Name: Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 배우세요 생체 외 망막 조직에서 산소 소비량과 산화적 인산화를 실시간 측정하는 방법을. 이 기술은 약리학적 처리에 따른 에너지 대사 변화를 정확히 분석하여 망막 질환 연구에 활용됩니다.

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우리 박사 알렉산더 Kolesnikov와 박사 블라디미르 Kefalov 제공에 감사 Gnat1/-마우스, 유용한 피드백과 조언, 그리고 원고를 읽고.
이 작품에서 NIH EY025269 (RR), 워싱턴 대학-NIH DK020579에서 당뇨병 연구 센터를 지원 했다 (JRM 및 RR), 실명 방지 (RR), Horncrest 재단 (RR), JDRF (에서 경력 개발 상 연구에서 경력 개발 수상 JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS), 및 DK114233 (JRM).

프로토콜 비전에서 연구를 위한 협회와 동물의 사용에 대 한 안과 문을 고 워싱턴 대학에 의해 승인 했다.
1. 동물 준비
<ol><li>동물에에서 계속 12 시간으로 표준 주택 어두운 12 시간 빛 주기. 시작에서 실험 시간을 잠시 후 조명이 켜져 아침에 일반적으로 circadian 효과 피하기 위해 표준화.</li>
</ol>2. 솔루션 준비
<ol><li>8.4 mg 더블 소 주 H2O 가루 미디어 (ddH2O)를 용 해 하 여 기본 미디어 준비 7.4 HCl 이나 NaOH를 pH 조정, 1의 최종 볼륨을 L. 필터 0.22 μ m 조직 문화 필터와 함께이 솔루션을 소독.<ol>
<li>1 M 포도 당 및 100 m m 5 mM 포도 당의 최종 농도 달성 하기 위해 미디어에 나트륨 pyruvate 그리고 1 mM pyruvate를 추가 합니다.</li>
		<li>장소는 37 ° C 물 목욕에서 기본 미디어의 50 mL 약 수.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 m m, 0.2% (v/v), 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르 그리고 ddH2오 믹스까지 모든 구성 요소는 완전히 해산 하 고 조정에 모두 1 mm EDTA를 기본 트리를 추가 하 여 세포 솔루션, 유출 분석의 끝에 조직의 정량에 대 한 준비 8.0 산 도입니다.</li>
	<li>미토 콘 드리 아 스트레스 프로토콜 oligomycin, ATP Synthase 억제제, 우물에 1 µ M의 최종 농도 대상으로 기본 미디어에 녹아의 11 µ M 재고를 준비 합니다. 카보닐기 시안-4-(trifluoromethoxy)의 11 µ M 재고 준비 잘에서 1 µ M의 최종 농도 대상으로 기본 미디어에 녹아 있는 phenylhydrazone (FCCP), 연결을 푸는 에이전트. 전자 전송 체인 억제제로 테 논과 antimycin로 테 논 11 µ M 및 22 µ m, antimycin A 추가 하 여 A (RAA)의 칵테일을 준비 기본 미디어를 대상으로 1 µ M로 테 논 및에서 2 µ M antimycin A의 최종 농도에 용 해는 잘.</li>
	<li>분해 프로토콜에 대 한 포도 당 우물에서 20 mM의 최종 농도 대상으로 기본 미디어에 녹아의 220 m m 재고를 준비 합니다. 또한 기본 미디어에 용 해 하 여 포도 당과 glycolytic 적 경쟁 억제 물, 2-deoxyglucose (2-DG)의 1.1 M 재고 준비 합니다. 이 우물에서 100 m m 2-DG의 최종 농도 대상으로 합니다.</li>
</ol>3. 계측기 교정
<ol><li>보정 세포 외 유출 분석 결과 대 한 계측, 센서 카트리지 (24 웰 스 총)의 각 음을 교정 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 CO2에서 37 ° C에서 품 어-무료 보육 하룻밤 (또는 적어도 8 h).</li>
	<li>각 인젝터 포트, D, A에 우물에서 볼륨 변경에 대 한 조정 센서 카트리지, 미토 콘 드리 아 스트레스 프로토콜 또는 분해 프로토콜에 대 한 첨가제를 로드 합니다. 참고: 예를 들어, 일반적인 분석 결과 첫 번째 인젝터 포트에 첨가물의 45 µ L, 두 번째, 마지막으로 세 번째, 및 60 µ L에 54.5 µ L 450 µ L의 초기 잘 볼륨을 가정으로 49.5 µ L 포함 됩니다.</li>
	<li>첫 번째 몇 가지 실험 하는 동안 기본 미디어 포트 A 포트 주입 후 발생 하는 얼마나 많은 조직 운동/인 게이지를 로드.</li>
	<li>적어도 60 분 동안 비 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어를 로드 센서 플레이트를 허용 합니다.</li>
</ol>4. 신선한 마우스 망막 조직 격리
참고: 이 단계는 박사 배리 Winkler15의 기술에서 적응.
<ol><li>표준 케 타 민/xylazine 칵테일을 사용 하 여 깊은 마 취 관리, 후 경부 전위에 의해 마우스를 안락사.</li>
	<li>중간 크기의 굽은 집게의 쌍을 사용 하 여 시 신경에서 후부 세계를 파악 하 고 부드럽게 proptose 눈 (그림 1A)에 압력을 적용.<ol>
<li>깨끗 한 면도날으로 잎의 단일, 패스를 사용 하 여 각 막에 걸쳐 limbus limbus 절 개를 만듭니다.</li>
		<li>잘 사용 하 여 직각된 맥 퍼 슨-스타일 겸 자, 렌즈 앞쪽 hyaloid 막에서 각 막 절 개를 표현 하는 사후 세계를 꼬집어. 이러한 조직 삭제 합니다.</li>
		<li>신경 망막을 표현 하는 집게와 곤란 하 게 책략을 반복 합니다.</li>
		<li>조직 파악 보다는 망막을 들어 숟가락 처럼 집게를 사용 하 여, 각 막 절 개에서 망막을 전송 하 고 3 cm 접시 또는 6 잘 조직 문화 클러스터 접시에 따뜻한 미디어에 직접 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>괜 찮 아 요, 각 맥 퍼 슨 스타일 집게의 두 쌍을 사용 하 여 부드럽게 나머지 유리 체 망막에서 해 부. 이것은 최고의 유리 체 망막 컵의 주변에서 파악 하 고 전체적으로 센터에서 유리 체의 마지막 disinsertion와 중심 쪽으로 당기에 의해 이루어집니다. 집게를 사용 하 여 망막의 포토 리셉터 표면에서 어떤 잔여 망막 안료 상피를 제거 합니다.<ol>
<li>P1000 피펫으로 팁 ~ 4 m m 오프닝 전송 기동 중 섬세 한 망막 조직에 과도 한 외상을 방지 하기 위해 만들 면도날으로 잘라.</li>
		<li>격리 된 망막 조직을 잘라 P1000 피펫으로 팁을 사용 하 여 신선한 미디어로 전송 합니다.</li>
		<li>1mm 생 검으로 시 신경 주변 망막의 1 m m 펀치 펀치 구멍 (그림 1B)에 박 혀 됩니다 경우에 조직을 꺼내 려 플런저를 갖춘 잘라. 깨끗 한 미디어 블록 37 ° C에 보관 또는 열 패드에 따로 망막 펀치를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 분석 결과 프로토콜
<ol><li>잘라 P1000 팁, 조직 함께 미디어의 450 µ L 발음을 사용 하 여 24-잘 섬 캡처 microplate에 개별 펀치를 전송.</li>
	<li>직선 겸 자는 미 판 중심으로 펀치를 부드럽게 조작 하 잘 사용 합니다. (예를 들어, ganglion 셀 측면 위쪽) 같은 방향으로 지향 펀치를 유지 합니다.<ol>
<li>가 열 패드 또는 다음이 단계는 나머지 샘플에 대 한 반복 블록 세트 37 ° C에 난방에 캡처 접시 휴식. 참고: 각 실험에 대 한 부정적인 컨트롤 역할을 기본 미디어의 450 µ L 3-4 빈 우물 옆으로 설정 합니다. 나머지 20-21 웰 스, 3 중에서 각 생물 복제를 테스트 합니다. 따라서, 각 24-잘 접시 6-7 다른 동물 또는 치료 조건에서 기록에 대 한 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공기 방울, 부드럽게 위치를 피하는 섬 메쉬 삽입 각 잘 집게를 사용 하 여 캡처하고 금속 플런저 또는 컷된 P1000 피펫으로 팁 (그림 1 C) 삽입을 확보 합니다. 참고: 샘플 microchamber의 센터 내에 망막 펀치 위치를 유지 하려면이 단계 동안 과도 한 조직의 움직임을 피하십시오. 기포는 심하게 OCR 판독을 왜곡 한다. microchamber을가지고 있지만 일반적인 마우스 망막 (그림 1C)에 맞게 적절 한 깊이, 때때로 메쉬 삽입에 가공 결함 조직 화면 삽입 지나치게 압축 될 발생할 수 있습니다. 이 경우, 단순히 짓 눌린된 조직 기록 하 고 최종 분석에서 그 샘플을 제외 합니다.</li>
	<li>37 ° C 공동2조직 접시를 품 어-적어도 60 분 동안 무료 보육.</li>
	<li>세포 외 유출 분석기, 대기, 측정, 혼합을 사용 하 여 프로그래밍 하 고 명령을 반복 합니다. 예를 들어, 망막 조직으로 전형적인 실험 다음 포함 될 수 있습니다: 믹스 2 분, 2 분 및 5 분을 측정. 이 세 가지와 실험 사이 단계 반복 5-8 시간 (주기) 기준 기록 하 고 실행 하는 동안 테스트 되 고 각 화합물의 주입 후.</li>
	<li>세포 외 유출 분석기에 프로그램 시작 버튼을 누르고 구경 측정을 위한 센서 카트리지를 삽입 하려면 화면의 지침을 따릅니다.</li>
	<li>교정의 끝에, 망막 샘플을 포함 하는 접시 calibrant 플레이트 바꿉니다 화면의 지침을 따르십시오.</li>
	<li>프로그래밍을 실행 하려면 프로그램을 허용 합니다. 실행의 완료에 조직 접시를 추출 하려면 화면의 지침을 따릅니다. 실행의 결과 데이터 파일을 저장 합니다.</li>
	<li>구부러진된 20 게이지 바늘과 포 셉으로 망막 펀치를 남겨두고 우물에서 모든 메쉬 삽입을 제거 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 조직에서 미디어를 발음 하 고 씻어 감기 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 0.5 mL로 두 번 조직. 세척 후 PBS를 발음.</li>
	<li>각 잘을 아래로 조직 균질을 피펫으로 100 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>총 이중 가닥 DNA (dsDNA) 또는 총 단백질 함량에 따라 입력된 레벨 quantitate 참고: 다음은 상용 dsDNA 분석 결과에 기반.</li>
	<li>트리 스-EDTA (테) 버퍼의 100 µ L을 추가 하 여 lysed 샘플 1: 1을 묽 게 하십시오 그리고 96 잘 접시에 희석된 샘플의 100 µ L를 전송.<ol>
<li>각 잘으로 감지 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 2-5 분 동안 혼합 후 480 nm에서 여기 및 520에서 방출 후 형광을 quantitate nm, 표준 곡선을 비교.</li>
		<li>잘 내 DNA 콘텐츠를 원시 세포 외 유출 추적 정상화. 참고: 여기에 제시 된 결과에 샘플 50 ng dsDNA-1 m m 망막 펀치에 일반적인 금액을 정규화 됩니다. 따라서, 여기 절대 값 데이터 "망막 펀치"를 제시 하는 연구와 비교 될 수 있습니다. 기준선 5 mM의 포도 당 농도에 run과 같은 내부 표준 경시를 정상화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

OCR과 ECAR explanted 망막 조직 설명 된 기술을 사용 하 여 bioanalyzer를 사용 하 여 쉽게 측정 됩니다. 이 메서드는 몇 가지 중요 한 단계에서 다른 그룹의 출발. 망막 조직 윈 클 러15에 의해 원래 기술 세계를 enucleating 없이 큰 각 막 절 개를 통해 격리 됩니다. 망막 분리의이 방법 (5 분) 안에 종종 조직 캡처 접시에 살아있는 눈에서 빠른 전송에 대 한 수 있습니다. 조직 세포 호흡을 얼음에 둘 때 보다 더 나은 유지 과정 전반에 걸쳐 37 ° C에서 보관 됩니다. 최소한의 첨가제와 미디어로이 기저 에너지 대사의 더 신뢰할 수 있는 측정 가능 하며 억제 하지 않습니다 HEPES 또는 중 탄산 나트륨, 혈 청, 또는 초과 macronutrients, 등 모든 버퍼링 에이전트를 생략 초기 측정을 위해 사용 됩니다. ECAR의 평가입니다. 망막 펀치는 최고의 24-잘 형식 보다는 96-웰 스, 조직에 외상을 최소화 하기 위해 기록 됩니다. 망막 조...

망막은 중추1에서 가장 에너지 요구 하는 조직 중 하나입니다. 대부분 조직 같이 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 통해 분해 cytosol 또는 통해 산화 인 산화에서 미토 콘 드리 아에서 생성합니다. 포도 당 한 분자에서 ATP를 생산 하기 위해 분해 산화 인 산화의 활기찬 장점은 분명 하다: 후자에서 생성 된 ATP의 2 분자는 전 대 에서 생성 된 atp 36 분자. 따라서, 망막 신경 세포는 주로 에너지 공급에 대 한 미토 콘 드리 아 호흡에 따라,이 미토 콘 드리 아2의 그들의 높은 밀도 의해 반영 됩니다. 그러나, 망막 또한 무 겁 게에 의존 glycolytic 기계 산소 풍부한 경우에 합니다. 이 과정은 호 기성 분해 원래 오토 바르 부르 크3, 한 번 망막이이 형태의 대사4수만 포스트 mitotic 조직 이었다고 언급 하 여 암 세포에 설명 했다. 그 초기 관측 이후 많은 포스트 mitotic 조직 그들의 ATP 요구를 충족 시킬 뿐만 아니라 산화 인 산화 분해의 다양 한 각도에 종사 하 설명 했습니다.
Phototransduction, 시각적인 안료 재활용, 포토 리셉터 외부 세그먼트, 및 시 냅 시스 활동의 생 합성 하는 대뇌, 망막의 우세 신경 하위 클래스에서에서 모든 에너지 요구 프로세스. 하지만 적극적으로 그들의 전기에 대 한 이온 농도 기온 변화도 수송 하는 필요 지금까지 신경1에서 가장 정력적으로 소모 되는 과정입니다. 대뇌는 가벼운 자극 유발 채널 폐쇄 및 후속 hyperpolarization 반면 그들은 (즉, 어둠 속에서), 자극의 부재에서 depolarized는 의미에서 독특한 신경. 따라서, 어둠, 망막 대량의 ATP의 도발은 또는 "전류"로 일반적으로 불리는를 유지 하기 위해 사용 합니다. 적응의 관점에서 이러한 방대한 양의 ATP 공급 하는 주요 과제 광 축 통해 시각적 선명도 유지 하기 위해 유기 체를 위한 필요 이다. 현대 생물에서 거꾸로 망막 아키텍처는 지배적인 솔루션 공급 하는 빛의 경로에서 대뇌 조밀한 모 세관 네트워크 유지. 하지만 자연 생명 공학의이 놀라운 변화 준비에서 절벽에 망막 장소. 망막에도 작은 모욕 잠재적 수요, 에너지 공급의 섬세 한 균형을 혼란 시킬 수 있다 그리고 시각 장애 또는 솔직 실명 빠르게 ensue 수 있습니다.
혈관 공급의 그것의 단단한 제한 함께 신경 망막의 독특한 에너지 수요를 감안할 때 질병 동안 망막 및 그것의 변화에서 ATP 소비의 정확한 측정 이해 하 고 치료에 깊은 의미를 가질 수 있습니다. 당뇨병 성 망막 증 망막 화 등 눈부신 조건. 전통적으로, 이러한 측정 신진 대사 활동2,5,6,의 측정에 전적으로 헌신 하는 실험실의 소수에서 나오는 대부분의 연구 비용이 많이 드는, 맞춤형 장비를 필요로 7,8. 기술은 특정 대사 산물, 라디오 라는 선구자, 클라크 전극, 및9를 프로 파일링 하는 metabolomic를 사용 하 여 녹음 하는 산소 소비를 사용 하 여 추적 연구에 대 한 개별 분석을 포함 한다.
진보와 함께 높은 처리 기술 및 상용 장치의 증가 가용성, 기술 기록 망막 물질 대사에 점점 접근 가능 하 고 저렴 한 있습니다. 여기 설명 하는 방법을 모두 산화 인 산화 하 고 망막을 사용 하 여 분해 explanted 조직 및 상용 세포 외 유출 분석기9,10,,1112. 이 분석기는 별도로 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR), 산화 인 산화 및 분해, 각각13의 간접 지표 역할을 기록 합니다. 이러한 측정은 관심의 조직에 만든 microchamber 내 submersed 프로브에 의해 수행 됩니다. 이전에 게시 방법의이 적응이 원래 췌 장 독도 Langerhans 위한 캡처 플레이트를 사용 하 여 마우스 망막의 작은, 원형 섹션에서 신진 대사 활동을 기록. 다중 pharmacologic 노출 시스템 각 샘플에 대 한 4 주입 포트를 잘 포함 되어 있기 때문에 단일 기록의 과정에서 조직에 전달할 수 있습니다. 별도 프로토콜 ECAR 및 OCR 녹음/녹화에 대 한 최적화 된이 시스템을 사용 하 여, 야생-타입 망막의 반응을 비교 될 수 있다 망막 (Gnat1-/-), transducin 부족에 선 천 성 고정 야 맹 증의 원인 인간14.

<table><tbody><tr><td>Seahorse XF24 세포외 플럭스 분석기</td><td>애질런트, 캘리포니아</td><td></td><td></td>주 산타클라라</tr><tr><td>Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge 및 Calibrant Solution 포함)</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>Islet capture microplate, 센서 카트리지 및 캘리브런트 용액 포함</td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체(분말 매체)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>RPMI 1640 L-글루타민이 포함된 매체 및 포도당 또는 중탄산나트륨이 없는 매체</td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-포도당 여과, 배지 준비용</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100mM 피루브산</td></tr><tr><td>나트륨 Antimycin-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>미토콘드리아 스트레스 프로토콜 구성 요소</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>미토콘드리아 스트레스 프로토콜 구성 요소</td></tr>, <tr><td>Rotenone</td>, <td>Millipore-Sigma</td>, <td>R8875</td>, <td>미토콘드리아 스트레스 프로토콜 구성 요소</td></tr>, <tr><td>2-deoxyglucose</td>, <td>Millipore-Sigma</td>, <td>D6134</td>, <td>해당작용 프로토콜 구성 요소</td></tr>, <tr><td>플런저가 있는 1mm 피부 생검 펀치</td>, <td>Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>Explanting 망막 조직 도구</td></tr>, <tr><td>Dumont Mini-Forceps, Straight</td><td>Fine Science Tools,</td><td>11200-10</td> 망<td>막 조직 도구</td></tr><tr><td>이식 Dumont Medical #5/45 집게 - 각도 45도</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11253-25</td><td>망막 조직 도구</td></tr><tr><td>이식 Dumont #7 집게 - 곡선형</td><td>미세 과학 도구</td><td>11271-30</td><td>망막 조직 도구</td></tr> 이식 <tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA 분석 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>로딩 정규화 분석</td></tr><tr><td>Trizma base (Tris base)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>용해 완충액 Triton</td></tr><tr><td>X-100 구성 요소 (폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>용해 완충액 구성 요소</td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>용해 완충액</td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스의 구성 요소&nbsp;</td><td>잭슨 연구소</td><td>&nbsp; 균주 000664</td><td>동물</td></tr><tr><td>Gnat1-/- 및 배경 일치 Gnat1+/+&nbsp;</td><td>블라디미르 케팔로프 박사; 워싱턴 대학교 의과 대학</td><td>동물</td><td></td></tr></tbody></table>

explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

높은 시력 비전 무 겁 게 에너지 소모 하는 프로세스 이며 망막 정확 하 게 시각적 축의 투명성을 유지 하면서 이러한 요구를 충족 하기 위해 여러 가지 독특한 적응을 개발 했다. 이 섬세 한 균형에 섭 눈부신 질병, 당뇨병 성 망막 증 등 원인. 따라서, 질병 중 에너지 대사 변화는 망막에 이해 vison 손실의 다양 한 원인에 대 한 합리적인 치료의 발전에 필수적입니다. 상용 세포 외 유출 분석기의 최근 출현은 망막 에너지 대사의 연구를 더 접근 했다. 이 프로토콜은 산소 소비 속도 (OCR)에 변화를 측정 하 여 측정 하는 그것의 2 개의 원리 팔-산화 인 산화 및 분해-통해 망막 에너지 공급에 기여 하는 등 분석기의 사용을 설명 합니다 및 세포 외 산성화 요금 (ECAR)이이 경로 대 한 프록시. 이 기술은 단일 실험에서 여러 pharmacologic 에이전트에 대 한 응답의 평가 촉진 explanted 망막 조직에 쉽게 수행 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 야생-타입 컨트롤 막대 포토 리셉터 신호 부족 한 동물에서 망막에서 대사 서명은 비교 됩니다. 이 기술은 주요 한계 빛 적응 하 고 dark-adapted 에너지 이용, 망막 조직에 중요 한 생리 적인 고려 사항 사이 구별할 수 있는 능력의 부족 이다.

( 그림1에서) 요약 설명한 기법을 사용 하 여, 8 주 된 야생 타입 (WT) 마우스에서 망막 explants는 나이 및 배경 일치 transducin null 쥐 (Gnat1-/-)에 비교 되었다. Gnat1-/- 동물을 기계 부족 하기 때문에 주기적인 뉴클레오티드 문이 빛 자극에 대 한 응답에서 이온 채널, 그들의 막대 대뇌 남아 빛14에 depolarized. 후속 칼륨 경과 bioenergetic 긴장 결과로 큰 ATP 수요를 만들 것 이다 유지 하기 위해 필요 합니다. 에너지 수요의 변화에 이러한 산화 인 산화 또는 glycolytic 플럭스를 증가 시킬 것입니다 경우 확인 하려면 야생 타입 마우스 및 Gnat1/- 생쥐에서 조직 세포 외 유출...

이 기술은 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 explanted 마우스 망막 조직 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 실시간으로 녹음을 설명 합니다.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

이 방법은 망막 조직에 있는 에너지 물질 대사가 생물학 견본 사이 또는 약리학 에이전트에 노출 후에 어떻게 다른지와 같은 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 글리코리시스와 산화 된 인산화의 비율을 측정하기 위해 이식 된 organotypic 망막 조직을 활용하고 체외에서 실시간 개입의 평가를 허용한다는 것입니다. 세포외 플럭스 분석에 대한 계측을 보정하려면 먼저 24개의 웰 센서 카트리지의 각 웰에 1밀리리터의 교정 솔루션을 추가하고 하룻밤 동안 Co2 무료 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다.미토콘드리아 응력 프로토콜또는 글리코리시스 프로토콜을 센서 카트리지의 각 인젝터 포트에 적재하여 우물의 부피 변화를 조정합니다. 450 마이크로리터의 초기 음부피를 가정하면, 일반적인 분석에는 제1 인젝터 포트에 첨가제 45 마이크로리터, 두 번째 삽입기 포트에 49.5 마이크로리터, 세 번째마이크로리터54.5 마이크로리터, 마지막까지 60 마이크로리터가 포함됩니다. 처음 몇 가지 실험 동안, 포트 A에 기본 배지를 로드하여 포트 주입 후 발생하는 조직 이동 아티팩트의 양을 측정합니다.로드된 센서 플레이트가 비 Co2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 최소 60분 동안 배양할 수 있도록 허용합니다. 갓 안락사 된 마우스로 신선한 마우스 망막 조직의 격리를 시작합니다. 중간 크기의 곡면 포셉을 사용하여 시신경에서 후방 전세계를 파악하고 전방 압력을 부드럽게 적용하여 눈을 전파합니다.깨끗한 면도날로 블레이드의 의도적인 단일 패스를 사용하여 각막을 가로지르는 림푸스 절개를 만듭니다. 미세 각진 McPherson 스타일 포셉을 사용하여 후면 글로브를 꼬집어 각막 절개에서 렌즈와 전방 hyloid 멤브레인을 표현합니다. 신경 망막을 표현하기 위해 집게로 꼬집기 기동을 반복합니다.그런 다음 숟가락처럼 집게를 사용하여 각막 절개에서 망막을 들어 올립니다. 망막을 3센티미터 접시 또는 6개의 잘 조직 배양 클러스터 플레이트에 직접 넣습니다. 다음으로, 두 쌍의 미세각 맥퍼슨 스타일 포셉을 사용하여 망막에서 남은 유리체를 부드럽게 해부합니다.이것은 망막 컵의 주변에서 유리체를 잡고 중앙으로 당겨중앙을 향해 당겨서 중앙에서 유리체의 최종 분리와 함께 하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음, 망막의 사진 수용체 표면에서 잔류 잔류 안료 상피를 제거한다. P1000 파이펫 팁을 면도날로 잘라 서 약 4밀리미터 개구부를 만들어 이송 기동 중 섬세한 망막 조직에 대한 과도한 외상을 방지합니다.그런 다음 절단 파이펫 팁을 사용하여 격리된 망막 조직을 신선한 배지로 옮길 수 있습니다. 마지막으로 플런저를 장착한 1mm 생검 펀치를 사용하여 시신경 주위의 망막 펀치를 잘라냅니다. 망막 펀치를 깨끗한 매체에 따로 놓고 섭씨 37도 블록 또는 가열 패드에 보관하십시오.원하는 수의 펀치가 수집되면 귀여운 P1000 팁을 사용하여 중간 크기의 450 마이크로 리터에 개별 펀치를 흡입하고 37도 의 섭씨 열 패드 또는 히트 블록에 24 웰 아일렛 캡처 마이크로 플레이트로 전송하십시오. 미세하고 직선적인 집게를 사용하여 마이크로 플레이트의 중앙으로 펀치를 부드럽게 조작합니다. 펀치를 같은 방향으로 유지합니다.예를 들어, 신경절 세포 측을 위쪽으로 합니다. 각 실험에 대해 450 마이크로리터의 베이스 배지가 있는 3~4개의 빈 우물을 따로 따로 두어 음의 대조군역할을 한다. 기포 나 과도한 움직임을 피하면서, 아일렛 캡처 메쉬 인서트를 각 우물에 부드럽게 배치하고 금속 플런저 또는 절단 P1000 파이펫 팁으로 인서트를 고정합니다.마이크로 챔버는 일반적인 마우스 망막을 수용하기에 충분한 깊이를 가지고 있지만, 때때로 메쉬 인서트의 기계 결함은 화면 삽입 중에 조직이 지나치게 압축되는 원인이됩니다. 이 경우, 단순히이 분쇄 된 조직의 메모를하고 최종 분석에서 그 샘플을 제외합니다. 티슈 플레이트를 37도 의 이산화탄소 무료 인큐베이터에서 적어도 60분 동안 배양합니다.혼합, 무게, 측정 및 반복 명령을 사용하여 여분의 셀룰러 플럭스 분석기를 프로그래밍합니다. 예를 들어, 망막 조직을 가진 전형적인 실험은 다음을 포함할 수 있다. 2분간 섞고 2분간 기다린 후 5분간 기다립니다.기저선 레코딩을 위해 5~8회 사이의 이 세 가지 단계로 실험을 반복하고, 각 화합물의 주입 후 시험한다. 외세포 플럭스 분석기의 프로그램 시작 버튼을 누르고 화면의 지침을 따라 보정을 위해 센서 카트리지를 삽입합니다. 교정의 끝에서 교정을 통해 교정판을 망막 샘플이 포함된 플레이트로 교체한 다음 프로그램이 프로그래밍된 대로 실행할 수 있도록 합니다.실행이 완료되면 화면의 지침을 따라 티슈 플레이트를 배출합니다. 실행 결과를 보고 데이터 파일을 저장합니다. 구부러진 20 게이지 바늘과 집게로 우물에서 모든 메쉬 인서트를 제거하고 망막 펀치를 뒤로 합니다.조심스럽게 조직에서 배지를 흡인하고, 차가운 인산염 완충식염의 0.5 밀리리터로 조직을 두 번 씻는다. 두 번째 PBS 세척을 심은 후, 각 세척에 100 마이크로리터의 용해 완충제를 추가하고 조직을 균질화하기 위해 피펫을 위아래로 넣습니다. 마지막으로, 트리스-EDTA 버퍼100마이크로리터를 1-1로 희석하고 희석된 시료의 100마이크로리터를 96개의 웰 플레이트로 전송하여 총 이중 좌초 된 DNA 함량을 기반으로 입력 수준을 양으로 전달합니다.그런 다음 각 웰에 100 마이크로리터의 검출 버퍼를 추가하고 2~5분 동안 혼합합니다. 마지막으로, 표준 곡선과 비교하여 480 나노미터에서 발광 및 520 나노미터에서 배출한 후 수량으로 플로레시엔션을 수량화한다. 우물 내의 DNA 함량에 원시 세포 외 플럭스 추적을 정규화합니다.기본 라인에서, 5 밀리 뮬러 포도당의 존재와 존재 10 밀리 뮬러 피루바테, 산성 유출의 비율에 유의한 차이가 없다, 세포 외 산성화 속도에 의해 측정. wile 형 동물에서 망막 조직 사이, 또는 빛 자극에 대 한 응답으로 순환 뉴클레오티드 게이트 이온 채널을 닫기 위해 기계가 부족 마우스를 노크. 유사한 패턴은 20 밀리 뮬러 포도당과 글리코리스틱 억제제 2DG를 첨가한 후에 보입니다.이러한 데이터는 다른 실험 적 개입 간의 더 나은 비교를 허용할 수 있는 형식인 기준선에서 분수 변화를 나타내기 위해 수학적으로 변형될 수 있습니다. 기준선에서 절대 산소 소비 속도는 또한 제어 및 돌연변이 망막 조직 사이 동일합니다. 20 밀리 뮬러 포도당의 첨가는 미토콘드리아 호흡을 증가, 하지만 절대 정량화의 측면에서 또는 기준선에서 변화의 관점에서 그룹 사이에 관찰에 변화가 없습니다.1 밀리 뮬러 FCCP의 추가, 분리 에이전트, 최대 미토콘드리아 호흡 속도를 입증하기 위해 크게 제어 및 돌연변이 망막 조직에서 높은 포도당으로 본 수준 이상의 OCR을 증가하지 않습니다. 그러나 RAA 칵테일을 첨가한 후 두 마우스의 신호가 크게 떨어집니다. 결론적으로, 우리는 마우스 망막의 organotypic 파종의 산화 인산화 및 글리코립시스의 양을 양화하기위한 기술을 보여줍니다.망막 조직의 효율적인 격리로 이 기술은 신뢰할 수 있고 자랑스러운 측정을 생성합니다. 분리 제와 같은 노출의 실시간 효과를 평가할 수 있습니다. 이 절차 이외에, 정량적 RTPCR 및 서부 블로팅과 같은 다른 방법은 방부 단계에서 분리된 잉여 조직에서 수행되어 망막 대사의 연구와 관련된 병렬 정보를 얻을 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 세포외 플럭스 분석을 통해 1차 백혈병 세포의 세포외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 생화학적 접근 방식을 제공합니다. 이러한 세포의 대사 프로파일에 대한 평가는 세포의 요구를 특성화하는 데 도움이 되어 맞춤형 치료로 이어집니다.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

이 동영상은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 활성화된 인간 NK 세포의 에너지 대사를 분석하는 방법을 보여줍니다. 전자 전달 사슬 복합체의 다양한 억제제는 산소 소비율 또는 OCR을 통해 측정되는 ATP 합성에 영향을 미치며 세포 대사 및 생체 에너지학에 대한 통찰력을 제공합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 인간 NK 세포의 에너지 대사 실시간 모니터링

대사 재프로그래밍은 M1 및 M2 대식세포 분극의 특성이자 전제 조건입니다. 이 원고는 마우스 골수 유래 대식세포에서 해당작용 및 미토콘드리아 기능의 기본 매개변수를 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 이 도구는 특정 요인이 대식세포의 대사와 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

여기에 기재된 미토콘드리아 응력 분석기 및 글리코리질 속도 분석기의 상세한 프로토콜은 상용 생체 분석기를 이용한 전 생체 망 막 조직 샘플에서 이다.

전 비보 망막 조직 샘플에서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 결정

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

이 프로토콜은 사용자가 Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 암 세포주 유래 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 데 도움이됩니다.

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)의 대사 상태는 건강과 기능을 반영합니다. 여기에 제시된 것은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE의 실시간 대사 플럭스를 검사하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

고분해능 호흡 측정법을 이용한 일차 인간 망막 색소 상피 세포의 생체 에너지 실시간 분석

여기에서는 골수, 비장 및 경색된 심장에서 대식세포를 추출하고 이후에 살아있는 세포의 대사 플럭스를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

비장 및 심장 대식세포와 골수 단핵구의 생체 외 대사 플럭스 분석

이 프로토콜은 1차 마우스 미세아교세포에서 대사 재프로그래밍을 정량화하기 위해 해당분해 스트레스 검사를 비용 효율적으로 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 및 염증 자극 후, 신선하게 준비된 pH 조정 시약을 사용해 세포외산성화 속도(ECAR)를 측정한 후, 단백질 정규화를 통해 당해질 변화를 정확하고 재현 가능하게 평가합니다.

세포외 플럭스 분석법을 이용한 1차 미세아교세포의 당화 연구

이 글에서는 성체 제 브라피시 뇌실의 산소 소비율과 세포외 산성화 속도를 정량화하여 산화 및 당분해 대사 능력을 특성화하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

세포외 플럭스 분석법을 이용한 전체 재생 제브라피시 뇌실의 체외 대사 활동 평가

배우세요 생체 외 망막 조직에서 산소 소비량과 산화적 인산화를 실시간 측정하는 방법을. 이 기술은 약리학적 처리에 따른 에너지 대사 변화를 정확히 분석하여 망막 질환 연구에 활용됩니다.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

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