다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

DNA 바이오칩은 원래 BASF 그룹이 개발한 자가 합성 생물학을 위한 매력적인 연구 플랫폼으로, 장기간 시험관 내 유전자 회로의 작동을 허용합니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 이 기술을 광범위한 연구자들이 사용할 수 있기를 희망합니다. 우리의 방법, 불리는 bephore 리소그래피, DNA 가닥 변위 반응을 기반으로 DNA의 고정화를위한 전략을 나타냅니다.

이 기술의 강점은 다단계 석역 기능, 단순한 재현성 및 모든 구성 요소의 상업적 가용성에 있습니다. 다른 바이오칩 솔루션과 마찬가지로, bephore는 다른 기술과 결합될 수 있습니다. 예를 들어, 기능성 유전자 브러쉬는 단백질 발현을 위해 마이크로 컴파트먼트 내에서 조립될 수 있다.

시작하려면, 유리 비커에 30 % 암모니아 용액의 한 부분과 다섯 부분의 물을 혼합하여 RCA 혼합물을 준비합니다. 저어주면서 뜨거운 접시에 70도까지 혼합물을 가열합니다. 섭씨 70도에 도달하면 과산화수소 1부 30%를 추가합니다.

그런 다음 100mm 직경의 실리콘 웨이퍼를 용액에 넣고 유기 물질과 입자를 제거합니다. 30분 후, 기판을 꺼내 서두병에서 물로 철저히 헹구고 질소 총으로 건조시다. 즉시 기판의 PEGylation을 진행합니다.

이를 위해 먼저 비오틴-페그-셀레인을 건조 톨루엔에서 밀리리터당 5밀리그램으로 희석하고, 잘 섞일 때까지 용액을 소용돌이시킵니다. 유리 페트리 접시에 배치 기판으로, 천천히 전체 표면을 덮고, 기판에 용액을 피펫하지만, 용액이 가장자리를 통해 흐르지 않도록. 표면이 덮여 나면 페트리 접시를 닫은 다음 커버를 추가합니다.

30분 후 커버를 제거하고 페트리 접시에 약 40밀리리터의 이소프로필 알코올을 넣습니다. 그런 다음 기판을 꺼내 이소프로필 알코올로 다시 완전히 헹구고 질소 총으로 건조시십시오. 건조하면 기판이 필요할 때까지 어둠 속에서 보관하십시오.

유리 커터 나 메스를 사용하여 기판을 준비하여 1 센티미터씩 1 센티미터를 형성합니다. 그런 다음 중앙에서 기판 의 가장자리를 향해 짧은 스크래치를 만들어 간단한 정렬 마크를 추가합니다. 질소 총을 사용하여 칩에서 작은 입자를 날려 버리면 됩니다.

다음으로, 2성분 실리콘 접착제의 두 방울을 섞고, 접착제를 칩 표면에 적용하여 스크래치 끝 주위의 영역을 비워 둡시. 이 접착제는 소수성 장벽을 제공하여 칩에 수성 솔루션을 유지합니다. 이것은 후속 세척 단계를 용이하게하고, 잠복에 필요한 DNA의 양을 감소시킨다.

나중에 접착제를 쉽게 벗을 수 있습니다. 다음 단계에서는 광경증 DNA가 황색 광 환경에서만 처리됩니다. 실온에서 약 10 마이크로리터의 소리터로 칩을 덮고, 칩을 물로 부분적으로 채워진 상자에 넣고 증발을 줄입니다.

1 시간 후, 어떤 바운드 bephore 믹스를 제거하기 위해 PBS와 칩을 여러 번 세척. 다음으로, 칩에 통과 믹스의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 2시간 후 PBS로 칩을 여러 번 세척하여 불바운드 통과제를 제거합니다.

적합한 마스크 홀더에 맞게 인쇄 된 사진 마스크를 적절한 크기로 잘라냅니다. 필드 정지위치에 삽입하고 정렬 표시를 사용하여 홀더의 마스크를 정렬합니다. 기판이 현미경 단계에 배치되면 조명 경로에 빨간색 필터를 삽입하고 기판 표면에 집중합니다.

그런 다음, 노출될 기판의 영역으로 이동한다. 다음으로, 마스크 홀더를 삽입하고, 조명을 차단하고, UV 필터로 변경한다. 낮은 조명 강도에서 셔터를 열고 카메라를 사용하여 마스크를 기판에 빠르게 집중시하십시오.

기판이 정렬되고 마스크가 초점을 맞추고 카메라로의 광 경로를 차단하고 원하는 노출 시간에 대해 고광 강도로 기판을 비춥니다. 노출 후 현미경에서 샘플을 제거하고 건조하지 않고 기판에서 가능한 한 많은 버퍼를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 표면에 부착하기 위한 서열과 함께 10~20마이크로리터의 DNA를 추가한다.

기판을 젖은 상자에 놓고 건조를 막고 실온에서 2 시간 동안 기판에 DNA를 배양하십시오. 반전된 현미경으로 구획화된 유전자 발현을 관찰하기 위해 먼저 샘플 홀더의 두 부분을 별도로 준비한다. 먼저 양면 접착 테이프를 사용하여 고정 유전자 브러시로 칩 홀더에 접착합니다.

다음으로 홀더의 아래쪽 부분의 중앙 구멍 주위에 진공 그리스를 추가하고 칩 홀더를 삽입합니다. 이제 홀더의 상단 부분을 조립합니다. 구획이 가능한 한 작은 얇은 PDMS 칩을 잘라, 나중에 확산에 의해 폐기물과 전구체 분자의 교환을 허용하기 위해 한쪽으로 채널을 열어 두고, 플라즈마 처리 는 산소 플라즈마와 PDMS 칩의 뒷면에 유리 커버 슬립을 처리.

처리 직후 PDMS 칩을 유리 슬라이드 중앙에 놓고 구획이 위쪽으로 향합니다. 그런 다음, 70섭씨에서 1시간 동안 PDMS로 유리를 굽습니다. 전체 샘플 홀더를 조립하기 직전에, 플라즈마는 이전과 같은 PDMS 칩으로 유리 슬라이드를 처리합니다.

그런 다음 상단 홀더의 큰 구멍 주위에 진공 그리스를 추가하고 PDMS로 유리 슬라이드를 놓습니다. 유리를 그리스에 부드럽게 누릅니다. 조심스럽게 칩에서 버퍼를 제거하고, 자기 재표현 시스템의 10 마이크로 리터로 한 번 세척합니다.

다음으로, 칩에 60 마이크로리터의 자기 재발현 시스템을 추가하고 가장자리에서 2성분 실리콘 접착제를 제거합니다. 이제 식 시스템의 마이크로리터 20개를 PDMS에 추가합니다. 액적을 PDMS에 넣은 후, 구획이 잘 젖고 기포가 없는 입체 현미경을 신속하게 확인하십시오.

기포가 있는 경우 씻어내십시오. 홀더의 두 조각을 조립하고 챔버와 DNA 브러시를 정렬하려면 입체 현미경으로 작동합니다. 두 개의 나사와 윙넛이 양손으로 쉽게 접근 할 수 있도록 그리퍼 팔로 바닥 홀더를 고정하십시오.

상단 홀더를 아래쪽 홀더에 삽입하고 셀 프리 식 시스템 방울이 융합될 때까지 낮춥춥시다. 그런 다음 구획과 정렬 표시가 XY 평면의 유사한 영역에 있는지 확인합니다. 아래에서 홀더의 아래쪽을 만질 때까지 윙넛을 나사로 만듭니다.

XY 평면의 구획과 칩을 정렬하는 동안 날개너트를 부드럽게 조입니다. 이 단계에서는 몇 가지 경험이 필요하며 샘플 홀더의 구성에 따라 다릅니다. PDMS는 부드러운 힘으로만 칩에 눌러야합니다.

다음으로, 증발 방지 인클로저에 스폰지를 물로 뿌리고 홀더를 상자에 삽입합니다. 그런 다음 5 밀리리터 주사기를 2성분 실리콘 접착제로 채우고 상자를 밀봉하는 데 사용합니다. 마지막으로, 상자를 온도 제어 현미경으로 옮기고, 형광 현미경을 사용하여 DNA 브러시와 반응을 이미지한다.

2 단계 lithographic 과정, 여기 bephore 유리 슬라이드에 수행, 형광 으로 표시 된 DNA 가닥의 중복 패턴을 산출. 온칩 유전자 발현의 이 데모에서, DNA는 왼쪽의 챔버에서 고정된다. 발현 믹스에 노출되면, 황색 형광 단백질 YPet는 고정 된 DNA로부터 합성된다.

유전자 발현 시스템의 활성을 평가하기 위해, 표백 단계 후에 형광의 회복이 관찰된다. 2시간 만에 형광 강도가 빠르게 회복되었습니다. 그러나 4시간 6시간 후에는 회복되지 않아, 표현혼합물의 신선한 공급없이 반응이 4시간 전후로 종료되었음을 나타낸다.

유전자 발현은 폐쇄된 시스템에서 제한되지만, 미세 유체를 통해 추가 전구체 분자를 가진 발현 구획을 공급함으로써 장기간 지속될 수 있다. 상기 포근 방법은 자가 유전자 발현을 위해 상호작용하는 DNA 브러시의 시스템을 구성하는 데 적용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 길이 DNA를 고정화하는 데 사용된다. 기술은 또한 단일 분자 형광 연구와 같은 생물 물리학에 있는 그밖 응용을 위해 이용될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 웨이퍼 나 유리 슬라이드에서 비포어 바이오 칩을 제작하고 연구 프로젝트에 통합 할 수 있어야합니다.