pDawn-Ag43 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 광학 자극을 이용한 고해상도 바이오필름 리소그래피 방법으로 Escherichia coli를 정밀하게 패턴화하는 기술입니다. 이 기법은 바이오필름 공학과 합성생물학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 그들의 도움이 제안 및 그들의 confocal 현미경에 접근을 위한 Spormann 연구소에 대 한 디, H. 김, N. Cira, A. Choksi, S. 라 잔, 유리와 B. 키를 감사합니다. 또한, 저자는 장학, 건강의 국립 연구소 (R21-인공 지능-139941), 그리고 미국 암 협회 (RSG-14-177-01) 스탠포드 바이오 X Bowes NSERC PGS에서 지원을 인정합니다.

1. pDawn-Ag43 세균성 긴장의 준비
<ol><li>PDawn-Ag43 (그림 1)의 E. 콜라이 긴장에 변환.<ol>
<li>LB 국물 문화 관 (~ 250 rpm, 37 ° C에서 떨고 인큐베이터)에서 1 박의 50 μ g/mL spectinomycin (파운드 + 사양)와 보완에 긴장을 접종 하 여 (플라스 미드 저장소에서 얻을 수) pDawn-Ag43 플라스 미드를 호스팅 복제 스트레인 성장. 그런 다음 miniprep 키트를 사용 하 여 순화 pDawn Ag43 플라스 미드10수확.</li>
		<li>패턴화 될 관심의 E. 콜라이 긴장을 선택 합니다. 지금까지, pDawn-Ag43 MG16553 , BW25113에서 작동 하도록 검증 되었습니다.</li>
		<li>만든된 프로토콜을 사용 하 여 유능한 생성 (예를 들어, 화학적으로 유능한11 또는 electrocompetent12) 선택의 E. 콜라이 긴장 (예, MG1655).</li>
		<li>PDawn-Ag43 플라스 미드는 유능한 박테리아11,12, 1 h 회복과 접시 파운드 + 사양 한 천 배지에서 다음 변환. 37 ° c.에 하룻밤 성장 식민지 허용</li>
	</ol>
</li>
	<li>스토어 pDawn Ag43 변형 긴장.<ol>
<li>PDawn-Ag43는 파운드에서의 단일 식민지 예방 + 파운드에 한 천 배지를 사양 + 문화 관에서 국물을 사양 고 지 수 단계 (OD600 ~0.4-0.8) (~ 250 rpm, 37 ° C)에서 떨고 인큐베이터에서 성장.</li>
		<li>곳을 알아내는-튜브 25% 글리세롤 냉장고 재고를 50% 살 균 글리세롤의 1 mL와 문화의 1 mL를 혼합 하 여 장기-80 ° C에서 pDawn Ag43 변형 긴장을 저장 하는 주식을 준비 합니다. -80 ° C 냉장고에 이것을 저장 합니다.</li>
		<li>12 pDawn Ag43에서 변형 변형 및 변환 과정11 반복 추가 플라스 미드 (예를 들어, 형광 기자 플라스 미드) 변형 될, 유능한 세포11,를 만들 필요가 있는 경우 , 필요에 따라 추가 플라스 미드에 대 한 12 . 참고: electroporation8를 사용 하는 경우 수는 cotransform 여러 플라스 미드 (를 포함 하 여 pDawn-Ag43) 동시에; 그러나, 동시 변환을 권장 하지 않습니다 화학 변환 방법을 사용 하 여 대형 (> 10 kB) pDawn-Ag43의 변환 효율성은 감소 것을 의미.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 조명 박테리아에 대 한 프로젝터 광학 설치의 준비
<ol><li>케이블, 휴대용 프로젝터 피팅 하 고 세균 인큐베이터, 내부 작동을 전달 하기 위한 불투명 벽과 구멍 세균 인큐베이터를 가져오고 노트북 프레 젠 테이 션-투영 (참조 테이블의 소프트웨어를 갖춘 재료). 선택할 때 프로젝터 및 인큐베이터는 프로젝터의 최소 초점 거리 보다 작으면 인큐베이터의 내부 높이 확인 합니다.</li>
	<li>상승, biofilm 문화 챔버가 천장에 연결 (그림 2) 직접 인큐베이터 안에 프로젝터 가리키는 조리개와 함께 아래에 놓습니다.</li>
	<li>수직 포스트에 연결 된 광학 브레드보드 기본으로 설정을 구성 하 여 장소에 프로젝터 수정 차례로 가로 게시물에 어떤 나사에 연결 프로젝터 (그림 2). 참고가이 설정 프로젝터/사용 가능한 부품에 따라 수정할 수 있습니다. 궁극적으로, 주요 요구 사항이입니다 프로젝터 위쪽으로 가리키는 조리개와 인큐베이터, 아래쪽 단단하게 고정 됩니다.</li>
	<li>인큐베이터 안에 프로젝터는 노트북을 통해 디스플레이 케이블 (예를들면, HDMI) 연결 합니다.</li>
	<li>경우는 표면-특히 천장-반사 (예를 들면, 금속 광택된 표면), 인큐베이터의 내부는 어두운 매트 표면 반사를 최소화 하기 위해 함께 그들을 커버.</li>
	<li>테이프를 사용 하 여 빈 '더미' 문화 접시 인큐베이터의 천장에 연결할. 프로젝터, 문화 접시; 연결할 여러 허용 방법 있다, note 문화 실, 조명 발생의 투명 한 바닥 표면 적용 되지 않습니다 확인 하십시오.</li>
	<li>초점 비행기 아래쪽 표면에 biofilm 문화 요리 (예를 들어, 잘 플레이트)의 인큐베이터 (그림 2)의 천장에 연결 된 일치 되도록 초점 손잡이 선회 하 여 프로젝터의 초점을 조정 합니다. 프로젝터는 문화 접시의 바닥에 날카로운, 비-모호한 이미지를 밝게 한다. 투영은 최적화 되었습니다 일단 '더미' 문화 접시를 제거 합니다.</li>
	<li>최대 블루 조명 전체 시야를 밝히는 프로젝터를 직접 노트북 소프트웨어를 사용 하 여 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]) 전체 블루 슬라이드를 제시 하 여.</li>
	<li>매칭 머리 인큐베이터 천장에 배치 하 고 해당 전원 측정기 빛 파장 460 nm 보정에 강도 읽고 여 광 파워 미터를 사용 하 여 프로젝터 조명 강도 측정 합니다. 연결 하 고 사용 하는 특정 전원 측정기에 대 한 매칭 보정에 지시를 따릅니다.<ol>
<li>주변광을 줄일 (예를 들어, 방 조명, 해제 하거나 인큐베이터 광원에서) 조명 강도 측정을 하기 전에 가능한 만큼 많이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>프로젝터 조리개에 조정 가능한 중립적인 밀도 필터를 사용 하 여 조명 강도 조정 합니다. 블루 빛 예상된 지역 중심의 조명 강도 50 μW/c m2를 읽습니다 때까지 파워 미터에 의해 측정 된 조명 강도 조절 하는 필터를 회전 합니다. 참고: 소프트웨어 끝에 파란색 RGB 값을 사용 하 여 조명 강도 조정할 수 있지만 사용 하 여 필터를 조명된 vs 사이 시스템의 광학 대조를 극대화의 장점이 파란색 RGB 가치를 극대화 하는 동안. 어두운 지역.</li>
	<li>노트북에 프레 젠 테이 션/프로젝터 소프트웨어를 사용 하 여 임의의 패턴을 그릴 하 고 프로젝터를 사용 하 여 보육의 천장에 이러한 패턴을 표시 합니다. 참고: 최대 블루 조명으로 그린 한다 Biofilm 형성 지역 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]), 아무 조명 biofilm 형성 비 지역 (예를 들어, RGB = [0, 0, 0]).</li>
</ol>3. 꽃무늬 Biofilms 경작
<ol><li>조명, 이전 pDawn Ag43 박테리아, 그들은 안정적으로 조명 (그림 3A)에 대 한 후반 지 수 성장 단계에서 유도 된다 그래야 글리세롤 냉장고 재고에서 시작을 준비 합니다.<ol>
<li>글리세롤 재고에 파운드 + 사양 한 천 배지에서 pDawn Ag43 긴장을 행진. 성장 하는 식민지를 허용 하룻밤 (37 ° C). 참고: 여기에서 조명 문화 단계까지, 셀에에서 머물 수 있도록 어둠 최대한-주변 조명 (예를 들어, subdilution에 대 한)에서 짧은 기간 동안 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>파운드에서 한 천 배지에서 pDawn Ag43 박테리아의 식민지 예방 + 국물 사양 성장 하 고 문화 (~ 16 h ~ 250 rpm, 37 ° C에서 떨고 인큐베이터)에서 고정 단계로 하룻밤.</li>
		<li>Subdilute 파운드와 1:1,000의 비율로 문화 + 국물 사양 (예, 신선한 파운드 + 사양의 1 mL에 1 μ의 숙박 문화를 추가).</li>
		<li>Subdiluted 문화 후반 지 수/초기 고정 단계 (OD ~ 1.0, 떨고 인큐베이터에서 ~ 6 h ~ 250 rpm, 37 ° C)까지 성장 하는 것을 허용 한다.</li>
		<li>성장 하는 문화를 기다리는 동안 준비와 1 x M63 소금, 1mm MgSO4, 포도 당 0.2%, 0.1 %casamino 산, 물에서 50 μ g/mL spectinomycin M63 미디어 (구성 부품은 멸 균 확인).</li>
		<li>M63 미디어 50 μ g/mL spectinomycin 보충 1: 100의 비율로 후반 지 수 상 문화를 subdilute. 그런 다음, biofilm 문화 접시에 희석 소개 (예를 들어, 잘 격판덮개로 희석된 샘플 플라스틱). 참고:이 1: 100 subdilution에 필요한 볼륨 사용 되 고 문화 요리에 따라 달라 집니다 (예를 들어, 6-잘 폴리스 티 렌 잘 접시 [비-조직-문화 치료], 한 샘플을 사용 하는 경우 필요로 문화의 20 μ M63 + 사양의 2 개 mL를 추가 합니다 6 잘 플레이트의 표준 잘 볼륨은 ~ 2 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플은 지금 조명에 대 한 준비, 테이프 표면 접시의 바닥에는 조명을 위한 투명 아래에서 프로젝터에 의해 보장 인큐베이터의 천장에 문화 접시. 참고: 인큐베이터의 천장 반사, 길 잃은 조명을 최소화 하는 보장 하기 위해 중요 하다.입니다. 길 잃은 조명 또한 감소 될 수 있다 문화 찬으로 블랙 벽 격판덮개를 사용 하 여 비록이 엄격 하 게 필요 하지 않습니다-같은 접시를 사용 하는 경우 확인 하단 표면 투명.</li>
	<li>밤새 인큐베이터 (16 h 없이 떨고, 37 ° C에서)에 문화에 biofilms를 허용 합니다. 참고 일부 프로젝터 높은 온도에서 덜 안정 되. 경우, (예를 들어, 30 ° C), 낮은 온도에서 문화 염두에 두고 부 화 시간, E. 콜라이 긴장에 따라 증가 할 수 있습니다 유지.</li>
</ol>4. 영상 Biofilms 꽃무늬
<ol><li>밤새 성장의 biofilm 샘플 후 인큐베이터에서 문화 접시를 제거 합니다. 접시 위의 액체 매체에서 분산 planktonic 박테리아로 서 어디 그것은 조명 되어, biofilm 박테리아의 하단 표면에 부착 된 있을 것 이다.</li>
	<li>Planktonic 셀 (예를 들어, 부드럽게 한 피 펫과 발음으로) 문화 접시에서 액체 미디어를 제거 하 여 삭제 합니다.</li>
	<li>샘플 2 린스 부드럽게, PBS에 pipetting으로 나머지 planktonic 세포 (그림 3B)를 제거 하는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션 x 뒤 포부.</li>
	<li>셀 태그 붙일 경우 직접 형광 현미경 검사 법13 (예, 넓은 필드13, 3 차원 confocal14, 등)를 사용 하 여 샘플 이미지. 참고: 형광 biofilms 수 또한 유지 자경 설치 매체를 사용 하 여. Biofilm 샘플 미디어를 장착 한 방울을 적용, 아래, 모든 거품을 잡으려고 하지 돌보는 유리 coverslip로 그것을 커버 하 고 하룻밤 이미징 하기 전에 강화 있습니다.</li>
	<li>사용 하는 세균성 세포 붙일 태그가 지정 되지 이미징 이전 크리스탈 바이올렛 얼룩 기법15 biofilm 대비 향상을 (그림 3B)를 적용 합니다.</li>
</ol>5. 프로토콜 수정/대안
<ol><li>다른 표면에 pDawn Ag43 박테리아를 성장.<ol>
<li>유리 또는 폴 리 디 메 틸 실록 산 (PDMS) 쿠폰 (예, coverslips 또는 PDMS의 얇은 스트립) 세균 샘플/조명의 추가 전에 잘 접시에 놓고 따라 동일한 프로토콜 이전과 패턴 pDawn ag43 biofilms에 유리 하 고 PDMS입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>투명 하 고, 동봉 된 문화 내부 pDawn Ag43 박테리아를 성장.<ol>
<li>PDMS 위한 문화 챔버 형을 생성 합니다.<ol>
<li>기본적인 문화 챔버, 하드, 직사각형 프리즘 (프리즘 PDMS 몰드 캐스팅 되 면 문화 챔버 역할에 캐비티를 될 것입니다) 평평한 표면에 부착 하 여 금형을 생성 합니다. Note 더 복잡 한 문화 챔버 형 소프트 리소 그래피16를 사용 하 여 날조 될 수 있다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PDMS 몰드에 붓는 고 치료할 수 있도록 PDMS 캐비티 캐스팅 (자세한 소프트 리소 그래피 프로토콜 정돈의 과학 교육 데이터베이스16참조).</li>
		<li>치료, 후 어떤 초과 PDMS 트림, 구멍/문화 챔버로 입구/출구 채널 펀치 하 고 평평한 표면 위에 PDMS 표면 사이 구멍을 떠나 단단히 눌러 평평한 표면 (예를 들어, 유리/폴리스 티 렌)에 캐비티를 채권 및 biofilm 문화 약 실로 PDMS 천장입니다. 참고: 더 영구적인 결합 플라즈마 치료16 에 따라 사용할 수 있습니다, 하지만 칩 다음 되지 않습니다 재사용.</li>
		<li>PBS 버퍼 (그림 3C)와 문화 챔버/린스에 세균 샘플을 소개 (대신 피 펫) 무딘 팁 바늘 주사기를 사용 하 여 앞으로 문화 프로토콜을 따릅니다.<ol>
<li>일시적으로 보 세 구멍을 사용 하는 경우를 액체 에/아웃 캐비티 내부 유리/폴리스 티 렌 표면에서 unbonded 되지 않습니다 수 있도록 챔버의 유일한 부정적인 압력을 사용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>영화 포토 마스크를 사용 하 여 구조적된 조명에 대 한 pDawn Ag43 박테리아를 성장.<ol>
<li>영화 포토 마스크 프린터/인쇄 서비스와 호환 CAD 소프트웨어를 사용 하는 biofilm 패턴 디자인. 다른 곳에서 포토 마스크 필름 디자인은 지역에 biofilm 인쇄할 수 의미는 명확 하 고 검정/불투명 이어야 한다입니다. 완료 되 면 프린터/인쇄 서비스에 포토 마스크 파일을 전송 하 고 실제 포토 마스크의 반환을 기다리고 있습니다.</li>
		<li>최대 블루 조명 전체 시야를 밝히는 프로젝터 지시 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]) 노트북 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
		<li>더 큰 영화 포토 마스크, 테이프 biofilm 문화의 하단에 직접 그것은 야간 조명 (그림 3D)에 대 한 세균 샘플 소개 전에 접시에서 관심 영역을 잘라. 이전과 biofilms 문화 고 이미징 이전 경작 후에 포토 마스크를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial Biofilms.</a> Annual Review of Microbiology. 49 (1), 711-745 (1995).</li>
<li>Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+commensalism+and+competition+in+a+two-species+microbial+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium.</a> Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).</li>
<li>Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li>
<li>Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dusk+till+dawn%3A+one-plasmid+systems+for+light-regulated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression.</a> Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+high-density+bacterial+colony+arrays+and+patterns+by+the+ink-jet+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).</li>
<li>Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Biofilm+Formation+Reveals+A+Mechanism+for+Structural+Heterogeneity+in+Bacterial+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).</li>
<li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
<li>Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+biofilm-based+materials+from+engineered+curli+nanofibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres.</a> Nature Communications. 5, 4945(2014).</li>
<li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13, 515-523 (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5062/plasmid-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5060/bacterial-transformation-electroporation">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5040/introduction-to-fluorescence-microscopy">General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer Science & Business Media. New York, NY. (2010).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. 47, e2437(2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5790/soft-lithography">Bioengineering. Soft Lithography.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li>
<li>Kac, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKac%2C+E+%22Signs+of+Life%3A+Bio+Art+and+Beyond%22">Signs of Life: Bio Art and Beyond</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (2007).</li>
<li>Lee, S. A., et al. <a target="_blank" href="https://dl.acm.org/citation.cfm?id=2702220">Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation.</a> Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).</li>
<li>Cira, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Biotic+Game+Design+Project+for+Integrated+Life+Science+and+Engineering+Education%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education.</a> PLOS Biology. 13 (3), e1002110(2015).</li>
<li>Bybee, R. W. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.393.8657&rep=rep1&type=pdf">The next generation science standards and the life sciences.</a> Science and Children. 50 (6), 7(2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Biofilm 구조 제어를 허용 하는 연구 도구에 대 한 필요성에 비추어 우리는 pDawn-Ag43 optogenetic 구문을 사용 하 여 박테리아 biofilms 패턴화를 위한 사용 하기 쉬운 프로토콜을 제시 했습니다. 이 기술로 대장균 biofilms 광학 25 μ m 아래 공간 해상도 함께 동봉 된 챔버를 포함 하 여 다양 한 표면 환경에 꽃무늬 될 수 있습니다.
전반적으로,이 프로토콜 세분화 될 수 있습니다 4 개의 주요 섹션으로: pDawn Ag43 박테리아의 준비 (1), (2) 광학의 준비 및 문화 설정 하드웨어, (3) 사전 조명 세균성 성장 단계, 및 (4) 후 조명 린스와 영상입니다.
섹션 1의 중요 한 부분은 관심의 E. 콜라이 긴장으로 pDawn Ag43 플라스 미드의 성공적인 변환. 이 높은-품질 순화 된 플라스 미드를 분리 하 고 생성 하는 변환에 대 한 높은-품질 유능한 세포에 의해 촉진 된다 (표 1, 문제 해결).
섹션 2의 중요 한 부분을 조명 강도 50 μW/cm2 460 nm 파장에 조정 되 고 프로젝터 제대로 biofilm 샘플 높이에 초점을 맞춘 프로젝터 설정의 최적화입니다. Note이 프로토콜에서 우리는 거꾸로 조명 설정 어디 프로젝터 빛나는 빛 아래에서, 위쪽으로 향해 biofilm 샘플 설명. 이 설정의 장점은 빛만 해야 한다는 biofilm 형성 표면에 도달 하기 전에 문화 접시의 바닥을 통해 여행. 조명 빛은 성장 과정 중 흐리고 planktonic 셀으로 가져옵니다 biofilm 표면 위에 액체 매체를 통해 여행 하는 의미에서. 이러한 우려 뿐만 아니라 그것은 또한 예를 들어 인큐베이터의 내부에 반사 표면을 취재 하 여 광학 설정 가능한 만큼, 길 잃은 빛을 최소화 하는 것이 중요-이 선명한 꽃무늬 biofilms를 얻을 하는 데 도움이. 관련된 메모에서 선명 biofilm 패턴 또한 조명 패턴 (그림 3D, 그림 4C)를 제어 하는 포토 마스크를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 문제 해결을 요구 하는 일반적인 문제는 컴퓨터 소프트웨어 뿐만 아니라 프로젝터 신뢰성 문제는 biofilm 성장 (예, 30 ° C) 낮은 온도에서 배양 하 여 최소화 될 수 있다, 더 높은 온도 (예, 37 ° C)에서 포함 하는 운영 체제 업데이트 또는 하룻밤 성장 (표 1) 중에 필터링 하는 푸른 빛을 발생 합니다. 그것은 또한 중요 하, 프로젝터 및 인큐베이터 모델 사용, 따라는 것도 가능한 프로젝터에서 생성 된 열 인큐베이터 설정 수정 해야 할 수 있는 온도 보다 높은 실내 온도에서 발생 합니다.
전에 그들은 조명에 의해 유도 된다 제 3의 중요 한 부분 안정적이 고 반복 가능한 세균 샘플을 얻는 이다. 이러한 이유로 것이 좋습니다 한 천 배지에서 그들을 밖으로 줄이 다음 되도록 박테리아 조명/유도 반복에 후반 지 수 성장 단계에서 액체 문화 단계를 사용 하 여 pDawn Ag43 박테리아의 클론 식민지를 방식 으로입니다.
마지막으로, 제 4의 중요 한 부분을 철저 하 게, 하지만 또한 부드럽게 씻어 프로토콜; 패턴화 biofilm 후 남은 planktonic 셀은 따라서, PBS와 여러 부드러운 린스 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.
셀 패턴5,에 대 한 기존 기술에 비해6, 패턴에 따라 pDawn Ag43 광학 biofilm를 사용 하려면 항목의 합리적으로 낮은 장벽에가지고 소, 깨끗 한 객실 시설, 복잡 한 필요 하지 않습니다. 화학, 또는 표면 전처리, 패턴 제작 기술로 일반적으로 관련 된 높은 해상도 (25 μ m)와 수은 아직. 메서드를 사용 하면 진 식17을 제어 하기 위한 세균성 사진 평판에 대 한 이전 작업을 확장 합니다. 현재, pDawn-Ag43 플라스 미드 복제, pUC 기반 근원 사용 하지만 pDawn와 Ag43는 둘 다 다른 (그람 음성) 세균성 종에 호환 대장균, 제한 됩니다. 유전자 기술 잠재적으로 소개 하는 다른 세균 종 빛 규제 biofilm 형성에 대 한 사용할 수 있으며, 미래 연구에 대 한 가능한 방향을 나타냅니다. 기술은의 또 다른 잠재적인 한계 그것 약한 네이티브 biofilm 형성 (예, MG1655 대장균) 긴장에 biofilm 형성을 증가 시켜 작품 이다. 그러나, 강력한 네이티브 biofilm 형성 된 종자는 제외 패턴된 biofilm 형성 여기; pDawn-Ag43 설명 된 대로 사용 하 여 조명 조건에 biofilms 양식 아직 optogenetic 기술을 여전히 biofilm 형성 조절에 적용 가능한 증명할 수 있습니다. 우리는 다른 문맥에서 biofilm 패터 닝의 대체 방법을 통해 광 c-디-GMP 변조18등, 사용할 수 있습니다는 주의.
전반적으로, pDawn-Ag43 기반 패터 닝 하는 기능1 에 biofilm 구조의 영향을 조사 하 고, 따라서, biofilm 패턴화 가변 제어에서 혜택을 수 있는 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 적절 한 될 것입니다-특히 관련 강조 하기 위해 예 biofilms2미생물 생태학의 연구 이다. 미래 방향 패턴된 바이오8,9 또는 구조적된 세균성 지역 사회를 만드는 포함 됩니다. 대체이 액세스할 수 있는 프로토콜의 또한 애플리케이션으로 바이오 아트19, 공식 및 비공식 생명 과학 교육20,,2122뿐만 아니라 분명히 미적 가능성, 주어진 있다. 교육의 관점에서 여기에 설명 된 프로토콜 많은 관련 기술 (세균성 문화, 변환, 광학/optogenetics)를 결합 한 제품 이며 또한 하였으므로 연장 (예를 들어, 마이크로 포함).

Biofilms, 미생물의 표면에 부착 된 사회 이며 그들의 강한 구조-기능을 위해 유명 하다. 공간 형상과 biofilms의 패턴화 재생 중요 한 역할 전체 커뮤니티 기능 (와 반대로)1. 작은 길이 조정 biofilm 구조에 참여-수십 미크론2순서-어려운 문제를 패턴화 하는 biofilm의 가변 및 편리한 컨트롤. 여기 우리는 biofilms 광학 조명에 따라 정확 하 게 패턴된에서 임의의 형상 되도록 허용 하는 프로토콜을 보여 줍니다.
여기에 제시 된 프로토콜 사용 하 여 pDawn-Ag433, Ag43의 식 운전 하 여 대장균 박테리아에 biofilm 형성 광학 조명에 커플 optogenetic 구문 (는 adhesin 유전자 표면 접착 biofilm에 대 한 책임 대형) pDawn4 (광학 조명에 의해 제어 transcriptional 규칙)의 통제. 방법은 사용 하기 편리 하 고 다양 한에 패턴 biofilms 환경, 동봉된 (투명 한) 문화 챔버를 포함 하 여 표면 수 있습니다. 드롭릿 기반 증 착5 또는 표면 prepatterning/치료6, 등 기존 세포 증 착 방법에 비해 pDawn Ag43 뒤틀림 또는 클린 룸 시설을 필요 하지 않습니다. 그리고 그 이상의 재료를 필요로 하지 않습니다. 일반적인 미생물학 실험실을 사용할 수 있습니다. 그것은 자연스럽 게 기존에 microcolonies의 공간 크기를 접근 25 μ m 아래 공간 해상도 패턴 수 biofilms2. 전반적으로,이 기술은 biofilm 구조는 다음 세균성 지역 사회7microecology를 공부 하는 많은로 조작 하는 기능을 제공 합니다. 또한, 패턴된 biofilms 유용한 바이오8,9하는 편리한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서 우리 biofilms pDawn Ag43를 사용 하 여 패턴에 필요한 기본적인 프로토콜을 토론 하 고 잠재적인 수정 및 메서드에 관련 문제 해결.

<table><tbody><tr><td>DH5alpha/pDawn-Ag43</td><td>Addgene</td><td>107742</td><td>DH5alpha 클로닝 균주 pDawn-Ag43 플라스미드 - 플라스미드</td></tr>는 <tr><td>MG1655 E. coli</td><td>Coli Genetic Stock Center - Yale University</td><td>CGSC #6300</td><td>MG1655를 본 논문의 대표적인 결과에서 관심 있는 E. coli 균주로 사용함</td></tr><tr><td>RFP 발현 플라스미드</td><td>iGEM biobricks</td><td>J04450-pSB4K5bb</td><td>형광 세균을 얻기 위한 많은 옵션이 존재합니다 - 플라스미드를 사용하는 경우, 백본이 pDawn-Ag43</td></tr><tr><td>Plasmid miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>LB 국물 분말</td><td>Affymetrix</td><td>75852</td><td>물에 20 g/L를 추가하고, 오토클레이브를 추가하고, 50 &mu를 추가합니다. 멸균 LB + spec LB 한천 분말을 얻기 위해 g / mL spectinomycin</td></tr><tr><td></td><td>Affymetrix</td><td>75851</td><td>물에 35 g / L를 추가하고, 오토 클레이브, 50 &mu를 추가합니다. g/mL 스펙티노마이신, 페트리 접시에 붓고 멸균 LB+사양 플레이트를 얻습니다</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>431760</td><td></td></tr><tr><td>스펙티노마이신 염산염 펜타하이드레이트</td><td>abcam</td><td>ab141968</td><td>물에 1000x 스톡 50mg/mL 만들기, 필터 살균 및 필요에 따라 매체로 희석</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>물과 1:1 비율로 혼합, 오토클레이브 또는 필터로 살균하여 50% 글리세롤 획득</td></tr><tr><td>M63 매체 염 5X 용액</td><td>Bio-world</td><td>705729</td><td>cas-amino acids, glucose 및 MgSO4를 첨가하고 멸균수 Casamino acids를 첨가하여 1X 염 농도로 가져옵니다</td></tr><tr><td></td><td>Amresco</td><td>J851</td><td>20 %를 물에 저장하고, 여과 살균 및 보충제로 M63에 첨가 (최종 농도 0.1 %)</td></tr><tr><td>D- 포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>20%의 재고를 물에 넣고, 여과하여 살균하고 M63에 보충제로 첨가하십시오 (최종 농도 0.2%)</td></tr><tr><td>. 마그네슘 황산</td><td>염 Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td>은 <td>물에 1 M 재고를 만들고, 오토클레이브를 사용하여 M63에 보충으로 첨가하십시오 (최종 농도 1 mM)</td></tr><tr><td>Crystal violet&nbsp;</td><td>Acros 유기물</td><td>212120250</td><td>사용하기 전에 물에 0.1%로 희석</td></tr>합니다. <tr><td>자체 경화 장착 매체(Shandon immumount)</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td>형광 이미징을 위해 장기간 샘플을 보존하는 데 사용합니다</td></tr>. 인<tr><td>산염 완충 식염수(PBS) 용액&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>분말/정제 6웰 플레이트로 제조된 PBS도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>351146</td><td>대표적인 결과를 위한 생물막 배양 접시로 사용</td></tr><tr><td>PDMS 키트</td><td>Dow</td><td>SYLGARD 184</td><td>소프트 리소그래피를 사용하여 밀폐된 마이크로 챔버 캐비티를 만드는 데 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD 주사기</td><td>309659</td><td>밀폐된 마이크로 챔버를 사용한 액체 취급에 사용</td></tr><tr><td>무딘 팁 바늘</td><td>CML 공급</td><td>901-23-050</td><td>1mL 주사기에 부착</td></tr><tr><td>실험실 테이프</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901</td><td>인큐베이터 천장에 배양 챔버를 부착하는 데 사용</td></tr><tr><td>박테리아 인큐베이터</td><td>Sheldon Manufacturing</td><td>SMI6</td><td>인큐베이터의 내부 높이가 프로젝터를 천장에 초점을 맞출 수 있을 만큼 충분히 높은지 확인</td></tr><tr><td>휴대용 프로젝터</td><td>Ivation IV-PJ-PRO-4-1</td><td></td><td>많은 휴대용 프로젝터 모델이 존재하며, pDawn-Ag43은 LED/레이저 기반을 포함한 여러 모델로 테스트되었으며, 450-460nm 중심 파장 범위의 청색광 채널</td></tr> 광학 <tr><td>브레드보드 베이스</td><td>ThorLabs</td><td>MSB6</td><td>베이스는 프로젝터를 고정하기 위한 광학 설정을 위한 베이스 - 다른 많은 설정 가능, 인큐베이터 바닥에 프로젝터를 단단히 고정하고 위쪽을 가리키기만 하면 됩니다.</td></tr><tr><td>광학 포스트</td><td>ThorLabs</td><td>TR8</td><td>2 개의 포스트 필요 - 하나는 브레드 보드 베이스에서 수직으로 확장되어 설정, 다른 하나는 직각 클램프를 통해 수평으로 부착</td></tr><tr><td>광학 포스트 직각 클램프</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>수직 및 수평 포스트</td></tr><tr><td>연결 마운팅 베이스</td><td>ThorLabs</td><td>BA1S</td><td>광학 브레드 보드 베이스와 수직 포스트</td></tr><tr><td>연결 1/4"-20 나사</td><td>ThorLabs</td><td>SH25S050</td><td>수직 포스트를 마운팅 베이스에 부착, 마운팅 베이스를 브레드보드 베이스에 부착</td></tr><tr><td>1/4"-20 고정 나사</td><td>ThorLabs</td><td>SS25E63D</td><td>삼각대 나사 구멍을 통해 수평 포스트를 프로젝터에 연결</td></tr><tr><td>광학 파워 미터</td><td>Newport</td><td>840</td><td>프로젝터 조명 강도를 측정하기 위해 파워 미터 감지기와 함께 사용 - 많은 파워 미터 모델이 존재하며 확장 가능한 감지기를 사용하면 측정</td></tr><tr><td>이 용이해집니다.광학 파워 미터 감지기</td><td>Newport</td><td>818-UV</td><td>파워 미터에 연결 (위) - 청색광이 가시 범위 내에 있으므로 UV 감지기가 반드시 필요하지 않음</td></tr><tr><td>조정 가능한 ND 필터</td><td>K & F 개념</td><td>SKU0689</td><td>조정 가능한 (회전) 중립 밀도 필터 - 프로젝터 조리개 위에 배치</td></tr><tr><td>프레젠테이션 - 프로젝터 소프트웨어</td><td>Microsoft</td><td>Powerpoint</td><td>그림 / 프리젠 테이션을 허용하는 모든 소프트웨어는</td></tr><tr><td>CAD 소프트웨어로</td> 충분합니다 <td>Autodesk&nbsp;</td><td>AutoCAD</td><td>포토마스크 설계에 사용되며 많은 마스크 인쇄 서비스가 AutoCAD 파일과 호환됩니다.</td></tr><tr><td>필름 포토마스크</td><td>Fineline Imaging</td><td>해당 없음</td><td>고해상도(>30000DPI) 필름 포토마스크 인쇄를 위한 많은 포토마스크 프린터 서비스가 존재합니다</td></tr>.</tbody></table>

고해상도 무늬 biofilm 증 착을 사용 하 여 pdawn-ag43

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

공간 구조와 패턴 박테리아 biofilms에서 중요 한 역할을 재생합니다. 여기 높은 공간 해상도에서 임의의 공간 패턴으로 대장균 biofilms 경작에 대 한 접근 방법을 설명 합니다. 기술은 유전자 인코딩된 optogenetic 구문을 사용 하 여-pDawn-Ag43-그 푸른 빛에 의해 광 자극에 대장균 에서 biofilm 형성 커플. 우리는 pDawn Ag43 박테리아를 사용 하 여 패턴된 biofilms 경작 필요한 광학 설정 및 프로토콜 준비 pDawn Ag43와 대장균 을 변형 하는 과정 선발. 이 프로토콜을 사용 하 여, 25 μ m 아래 공간 해상도 biofilms 다양 한 표면에 소, 깨끗 한 객실 시설, 또는 표면 전처리 필요 없이 동봉 된 챔버를 포함 하 여 환경 패턴 수 있습니다. 기술은 편리 하 고 가변 제어할 biofilm 패턴화 biofilm 구조의 효과 조사 하는 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 적절 한입니다. 더 넓게, 그것은 또한 생체 재료, 교육, 및 바이오-예술에서 잠재적인 응용 프로그램 있다.

PDawn Ag43 박테리아 biofilms 프로젝터 조명 (폴카 도트 패턴을 조명 하는 프로젝터 설정), 폴리스 티 렌 잘 판 패턴을 생성 하기 위해 사용 되었다 그림 4A에서 볼, 크리스탈 명시 야 현미경을 통해 몇 군데 대조 대리인, 및 빨간 형광 단백질 표현 박테리아를 사용 하 여 형광 현미경으로 보라색 얼룩. 형광 biofilm 샘플 수 또한 될 몇 군데 confocal 현미경 검사 법14 3 (그림 4B) 차원에서 biofilm의 이미지를 사용 하 여. 그림 4C,에서는 우리 꽃무늬 biofilm 샘플을 제공 하는 영화 포토 마스크를 사용 하 여 가능한 고해상도 패터 닝을 보여줍니다. 마지막으로, 그림 4D 4E에 동봉 된 PDMS 문화 실 뿐만 아니라 유리 및 PDMS 표면에 모방의 예 설명-이 보여주는 다양 한 유형의 환경 pDawn Ag43 패턴을 적용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig1.jpg"> 그림 1: pDawn Ag43 박테리아 (프로토콜 섹션 1)의 준비. 호스트 스트레인 복제, 관심, E. 콜라이 긴장에 변형 및 세균 냉장고 재고 만들기에서 pDawn Ag43 플라스 미드 정화 하는 포함 한다 pDawn Ag43 박테리아 빛 규제 biofilm 형성의 능력을 준비 장기 스토리지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig2.jpg"> 그림 2: biofilm 샘플 조명 (프로토콜 섹션 2)에 대 한 광학 설치의 준비. 광학 설정 세균 인큐베이터 안에 지 내게 하며 컴퓨터 연결 프로젝터 조명 biofilm 샘플 구성 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig3.jpg"> 그림 3: 패턴화 biofilms (프로토콜 섹션 3)에 대 한 프로토콜 문화. (A) 이전 조명에, pDawn-Ag43 박테리아 그들은 안정적으로 적절 한 성장 단계에서 유도 된다 그런 패턴 사전 준비가. (B) 후 하룻밤 조명 성장, 꽃무늬 biofilm 액체 매체에 있는 planktonic 셀 함께 문화 접시의 바닥에 있을 것입니다 그리고 몇 가지 추가 처리 한 후는 biofilm 이미징에 대 한 준비. (C) 접시를 잘 하는 대신, biofilms 성형된 PDMS 구멍 같은 동봉된 문화 실에서 배양 수 있습니다. 이 경우에, 샘플을 소개 하 고 챔버의 액체를 플러시 무딘 팁 바늘에 연결 된 주사기를 사용할 수 있습니다. (D) 프로젝터 기반 조명 패턴을 대신, 패턴 또한 생성할 수 biofilm 문화 챔버의 바닥에 직접 영화 포토를 찍고. 이 경우에, 전체 분야에 걸쳐 파란 빛을 밝히는 프로젝터 설정 되어야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig4.jpg"> 그림 4: pDawn Ag43를 사용 하 여 패턴 biofilms의 대표적인 결과. 모든 결과 MG1655 대장균 호스트 스트레인을 사용 하 여 얻은 했다. (A) pDawn Ag43 박테리아 biofilms 프로젝터 조명 (폴카 도트 패턴을 조명 하는 프로젝터 설정), 폴리스 티 렌 잘 판에 패턴을 생성 하는 데 사용 했다 명시 야 현미경으로 크리스탈 바이올렛 얼룩과 통해 몇 군데는 대비 에이전트, 그리고 레드 형광 단백질 표현 박테리아를 사용 하 여 형광 현미경 검사 법. (B) 형광 biofilm 샘플은 biofilm의 3 차원 이미지를 얻기 위해 confocal 현미경 검사 법으로 몇 군데 있습니다. (C) 고해상도 biofilms 꽃무늬 biofilm 샘플을 제공 하는 영화 포토 마스크와 패턴 수 있습니다. (D) Biofilms 유리 및 PDMS 표면에 모방 될 수 있다. (E) Biofilms 동봉된 문화 실에서 모방 될 수 있습니다. 이 그림은 이전 작업3에서 적응 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>문제</td>
			<td>잠재적인 원인/솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>트래버스 호스트 스트레인-아니 식민지에 pDawn-Ag43</td>
			<td>플라스 미드 농도 낮은-분석기에 플라스 미드 농도 선택 합니다. PDawn-Ag43의 전형적인 miniprep는 적어도 100 ng/μ; 양보 해야 사용 하 여 10-100 ng 변환에 대 한</td>
		</tr>
<tr>
<td>체크/리 메이크 유능한 세포: 유능한 셀 변환 효율 10 이상 있어야 ^6 cfu / µ g pUC19-하지 않을 경우, 리 메이크 유능한 세포 같은 표준 플라스 미드를 사용 하 여 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>잘못 (수준) 항생제 파운드 천 배지-에 선택에 대 한 50 μ g/mL spectinomycin를 사용할 수 있는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로젝터 조명 끄기 / 일관성을 하룻밤 밝혀 졌</td>
			<td>같은 문제가 있는 소프트웨어를 사용 하지 않도록 설정: 자동 하룻밤 소프트웨어/운영 체제 업데이트, 야간 블루 빛 필터</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로젝터는 과열 될 수 있습니다.-프로젝터 동안 낮은 온도 설정된 인큐베이터 설정 (예: 30 ° C에 37 ° C 대신)-참고 프로젝터로 열 세트 포인트 넘어 인큐베이터 과열 수 있습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>이러한 프로젝터 전자에 영향을 미칠 수 있습니다 인큐베이터에서 습도의 불필요 한 소스 제거</td>
		</tr>
<tr>
<td>없음/낮은 수준의 biofilm의 야간 조명, 아니 planktonic 세포 성장 후도 형성 (즉 액체 분명 하다)</td>
			<td>잘못 (수준) 항생제-50 μ g/mL spectinomycin를 사용할 수 있는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>모든 것이 제대로 M63 제조 법에 추가 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>야간 조명, planktonic 셀만 후 형성 된 biofilm의 No/낮은 수준 (즉, 액체는 흐린)</td>
			<td>체크 빛 수준, 프로젝터 해야 될 조명 μW/50cm에 블루 빛 ^460 nm 파장에서 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>박테리아는 이전에 M63 추가 파운드 subdilution 단계 1:1000 후 짧은/긴 시간에 대 한 성장 시키는 시도</td>
		</tr>
<tr>
<td>파운드 격판덮개에 박테리아를 restreak, 야간 고정 단계 문화를 생성 하는 신선한 식민지에서 시작</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로젝터는 하룻밤 지속적으로 노력 하 고 있다-참조 확인 포인트 위</td>
		</tr>
<tr>
<td>퍼지 biofilm 패턴, 배경 잡음의 높은 수준</td>
			<td>광학 조명 시스템에서 길 잃은 빛을 감소, 인큐베이터의 내부에 반사 표면 커버</td>
		</tr>
<tr>
<td>(반대로 프로젝터 기반) 포토 마스크 기반 구조적된 조명 사용을 고려합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로젝터 제대로 biofilm 문화 챔버의 하단 표면에 초점을 맞춘 확인</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 공통 문제 해결입니다.

유전자 인코딩된 표면 접착 구조물의 광 자극을 사용 하 여 높은 해상도와 대장균 박테리아 biofilms 임의의 공간 패턴에 입금 하는 방법을 설명 합니다.

고해상도 무늬 Biofilm 증 착을 사용 하 여 pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

표면에 빛을 비추기 위해 생물막 리소그래피라는 방법을 개발하였고, 박테리아는 빛이 있는 곳에 축적되었습니다. 이 방법을 사용하면 생물막 연구의 핵심 질문에 대답할 수 있습니다(예: 공간 구조가 지역 사회 기능에 미치는 영향). 이 방법에는 많은 장점이 있습니다.예를 들어, 25 마이크로미터의 매우 높은 해상도에서 작동하며 표면 사전 패터닝이 필요하지 않으며 폐쇄 된 유체 장치 내부에서도 작동합니다. 이 방법은 천연 생물막의 구조 기능 관계에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 생물 막 공학, 생물 재료 및 다세포 합성 생물학과 같은 다른 분야에도 적용 할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 생물막 패터닝 전에 광학 배양 설정 및 세균 샘플을 준비하는 주요 예비 단계가 있기 때문에 중요합니다.먼저 pDawn-Ag43 플라스미드를 E.coli 스트레인으로 변환하고, 스펙티노마이신으로 보충된 LB 한천 판에 플레이트를 넣습니다. 문화 관에 스펙티노마이신으로 LB 국물에 단일 식민지를 접종하고, 250 rpm과 섭씨 37도에서 흔들리는 인큐베이터에서 기하급수적 단계로 성장한다. 접종 후, 냉동튜브에 1밀리리터의 50%의 멸균 글리세롤 1밀리리터를 혼합하여 변형된 균주의 25%의 글리세롤 스톡을 제조한다.재고를 영하 80도 의 냉동고에 보관하십시오. 다음으로, 생체막 배양챔버가 부착될 천장을 직접 위쪽으로 가리키는 조리개와 함께 세균 인큐베이터 의 바닥에 휴대용 프로젝터를 배치하여 광학 설정 준비를 시작합니다. 디스플레이 케이블을 통해 랩톱을 인큐베이터 내부의 프로젝터에 연결합니다.테이프를 사용하여 빈 더미 문화 접시를 인큐베이터의 천장에 부착하십시오. 초점 평면이 인큐베이터의 천장에 부착된 생물막 배양 접시의 바닥 표면과 일치하도록 초점 노브를 돌려 프로젝터에 초점을 조정합니다. 프로젝터는 문화 접시의 바닥에 선명하고 흐릿하지 않은 이미지를 비춰야 합니다.투영이 최적화되면 더미 문화 접시를 제거합니다. 랩톱 소프트웨어를 사용하여 프로젝터를 지시하여 전체 파란색 슬라이드를 표시하여 최대 파란색 조명으로 전체 시야를 비춥니다. 광검출기 헤드를 인큐베이터 천장에 배치하고 460 나노미터의 광파장으로 보정된 해당 전력 미터의 강도를 판독하여 광학 전력 계를 사용하여 프로젝터의 조명 강도를 측정합니다.다음으로 프로젝터 조리개에 배치된 조절 가능한 중립 밀도 필터를 사용하여 조명 강도를 조정합니다. 필터를 회전하여 청색광 투영 영역의 중앙에 있는 조명 강도가 50 마이크로와트/제곱미터를 판독할 때까지 파워 미터에 의해 측정된 조명 강도를 조정합니다. 인큐베이터 천장에 위치한 보정된 광검출기를 사용하여 조명 강도가 적절한 수준으로 설정되도록 하는 것이 중요합니다.이를 통해 중립 밀도 필터를 회전하여 조명 강도의 정확한 튜닝을 할 수 있습니다. 이제 랩톱의 프레젠테이션 프로젝터 소프트웨어를 사용하여 임의패턴을 그리고 프로젝터를 사용하여 인큐베이터 천장에 이러한 패턴을 표시합니다. 조명 전에, LB 플러스 사양 한마접시에 글리세롤 주식에서 pDawn-Ag43 균주를 줄이.식민지가 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 자랄 수 있도록 하십시오. LB 플러스 스펙 국물에 있는 한천판에서 pDawn-Ag43 박테리아의 식민지를 접종하고, 250 rpm및 섭씨 37도에서 흔들리는 인큐베이터에서 고정 된 단계로 하룻밤 문화를 성장시다. 다음 날, 스펙티노마이신과 함께 LB 국물에 1 대 1, 000의 비율로 문화를 희석.희석된 배양은 250rpm에서 6시간, 후기 지수, 초기 고정 단계까지 섭씨 37도에서 흔들리는 인큐베이터에서 성장할 수 있도록 합니다. 하룻밤 문화를 다시 희석하고 조명 전에 늦은 기하급수적인 단계로 성장하는 것이 중요합니다. 이것은 박테리아가 유도시 안정적으로 건강하고 활성화되도록 합니다.인큐베이션에 이어, 이전에 준비된 M63 배지를 밀리리터 당 50마이크로그램으로 보충하여 1대 100의 비율로 후기 지수상 배양을 희석시켰다. 그런 다음, 바이오 필름 문화 접시에 희석을 소개합니다. 샘플이 이제 조명을 받을 준비가 되었으므로 배양 접시를 인큐베이터 천장에 테이프로 표시하여 접시 바닥의 표면이 프로젝터에 의해 아래에서 조명을 투명하게 만들 수 있도록 합니다.생물막 샘플의 하룻밤 성장 후, 인큐베이터에서 배양 접시를 제거합니다. 접시는 발광 된 바닥 표면에 부착 된 생물 막 박테리아뿐만 아니라 위의 액체 매체에 분산 된 판자 박테리아를 해야합니다. 배양 접시에서 액체 매체를 제거하여 판자 세포를 폐기하십시오.다음으로, PBS로 샘플을 두 번 헹구어 PBS에서 부드럽게 파이펫팅하여 나머지 판자 세포를 제거하고 포부가 뒤따릅니다. 세포가 형광 태그인 경우 형광 현미경 검사를 사용하여 샘플을 직접 이미지화합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, pDawn-Ag43 박테리아는 프로젝터 조명이 있는 폴리스티렌 웰 플레이트에 패턴화된 생물필름을 생성하는 데 사용되었습니다.생물막은 형광균을 사용하는 경우 크리스탈 바이올렛 염색 또는 형광 현미경 검사를 통해 시각화될 수 있다. 형광 생물막 샘플은 또한 공초점 현미경 을 사용하여 3D에서 생물막의 이미지를 얻기 위하여 심화될 수 있습니다. 필름 포토마스크를 사용하여 생물막 시료에 패턴 조명을 제공함으로써 고해상도 패터닝이 가능합니다.유리 및 PDMS 표면의 패킹 예는 동봉된 PDMS 배양 챔버뿐만 아니라 여기에 표시되며 pDawn-Ag43 패터닝이 적용 될 수있는 다양한 유형의 환경을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 먼저 관심의 변형으로 pDawn-Ag43을 변환 한 다음 적절하게 초점을 맞추고 프로젝터를 보정하고 마지막으로 조명에 대한 박테리아를 준비하기 위해 필요한 문화 및 백 희석 단계를 따르는 것이 중요합니다. 이 방법에 따라 다른 기술을 배포할 수 있습니다(예: 상이한 문화 조건 하에서 생물막을 장기적으로 모니터링하는 경우).이렇게 하면 생물막 구조가 그 기능에 미치는 영향을 이해할 수 있습니다. 이 기술은 합성 생물학 및 재료 연구에 널리 적용될 것이며, 예를 들어 생물막을 다양한 응용 분야로 설계할 수 있습니다.

high-resolution-patterned-biofilm-deposition-using-pdawn-ag43

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

여기 선물이 광역 스캐닝 프로브 나노리 프로브 배열의 반복 정렬 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 리소 그래피 패턴의 활용에 의해 사용에 대 한 프로토콜.

큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진

나노미터 두께 브러쉬 또는 미크론 두께의 패턴된 증 착, 가교 된 영화는 azlactone 블록 공동 폴리머의 표면 제작 방법 보고 됩니다. 중요 한 실험 단계, 대표 결과 및 각 메서드의 제한 사항을 설명 합니다. 이러한 메서드는 맞춤형 물리적 기능과 가변 표면 반응성 기능 인터페이스를 만들기 위한 유용 합니다.

브러쉬 모양의 반응 표면 날조 및 Azlactone 기능성된 블록 공동 고분자의 가교 된 영화

여기, 선물이 세균성 세포 생존 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 치과 보 철물 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가 하는 프로토콜. 현장에서 모델 관련 강력한 현미경 검사 법 기술 된 구두 biofilm 분석에 사용 됩니다.

치과 임 플 란 트에 대 한 다른 자료에 구두 Biofilm 형성

본 문서에서는 저가형 상업용 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환 하 여 패턴화 된 바이오 필름의 인쇄를 촉진할 수 있는 방법을 설명 합니다. 바이오 필름 및 바이오 잉크를 제조 하는 데 필요한 모든 측면 뿐만 아니라 생물 막의 형성을 평가 하기 위한 검증 방법도 설명 합니다.

엔지니어 드 바이오 필름의 3 차원 패터 닝-it-스스로 바이오 필름

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

이 프로토콜은 실란 코팅된 나노다공성 표면에 순차적 디지털 패터닝 및 그라프팅을 통해 미끄러운 3차원 구조를 제작하기 위한 빛 유도 방법을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 미끄러운 영역의 공간적으로 제어된 형성이 가능해 패턴화된 액체 발수성과 계면 미끄러움의 정량적 분석이 가능하며 유체 조작 및 표면 공학에 적용됩니다.

실란 코팅 나노다공성 구조를 기반으로 한 미끄러운 표면을 위한 광유도 패터닝 및 그래프트

이 프로토콜은 결정-바이올렛 바이오매스 분석, 타임랩스 위상 차비 역학, 공초점 3D/매트릭스 매핑, SEM 초구조, 생체 내 햄스터 감염 모듈을 결합한 모듈형 BSL-2 워크플로우를 제공하여 렙토스피라 바이오필름의 기능적 역할을 배양, 정량, 특성화, 조사하여 실험실 간 돌연변이 및 반바이오필름 개입의 표준화된 평가를 가능하게 합니다.

렙토스피라 바이오필름의 정량적, 구조적, 기능적 분석을 위한 모듈식 워크플로우

배우세요 광학 자극을 이용한 고해상도 바이오필름 리소그래피 방법으로 Escherichia coli를 정밀하게 패턴화하는 기술입니다. 이 기법은 바이오필름 공학과 합성생물학 연구에 활용됩니다.

고해상도 무늬 Biofilm 증 착을 사용 하 여 pDawn-Ag43

더 많은 동영상 탐색