Name: Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 배우세요 광활성화 가능한 케이지 분자 접착제 태그를 사용하여 살아있는 세포에서 핵으로의 물질 이동을 시공간적으로 제어하는 방법입니다. 이 기술은 표적 핵 약물 전달 연구에 활용됩니다.

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우리는 NanoBio 통합, 도쿄의 대학에 대 한 중심을 인정합니다. 이 작품은 특정 여 대 한 젊은 과학자 (B) (26810046)를 ko로 부분적으로에서 및 지원 특정 특별히 승진 연구 (25000005)에 대 한 T.A. R.M. 덕분에 일본 사회 연구 장학 과학 (JSP의 승진에 대 한 ) 젊은 과학자와 최고의 대학원 (GPLLI) 프로그램에 대 한.

1. 준비 갇힌접착제-R와 함께 고객님의 태그
<ol><li>우리에 갇힌접착제 NBD 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>우리에 갇힌접착제-NBD (그림 1) 다음 절차를 앞에서 설명한20음성 합성.</li>
		<li>우리에 갇힌접착제-NBD (10mm) 건조 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 재고 솔루션을 준비 합니다. 참고: 어둠 속에서 재고 솔루션을 저장 합니다. 솔루션은 수성 버퍼 또는 셀 문화 미디어 사용 시 희석 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>우리에 갇힌접착제-qd는 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>우리에 갇힌접착제-dibenzocylooctyne (우리에 갇힌접착제-DBCO)를 합성 (그림 1)20을 설명한 이전 절차에 따라.</li>
		<li>우리에 갇힌접착제-DBCO (10 mM) 건조 DMSO에의 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>우리에 갇힌접착제-QD의 준비를 위해 먼저 아 지 드 기능성된 QDs (아 지 드-QD; 준비 그림 3)입니다. DMF의 400 µ L를 100 µ L 아 지 드-PEG4-NHS 에스테 르 (그림 3)의 디 메 틸 formamide (DMF, 125 µ M) 솔루션의 추가 (500 nM) 아민 기능성된 페그 (아민-QD; 코팅 양자 점 (QDs)의 솔루션 그림 3)입니다. 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 저 어.</li>
		<li>재생된 셀 룰 로스 막 3500 분자량 컷오프 (MWCO)와 함께 사용 하 여 DMF의 800 mL에 대 한 24 시간에 대 한 결과 솔루션 dialyze</li>
		<li>우리에 갇힌접착제-DBCO 50 µ m와 DMF의 재고 솔루션을 희석. 포스트 투 석 해결책 (그림 3)에 솔루션의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 3 h에 대 한 혼합물을 저 어.</li>
		<li>재생된 셀 룰 로스 멤브레인 (25000 MWCO)를 사용 하 여 DMF의 800 mL에 대 한 24 시간에 대 한 결과 솔루션 dialyze</li>
		<li>200 결과 솔루션을 희석 DMF nM.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig3.jpg"> 그림 3: 우리에 갇힌접착제-QD의 준비의 회로도 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
2. 현미경 관찰 Hep3B 세포 샘플의 준비
<ol><li>이 글의 최소한의 필수 매체 (EMEM) 포함 하는 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 37 ° C에서 5% 미만에서 인간의 간세포 암 Hep3B 세포 유지 CO2.</li>
	<li>씨 셀 실험 전날입니다. EMEM에 8 연 발 유리 기판의 당 씨 5.0 × 103</li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol>

<ol><li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene+therapy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li>
<li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+for+Cancer%3A+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li>
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<li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer%3A+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li>
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<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue%3A+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li>
<li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+glues+for+manipulating+enzymes%3A+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li>
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<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Photoswitch%3A+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li>
<li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li>
<li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+Bioorthogonal+1%2C3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li>
<li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li>
<li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue%3A+Activation+of+Ion+Permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li>
<li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets%3A+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li>
<li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Klán, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology%3A+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵으로의 이전 조사 갇힌된 NLS7,,89를 사용 하 여 달성 되었습니다. 앞에서 설명 했 듯이, 이러한 방법을 세포질에 NLS 태그 단백질 통합을 추가 기술 해야 합니다. 반면, 우리의 우리에 갇힌접착제-R 태그 사진 유도 핵 전 좌 뿐만 아니라 손님 들의 세포질 통풍 관을 수 있습니다. 이 우리에 갇힌접착제-R 태그 기능은 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 유리입니다.
우리에 갇힌접착제-R 태그 세포 핵에 QDs 같은 고분자 손님을 제공할 수 있습니다. QDs 여기 고용은 더 큰 직경에서 (DH = 15-20 nm) 핵 숨 구멍 보다 (~ 5 nm)24...

유전 정보를 전달, 세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 암 등 다양 한 질병 치료에 효과적 이며 유전 장애1,2,3. 약물의 핵 전달, 펩 티 드의 활용 태그 같은 핵 지 방화 신호 (NLS)4,,56 광범위 하 게 조사 되었습니다. 그러나, 원치 않는 부작용을 줄이기 위해 핵 전 좌의 spatiotemporal 제어 필요 하다.
이전, 빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵에 갇힌된 NLS7,,89를 사용 하 여 달성 되었습니다. NLS 세포질 수송 단백질6에 바인딩하여 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 보고 방법에 갇힌된 NLS 베어링 이용 단백질 직접 microinjection8 세포질에 통합 또는 유전자 코드 확장 기법9를 사용 하 여 대상 셀에 표현. 따라서, 세포질 통풍 관 및 사진 유도 핵 전 좌를 얻을 수 있는 방법을 실용적인 응용 프로그램에 대 한 유리 하다.
여기, 우리 수지상 갇힌된 분자 접착제 (우리에 갇힌접착제-R, 그림 1) 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 빛 트리거 설명 합니다. 수용 성 분자 접착제10,11,12,13,14,15,16,,1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 여러 번+ 펜 던 트 베어링 이전 개발 되었습니다는 단단히 단백질11,12,13,,1415, 준수 16,17, 핵 산18,,1920, 인지질 막21및 찰 흙 nanosheets22,23 통해는 그들의 구+ 펜 던 트 및 대상에 oxyanionic 그룹 사이의 여러 염 다리의 형성. 우리에 갇힌접착제-R의 구+ 펜 던 트 음이온 photocleavable 그룹, 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC)에 의해 보호 됩니다. 우리에 갇힌접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 및 endosomes (그림 2)에서 세포. Photoirradiation에 바NVOC 그룹의 우리에 갇힌접착제-R는 uncaged 분자 접착제 (Uncaged접착제-R) 여러 번+ 펜 던 트를 들고 다음 태그 이용의 마이그레이션을 용이 하 게 하를 떨어뜨려합니다 에 세포질 세포 핵 (그림 2)에 의해 따라. 우리에 갇힌접착제-R 태그는 UV 또는 심각한 phototoxicity 없이 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛에 노출에 의해 갇힌 수입니다. 양자 점 (QDs) 및 형광 염료 (nitrobenzoxadiazole;를 사용 하 여 우리에 갇힌접착제-R 태그, 작은 분자의 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 spatiotemporally 제어 핵 전달 설명 NBD), 예제로 각각.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> 우리에 갇힌접착제-R.의 도식 구조를 그림 1: 9 guanidinium 이온 (+번) 펜 던 트 우리에 갇힌접착제-R의 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) 그룹에 의해 보호 됩니다. BANVOC 그룹은 UV 또는 2 광자 NIR 빛 조사에 의해 죽 습. 우리에 갇힌접착제-R의 초점 핵심은 공업화 nitrobenzoxadiazole (NBD) 또는 dibenzocylooctyne (DBCO). 참조20허가 매 판. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> 그림 2: 고객님의 핵 전 좌 빛 발생의 개요 그림 우리에 갇힌접착제-R 태그 활용. 손님이우리에 갇힌접착제-R 공액 생활으로 채택 / 셀 통해 endocytosis. Photoirradiation에 우리에 갇힌접착제-R 태그는 태그의 endosomal 탈출을 용이 하 게 수 한 Uncaged접착제-R 태그를 감 금. 그 후, 태그 이용 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 참조20허가 매 판. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Azide-PEG4-NHS 에스테르</td><td>클릭 화학 도구</td><td>AZ103</td><td></td></tr><tr><td>Q-dot 655 ITK</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>재생 셀룰로오스 멤브레인 (MWCO 3,500)</td><td>NIPPON Genetics</td><td>TOR-3K</td><td></td></tr><tr><td>재생 셀룰로오스 멤브레인 (MWCO 25,000)</td><td>하버드 장치</td><td>7425-RC25K</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B 세포</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>8챔버 유리 기판</td><td>Nunc</td><td>155411JP</td><td></td></tr><tr><td>96웰 배양 플레이트</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's minimal essential medium (EMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30406.02</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산 완충액 식염수(D-PBS)</td><td>Wako Pure Chemical 산업</td><td>: 045-29795</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Lonza Walkersville</td><td>PA-3015</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Dojindo</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit -8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl-Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>2 광자 여기 레이저 장착 (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td></tr> <tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>크세논 광원</td><td>Asahi Spectra</td><td>LAX-102</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax 패러다임</td><td></td></tr></tbody></table>

photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 다양 한 질병 치료에 효과적입니다. 여기, 우리를 사용 하 여 고객님의 핵 전 좌 빛 트리거 갇힌 분자 접착제 (갇힌접착제-R) 태그, 그 여러 guanidinium 이온 (+번) 펜 던 트 (낙 산 염 대신 음이온 photocleavable 그룹에 의해 보호 됩니다 설명 nitroveratryloxycarbonyl; 바 NVOC)입니다. 우리에 갇힌접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 세포 및 endosomes. 그러나, photoirradiation, 시 우리에 갇힌접착제-R uncaged 분자 접착제 (Uncaged접착제-R) 여러 번+ 펜 던 트를 들고 endosomal 탈출 및 손님 들의 후속 핵 전 좌 용이로 변환 됩니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속 때문에 태그 손님 세포질 세포 핵 다음으로 마이그레이션할 수 있습니다 경우에만 photoirradiated. 갇힌 접착제-R 태그는 작은 분자 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 양자 점 (QDs) 등을 제공할 수 있습니다. 갇힌 접착제-R 태그는 자외선 뿐만 아니라 조직에 깊이 침투 수 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛으로 갇힌 수입니다.

Photoirradiation, 전에 우리에 갇힌접착제 NBD와 incubated Hep3B 세포 전시 그들의 내부에서 punctate 형광 방출 (λext = 488 nm; 그림 4A 고 4 C, 녹색). 유사한 현미경 사진 543에서 여기에 얻은 우리에 갇힌접착제 NBD는 endosomes에 지역화 나타내는 빨간색 형광 염료 (그림 4B , 4c, 빨간색)에 대 한 nm. 따라서, 형광 방출 우리에 갇힌접착제-NBD (그림 4D, 녹색)에 할당할 수 Hoechst 33342와 가시화 했다 세포 핵 밖에 서 관찰 되었다 (λext = 7...

이 프로토콜에 갇힌된 분자 접착제 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌를 빛 트리거 설명 합니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속입니다.

Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

이 방법은 특정 세포 과립에 약물을 전달하는 방법과 같은 약물 전달 영역에서 핵심 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 가스의 핵 전좌가 빛에 의해 유도될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 그룹의 졸업생 인 리나 모가키와 아리사카 아키오입니다.다른 곳에서 자세히 설명된 바와 같이 케이지 분자 접착제를 합성하여 양자점 연계 케이지 분자 접착제를 준비하기 시작한다. 건조 DMSO에 있는 caged 분자 접착제 연결된 dibenzocyclooctyne의 10 밀리머 스톡 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 먼저 aseye 기능화 퀀텀닷을 만들어 서 케이지 분자 접착제를 연결 한 퀀텀닷을 준비합니다.이를 달성하기 위해 DMF에 125 마이크로 몰라 아세아이 PEG4 NHS 에스테르의 100 마이크로 리터를 Amine 기능화 페그로 코팅된 양자 점의 500 나노 몰라를 포함하는 DMF 용액의 400 마이크로 리터에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 생성된 용액을 재생셀룰로오스 멤브레인에 배치하고 800ml의 DMF에 대해 24시간 동안 투석합니다.다음으로 dMF를 사용하여 디벤조사이클로오틴과 연결된 케이지 분자 접착제의 스톡 솔루션을 희석하고 투석 후 용액에 200 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 3시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 그런 다음 25000의 분자량이 잘린 재생셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 신선한 DMF 800ml에 대해 24 시간 동안 생성된 혼합물을 투석합니다.24시간 후 DMF를 사용하여 200 나노몰러로 생성된 용액을 희석시켰습니다. 표준 배양 조건하에서 10%의 FBS를 함유하는 이글의 최소한의 필수 배지에서 인간 간세포 암종 HEP3 B 세포를 유지하십시오. 실험 전 하루 전에 5000 HEP3 B 세포는 배양 배지의 200 마이크로리터에서 8 개의 챔버 유리 슬라이드의 각 우물로.그런 다음 슬라이드를 덮고 24 시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 배양 배지를 제거하고 미리 따뜻워진 PBS 의 100 마이크로리터로 세포를 두 번 헹구는 다. 8 개의 챔버 슬라이드의 각 우물에 형광으로 염색 된 분자 접착제의 10 마이크로 몰라를 포함하는 FBS 무료 배지 200 마이크로 리터를 추가합니다.3시간 동안 배양후 배양 배지를 제거하고 PBS의 100마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는다. 내모를 시각화하기 위해 LysoTracke

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

SNAP - 태그와 클립 태그 단백질 라벨링 시스템은 라이브 세포에 대한 관심의 단백질, 형광 염료를 포함하여 분자의 특정 공유 결합 첨부 파일을 활성화합니다. 일단 복제된과 표현, 태그 단백질 다시 복제하지 않고도 수많은 스트림 애플 리케이션을위한 기판의 다양한 사용할 수 있습니다.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

원자력 교통 단일 분자 이미징

빛으로 작은 GTPase 활동 spatio-시간적 제어를위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 rapamycin-유도 FKBP-FRB의 heterodimerization 및 사진 caging 시스템을 기반으로합니다. 빛을 조사의 최적화는 subcellular 수준에서 작은 GTPases의 spatio-temporally 제어 활성화를 가능하게합니다.

리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 세포핵에 기계적 힘을 직접 적용하고 동시 살아있는 세포 형광 이미징을 수행하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.

3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

이 프로토콜은 광유전학 도구를 통해 핵세포질 수송을 추적하여 얻은 살아있는 세포 이미징 데이터의 자동 분석을 효율적으로 설정하고 수행하는 방법을 설명합니다.

LEXY 및 LINuS 광유전학 도구 및 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화합니다.

배우세요 광활성화 가능한 케이지 분자 접착제 태그를 사용하여 살아있는 세포에서 핵으로의 물질 이동을 시공간적으로 제어하는 방법입니다. 이 기술은 표적 핵 약물 전달 연구에 활용됩니다.

Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

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