Name: 다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 학습하세요 다단계 가닥 변위 리소그래피를 사용하여 유전자 길이 DNA를 표면에 고정하는 방법을 배우세요. 이 기술은 세포 없는 유전자 발현 실험과 합성 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 기꺼이 폭스바겐 재단 (부여 번호 89 883)와 유럽 연구 위원회 (보조금 계약 번호 694410-AEDNA)이이 프로젝트에 대 한 재정 지원을 인정 한다. 석사-미 지원을 통해 GRK 2062 DFG 인정합니다.

<ol><li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li>
<li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li>
<li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li>
<li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biology%3A+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Estévez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription%2Fexpression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li>
<li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+replication%2C+synthesis%2C+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes%3A+a+synthetic+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li>
<li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+prospects+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
<li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li>
<li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).</li>
<li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li>
<li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li>
<li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li>
<li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+by+directional+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li>
<li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li>
<li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nphys3469">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li>
<li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition+In+English%22%5BJournal%5D)">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li>
<li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li>
<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href=" Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

Bephore 리소 그래피는 DNA 또는 RNA의 꽃무늬 동원 정지에 대 한 강력 하 고 다재 다능 한 기술입니다. 그러나, 절차-변경-실패에 대 한 원천이 될 수 있습니다 몇 가지 단계를 포함 하거나 시스템의 성능 감소.
Bephore 칩의 제조에 중요 한 단계는 표면의 생체 적합성을 제공 하는 기판의 PEGylation 이다. 여기, RCA 절차와 청소 단계 중요 하다, 때문에 그것은 또한 후속 silanization에 대 한 표면 활성화. 실제 PEGylation 동안 기판 밖으로 건조 하지 해야 합니다. 또한, Silane 못 Biotin 저장 되어야 한다 제대로 그것의 반응성 (섹션 1.2)를 보존 하 고 가교를 피하기 위하여. PEGylation의 결과 평가 하기 위해 기판 붙일 레이블된 streptavidin과 인 큐베이 팅 고 비 PEGylated 컨트롤에 비해 수 수 있습니다. 성공적으로 PEGylated 기판 컨트롤 보다 상당히 더 많은 streptavidin을...

세포-유전자 발현 반응 생화학, 생명 공학, 및 합성 생물학에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 큰 관심은 무료. 단백질 세포 자유로운 표현의 구조 생물학에서 수많은 연구를 위한 기초를 했다 순수 단백질 견본의 준비를 위한 수단이 되었다. 예를 들어, 셀-무료 시스템 성공적으로 어려운 셀 기반으로 식을 사용 하 여 생산 하는 단백질 단지1 또는 막 단백질2의 식에 사용 되었다. 특히, 셀-무료 유전자 발현 반응 했다 또한 19613Nirenberg 그리고 Matthaei에 의해 획기적인 실험과 함께 시작 하는 유전 코드의 구조를 명료 하 게 하는 데 사용 됩니다.
최근, 생명 공학 및 합성 생물학4,,56셀 자유로운 방법에 관심을 갱신된 되었습니다. 셀-무료 시스템 비 생물학 화합물, 증강 될 수 및 다양 한 생물학 근원의 부품을 보다 쉽게 결합 될 수 있다7. 비록 셀 무료 시스템 명백한 단점은 "성장 하 고 분할" 하지 않습니다, 그것은 오픈 셀 무료 bioreactors 기본적인 신진 대사 기능을 준비 하 고 합성 대사 간단한 탄소 및 에너지 제공 하는 때 그들을 입력8. 합성 생물학의 신흥 분야, 내 셀 무료 시스템 예측 "섀시" 구현 위한 합성 생물학 기능 되도록 약속 드립니다.
현재, 셀-무료 유전자 식 반응 중 하나를 사용 하 여 수행 됩니다 (다른 소스에서 박테리아, 효 모, 곤충 등), 셀 추출 또는 다른 응용 프로그램 (예를 들어, 최적화 된 전사/번역 시스템 간결한 대 진 핵 유전자 식, 막 단백질 등의 생산). 세균성 세포 추출 물 (일반적으로 TXTL에 게 불리는)의 준비에 대 한 인기 있는 프로토콜 V. Noireaux와 동료9에의해 최근 제공 했다. 생물 속성 철저 하 게 특징이10, 그리고 TXTL 시스템은 이미 성공적으로 사용 되어 일련의 복잡 한 생 화 확 적인 작업을 수행 하기 위해: 예를 들어, 을 통해 기능 살 균 소의 어셈블리 셀-무료 식 살 균 소 게놈11, 세균성 단백질 필 라 멘 트12, 합성 또는 셀 무료 유전자 회로13,14의 구현입니다.
셀-무료 합성 생물학에서 인기 있는 또 다른 시스템은 정화 부품15,16에서 재구성 순수한 시스템. TXTL 시스템에 비해, 그것은 포함 하지 않는다 nucleases 또는 단백질 저하 기계. 동안 선형 DNA의 저하, RNA 분자 또는 단백질은 문제점의 더 적은 순수한 시스템에서 충 경로 실제로 동적 기능 구현에 대 한 중요 한. (RecBCD)를 통해 TXTL 시스템에서 선형 유전자 템플릿의 exonuclease 저하의 영향을 줄이기 위해 최종 보호 GamS 단백질을 추가할 수 있다. TXTL와 순수 시스템 모두 상업적으로 사용할 수 있습니다.
주제를 밀접 하 게 관련 셀 무료 생물학 문제에 생 화 확 적인 반응에 구획의 효과 및 추가 인공 세포와 같은 구조 또는 protocells17,18,19의 창조의 연구 ,20. 인공 세포에 대 한 연구는 일반적으로 내부 기공을 구획 인지질 또는 다른 amphiphiles에서 만든 생 화 확 적인 반응 시스템의 캡슐화를 포함 한다. 동안 이러한 시스템 구획의 근본적인 측면 또는 cellularity 각자 복제의 출현을 탐구 하는 데 도움이, 그들은 폐쇄 시스템의 일반적인 문제를 직면 하는 것: 작동 물질 대사 및 적절 한 부재에 막 전송 메커니즘, 그것은 한정된 반응 시간의 연장된 기간에 대 한 실행을 계속 하기 어려운-연료 분자 사용 되 고 폐기물 축적.
이러한 셀을 흉내 낸 구획 내부 구획에 흥미 있는 대안 photolithographic 방법을 사용 하 여 유전 물질의 공간 조직 이다. "칩에 유전자"의 동원 정지 바이 츠만 연구소에 바-Ziv 그룹으로 10 여 년 전 개척 했다21. 주요 문제를 확인할 수 있도록 했다 중 DNA의 일반적인 흡착 및 칩 표면에 단백질의 잠재적인 변성 했다. 바-Ziv 외. "데이지", immobilization 이산화 규소 표면에 저항 분자의 긴 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서 보장에 대 한 반응성 터미널 실 란의 구성 되었다 불리는 전용된 사진 평판 저항 개발 생체 적합성, 그리고 방사선 자외선 (UV) 빛에 따라 반응 아민으로 개조 되었다 photocleavable headgroup. 그것은 데이지 유전자 길이 DNA 분자 (몇 킬로 기본적인 쌍 (kbp)의 길이)와 칩 표면에 고정 하는 데 사용 될 수 표시 되었습니다. 고분자 물리학의 관점에서 시스템 고체 기판에 융합 하는 고분자 브러쉬 표시. DNA의 전해질 특성상 이러한 브러시의 구조는 삼 투 및 기타 이온 특정 효과22,23강력 하 게 영향을.
가장 중요 한 것은, 그것은 기판 움직일 유전자 여전히 작동 하 고 베낀 고로 번역 해 RNA와 단백질 수 표시 되었습니다. 유전자 브러쉬 솔루션24에서 RNA polymerases 액세스할 수 있습니다 그리고 녹음/번역의 복잡 한 고분자 혼합물은 표면에 변성 되지. 기판에 유전 구성의 동원 정지의 장점 중 하나는 그들은 작은 선구자 분자와 어떤 폐기물 제거25 수에서 지속적으로 제공 하는 열린 미세 반응 기 시스템에서 동작할 수 있습니다. , 26.
우리는 최근 변종 (생체 전자 빔 및 감광 제)에 대 한 Bephore27, 상업적으로 사용 가능한 구성 요소에 독점적으로 근거 했다 하 고 시퀀스 특정 DNA 가닥 침공에 대 한 반응을 활용 되 나이 방법의 개발 칩 기반 인공 세포의 생성에 대 한 간단한 구현 다단계 리소 그래피 절차의 실현. 절차의 개요 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그것은 DNA 머리 핀 분자 photocleavable 그룹을 포함 하는 생체 못 레이어에 움직일을 기반으로 합니다. Photocleavage는 머리 핀의 어떤 DNA를 통해 ("전치" 표시 시퀀스를 포함 하는)의 분자 발 중재 가닥 침략에 연결 된 를 통해 수 단일 가닥 발 시퀀스를 제공 합니다.
데이지의 매우 조밀 하 고 깨끗 한 수 Bephore 잠재적으로 간단 하 게 구현 하는, "유전자 브러쉬", 특정 응용 프로그램에서 장점을. 그러나 원칙적으로,, 데이지와 Bephore 석판 수 쉽게 결합. DNA를 구성 하기 위한 DNA 가닥 변위 골드 브러쉬 활용 관련된 리소 그래피 방법 이전 황 외.에 의해 개발 되었다 하지만 하지 셀 무료 유전자 식28,29의 문맥에서 이용 되었다.
다음 프로토콜 Bephore 메서드를 사용 하 여 셀 무료 유전자 발현에 대 한 브러쉬 DNA의 생산에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 우리는 유전자 칩 조작 방법과 칩에 유전자의 공간 구조적된 동원 정지에 대 한 다단계 포토 리소 그래피의 사용을 설명 합니다. 우리는 또한 반응 챔버의 제조 및 마이크로 칩에 유전자 식 반응의 성능에 대 한 응용 프로그램 토론.

<table><tbody><tr><td>50nm 이산화규소가 있는 실리콘 웨이퍼(Bephore 기판)</td><td>Siegert 웨이퍼</td><td></td><td>두께(&마이크로; m): 525 &플러스mn; 25, 직경 (mm) : 100</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼 (PDMS 마스터 몰드 용)</td> <td>Siegert 웨이퍼</td><td></td><td>두께 (&micro; m): 525 &플러스mn; 25, 직경 (mm) : 76.2 (3 ")</td></tr><tr><td>유리 슬라이드 번호 4</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>유리 슬라이드 번호 1.5</td><td>Assistent</td><td></td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>비오틴-PEG-실란</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>MW 5,000</td></tr><tr><td>무수 톨루엔</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Integrated DNA Technologies ( IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR 마스터 믹스와 HF 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>PCR 키트</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>스핀-컬럼 PCR 클린업 키트</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>세포-무료 발현 시스템</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 튜빙 (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td><td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>마이크로 레지스트 기술&nbsp; </td><td></td> GmbH <td>포토레지스트</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>마이크로 레지스트 기술&nbsp; </td><td></td> GmbH <td>포토레지스트 개발자</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>접착 촉진제</td></tr><tr><td>두 구성 요소 실리콘 접착제</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>자외선 차단 황색 호일</td><td>Lithoprotect(MicroChemicals를 통해)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masks for photolithography</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 mm</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>포토리소그래피 및 형광 이미징</td></tr><tr><td>60x Water Immersion Objective</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Olympus BX51, NA 0.9</td></tr><tr><td>20x 침수 대물렌즈</td>와 함께 사용 <td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Olympus BX51, NA 0.5</td></tr><tr><td>카메라</td><td>광도 인식</td><td>Coolsnap HQ</td><td>Olympus BX51</td></tr><tr><td>Ligtht source</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>와 함께 사용 Olympus BX51</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>형광과 함께 사용 유전자 발현 이미징</td></tr><tr><td>4x 대물</td>렌즈 <td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda</td><td>Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>카메라</td><td>및 Neo5.5</td>와 함께 <td></td><td>사용 Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>광원</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td><td>Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>케이지 인큐베이터</td>와 함께 사용 <td>Okolab</td><td>굵은 선</td><td>Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>압력 컨트롤러</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3와 함께 사용</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td></td><td>DNA 농도 측정</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W, 패러데이 케이지의 샘플과 함께 0.8mbar에서 작동</td></tr></tbody></table>

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

있고 구조화 된 표면에 유전자의 동원 정지에 오픈 미세 생물 반응 기 시스템에서 식 프로세스를 compartmentalized 유전자의 연구 수 있습니다. 인공 세포 시스템으로 다른 접근, 달리 등 설치 유전자 표현 시 약 및 동시 배출 폐기물의 지속적인 공급에 대 한 수 있습니다. 이 동적 유전자 규정 피드백 시스템의 실현을 위한 중요 한 시간의 연장된 기간 동안 셀 무료 유전자 식 프로세스의 구현을 지원 합니다. 여기 우리 기술을 사용 하 여는 사용 하기 간단 석판 DNA 가닥 변위 반응에 따라 독점적으로 상업적으로 사용 가능한 구성 요소를 사용 하 여 유전 봄에는 제작에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 또한 제공 하는 프로토콜 compartmentalized 유전자의 통합에입니다 (PDMS)-미세 시스템을 기반으로. 또한, 우리는 시스템 DNA와 식 믹스에 포함 된 분자 사이 분자 상호 작용의 직접적인 관측을 위해 사용 될 수 있는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 호환 되는지 보여줍니다.

2 단계 리소 그래피: 그림 5 겹치는 붙일 레이블된 표시 가닥의 패턴 유리 슬라이드에는 두 단계로 석판의 결과 보여 줍니다.
형광 단백질 유전자 브러시에서의 표현: 그림 6 고정된 DNA에서 형광 단백질 YPet의 식을 보여 줍니다. 여러 지점에서 시간에 우리는 부분적으로 형광 단백질을 표백 하 고 형광 신호의 복구를 관찰 하 여 진 식 속도 평가, 단백질 식에서 발생 하지 않는 즉각적인 복구 무시. 첫 번째 표백 후 식의 2 시간에서 형광 강도 신속 하 게 복구 고 그 값 보다는 표백 하기 전에. 4 ~ 6 시간 후 형광은 신선한 식 혼합의 공급 없이 반응 약 3-4 시간 후 종료를 나타내는 그것의 이전 강도에 복구 되지 않았다.
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우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

DNA 바이오칩은 원래 BASF 그룹이 개발한 자가 합성 생물학을 위한 매력적인 연구 플랫폼으로, 장기간 시험관 내 유전자 회로의 작동을 허용합니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 이 기술을 광범위한 연구자들이 사용할 수 있기를 희망합니다. 우리의 방법, 불리는 bephore 리소그래피, DNA 가닥 변위 반응을 기반으로 DNA의 고정화를위한 전략을 나타냅니다.이 기술의 강점은 다단계 석역 기능, 단순한 재현성 및 모든 구성 요소의 상업적 가용성에 있습니다. 다른 바이오칩 솔루션과 마찬가지로, bephore는 다른 기술과 결합될 수 있습니다. 예를 들어, 기능성 유전자 브러쉬는 단백질 발현을 위해 마이크로 컴파트먼트 내에서 조립될 수 있다.시작하려면, 유리 비커에 30 % 암모니아 용액의 한 부분과 다섯 부분의 물을 혼합하여 RCA 혼합물을 준비합니다. 저어주면서 뜨거운 접시에 70도까지 혼합물을 가열합니다. 섭씨 70도에 도달하면 과산화수소 1부 30%를 추가합니다.그런 다음 100mm 직경의 실리콘 웨이퍼를 용액에 넣고 유기 물질과 입자를 제거합니다. 30분 후, 기판을 꺼내 서두병에서 물로 철저히 헹구고 질소 총으로 건조시다. 즉시 기판의 PEGylation을 진행합니다.이를 위해 먼저 비오틴-페그-셀레인을 건조 톨루엔에서 밀리리터당 5밀리그램으로 희석하고, 잘 섞일 때까지 용액을 소용돌이시킵니다. 유리 페트리 접시에 배치 기판으로, 천천히 전체 표면을 덮고, 기판에 용액을 피펫하지만, 용액이 가장자리를 통해 흐르지 않도록. 표면이 덮여 나면 페트리 접시를 닫은 다음 커버를 추가합니다.30분 후 커버를 제거하고 페트리 접시에 약 40밀리리터의 이소프로필 알코올을 넣습니다. 그런 다음 기판을 꺼내 이소프로필 알코올로 다시 완전히 헹구고 질소 총으로 건조시십시오. 건조하면 기판이 필요할 때까지 어둠 속에서 보관하십시오.유리 커터 나 메스를 사용하여 기판을 준비하여 1 센티미터씩 1 센티미터를 형성합니다. 그런 다음 중앙에서 기판 의 가장자리를 향해 짧은 스크래치를 만들어 간단한 정렬 마크를 추가합니다. 질소 총을 사용하여 칩에서 작은 입자를 날려 버리면 됩니다.다음으로, 2성분 실리콘 접착제의 두 방울을 섞고, 접착제를 칩 표면에 적용하여 스크래치 끝 주위의 영역을 비워 둡시. 이 접착제는 소수성 장벽을 제공하여 칩에 수성 솔루션을 유지합니다. 이것은 후속 세척 단계를 용이하게하고, 잠복에 필요한 DNA의 양을 감소시킨다.나중에 접착제를 쉽게 벗을 수 있습니다. 다음 단계에서는 광경증 DNA가 황색 광 환경에서만 처리됩니다. 실온에서 약 10 마이크로리터의 소리터로 칩을 덮고, 칩을 물로 부분적으로 채워진 상자에 넣고 증발을 줄입니다.1 시간 후, 어떤 바운드 bephore 믹스를 제거하기 위해 PBS와 칩을 여러 번 세척. 다음으로, 칩에 통과 믹스의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 2시간 후 PBS로 칩을 여러 번 세척하여 불바운드 통과제를 제거합니다.적합한 마스크 홀더에 맞게 인쇄 된 사진 마스크를 적절한 크기로 잘라냅니다. 필드 정지위치에 삽입하고 정렬 표시를 사용하여 홀더의 마스크를 정렬합니다. 기판이 현미경 단계에 배치되면 조명 경로에 빨간색 필터를 삽입하고 기판 표면에 집중합니다.그런 다음, 노출될 기판의 영역으로 이동한다. 다음으로, 마스크 홀더를 삽입하고, 조명을 차단하고, UV 필터로 변경한다. 낮은 조명 강도에서 셔터를 열고 카메라를 사용하여 마스크를 기판에 빠르게 집중시하십시오.기판이 정렬되고 마스크가 초점을 맞추고 카메라로의 광 경로를 차단하고 원하는 노출 시간에 대해 고광 강도로 기판을 비춥니다. 노출 후 현미경에서 샘플을 제거하고 건조하지 않고 기판에서 가능한 한 많은 버퍼를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 표면에 부착하기 위한 서열과 함께 10~20마이크로리터의 DNA를 추가한다.기판을 젖은 상자에 놓고 건조를 막고 실온에서 2 시간 동안 기판에 DNA를 배양하십시오. 반전된 현미경으로 구획화된 유전자 발현을 관찰하기 위해 먼저 샘플 홀더의 두 부분을 별도로 준비한다. 먼저 양면 접착 테이프를 사용하여 고정 유전자 브러시로 칩 홀더에 접착합니다.다음으로 홀더의 아래쪽 부분의 중앙 구멍 주위에 진공 그리스를 추가하고 칩 홀더를 삽입합니다. 이제 홀더의 상단 부분을 조립합니다. 구획이 가능한 한 작은 얇은 PDMS 칩을 잘라, 나중에 확산에 의해 폐기물과 전구체 분자의 교환을 허용하기 위해 한쪽으로 채널을 열어 두고, 플라즈마 처리 는 산소 플라즈마와 PDMS 칩의 뒷면에 유리 커버 슬립을 처리.처리 직후 PDMS 칩을 유리 슬라이드 중앙에 놓고 구획이 위쪽으로 향합니다. 그런 다음, 70섭씨에서 1시간 동안 PDMS로 유리를 굽습니다. 전체 샘플 홀더를 조립하기 직전에, 플라즈마는 이전과 같은 PDMS 칩으로 유리 슬라이드를 처리합니다.그런 다음 상단 홀더의 큰 구멍 주위에 진공 그리스를 추가하고 PDMS로 유리 슬라이드를 놓습니다. 유리를 그리스에 부드럽게 누릅니다. 조심스럽게 칩에서 버퍼를 제거하고, 자기 재표현 시스템의 10 마이크로 리터로 한 번 세척합니다.다음으로, 칩에 60 마이크로리터의 자기 재발현 시스템을 추가하고 가장자리에서 2성분 실리콘 접착제를 제거합니다. 이제 식 시스템의 마이크로리터 20개를 PDMS에 추가합니다. 액적을 PDMS에 넣은 후, 구획이 잘 젖고 기포가 없는 입체 현미경을 신속하게 확인하십시오.기포가 있는 경우 씻어내십시오. 홀더의 두 조각을 조립하고 챔버와 DNA 브러시를 정렬하려면 입체 현미경으로 작동합니다. 두 개의 나사와 윙넛이 양손으로 쉽게 접근 할 수 있도록 그리퍼 팔로 바닥 홀더를 고정하십시오.상단 홀더를 아래쪽 홀더에 삽입하고 셀 프리 식 시스템 방울이 융합될 때까지 낮춥춥시다. 그런 다음 구획과 정렬 표시가 XY 평면의 유사한 영역에 있는지 확인합니다. 아래에서 홀더의 아래쪽을 만질 때까지 윙넛을 나사로 만듭니다.XY 평면의 구획과 칩을 정렬하는 동안 날개너트를 부드럽게 조입니다. 이 단계에서는 몇 가지 경험이 필요하며 샘플 홀더의 구성에 따라 다릅니다. PDMS는 부드러운 힘으로만 칩에 눌러야합니다.다음으로, 증발 방지 인클로저에 스폰지를 물로 뿌리고 홀더를 상자에 삽입합니다. 그런 다음 5 밀리리터 주사기를 2성분 실리콘 접착제로 채우고 상자를 밀봉하는 데 사용합니다. 마지막으로, 상자를 온도 제어 현미경으로 옮기고, 형광 현미경을 사용하여 DNA 브러시와 반응을 이미지한다.2 단계 lithographic 과정, 여기 bephore 유리 슬라이드에 수행, 형광 으로 표시 된 DNA 가닥의 중복 패턴을 산출. 온칩 유전자 발현의 이 데모에서, DNA는 왼쪽의 챔버에서 고정된다. 발현 믹스에 노출되면, 황색 형광 단백질 YPet는 고정 된 DNA로부터 합성된다.유전자 발현 시스템의 활성을 평가하기 위해, 표백 단계 후에 형광의 회복이 관찰된다. 2시간 만에 형광 강도가 빠르게 회복되었습니다. 그러나 4시간 6시간 후에는 회복되지 않아, 표현혼합물의 신선한 공급없이 반응이 4시간 전후로 종료되었음을 나타낸다.유전자 발현은 폐쇄된 시스템에서 제한되지만, 미세 유체를 통해 추가 전구체 분자를 가진 발현 구획을 공급함으로써 장기간 지속될 수 있다. 상기 포근 방법은 자가 유전자 발현을 위해 상호작용하는 DNA 브러시의 시스템을 구성하는 데 적용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 길이 DNA를 고정화하는 데 사용된다. 기술은 또한 단일 분자 형광 연구와 같은 생물 물리학에 있는 그밖 응용을 위해 이용될 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 웨이퍼 나 유리 슬라이드에서 비포어 바이오 칩을 제작하고 연구 프로젝트에 통합 할 수 있어야합니다.

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연구

JoVE Journal

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생명공학

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여기서 우리는 DNA 프로그래밍 된 접착력을 사용하여 단일 세포 해상도에서 마이크로 패턴 세포에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 벤치탑 포토리소그래피 플랫폼을 사용하여 유리 슬라이드에 DNA 올리고뉴클레오티드 패턴을 만든 다음 상업적으로 사용할 수 있는 보완적인 올리고뉴클레오티드로 세포막을 라벨로 표시합니다. 올리고스의 혼성화는 프로그램된 세포 접착을초래한다.

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학습하세요 다단계 가닥 변위 리소그래피를 사용하여 유전자 길이 DNA를 표면에 고정하는 방법을 배우세요. 이 기술은 세포 없는 유전자 발현 실험과 합성 생물학 연구에 활용됩니다.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

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