Name: 풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 자성 나노입자를 이용한 E plus E 기법으로 희귀 항원 특이 T 세포를 풍부하게 확장하는 방법. 이 기술은 면역요법 및 기초 면역학 연구에 활용됩니다.

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J.W.H.는 NanoBioTechnology, 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 (DGE-1232825), 및 장학금 지원에 대 한 호 재단에 대 한 존스 홉킨스 연구소에서 NIH 암 나노기술 교육 센터를 감사합니다. 이 작품에서 건강의 국가 학회 (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/메릴랜드 혁신 이니셔티브, Coulter 재단 (JPS) 지원에 의해 투자 되었다.

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<li>Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+Inspired+Design+of+Nanoparticle+Artificial+Antigen-Presenting+Cells+for+Immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation.</a> Nano Letters. 17 (11), (2017).</li>
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<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+CD8%2B+melan-A-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+adoptive+transfer+in+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).</li>
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<li>Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+complementary+methods+for+predicting+peptides+binding+major+histocompatibility+complex+molecules1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1.</a> Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).</li>
<li>Castle, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+mutanome+for+tumor+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Exploiting the mutanome for tumor vaccination.</a> Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).</li>
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<li>Srivastava, P. K., Duan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+antigenic+fingerprint+of+each+individual+cancer+for+immunotherapy+of+human+cancer%3A+genomics+shows+a+new+way+and+its+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+immunogenic+tumour+mutations+by+combining+mass+spectrometry+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing.</a> Nature. 515 (7528), 572(2014).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+neoantigen-specific+lymphocytes+in+the+peripheral+blood+of+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.</a> Nature medicine. 22 (4), 433(2016).</li>
</ol>

저자 선언 다음 경쟁 금융 interest(s): NexImmune와 존스 홉킨스 대학 간의 라이선스 계약, 조나단 Schneck 대학이에 설명 된 제품의 판매에 의해 받은 로열티의 공유를 받을 권리가 있다 기사입니다. 그는 또한 NexImmune의 설립자 고 회사에서 주식을 소유 하 고. 그는 NexImmune의 이사회, 과학 자문 위원회의 회원으로 서 제공합니다. 이러한 준비의 용어를 검토 하 고 상충 정책에 따라 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다.

우리는 새로운 항 원 특정 T 세포 격리 기술 나노 인공 항 원 제시 세포 (aAPCs)에 기반을 만들었습니다. 나노 aAPCs 펩 티 드-로드 MHC T 세포 항 원 특정 바인딩 및 co-stimulatory 활성화 함께 활성화를 허용 하는 표면에 합니다. aAPCs 상자성, 있으며 따라서 자기장을 사용 하 여 희귀 한 항 원 특정 T 세포를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 우리는 최적화 하 고 주요 나노 크기, ligand 밀도, 그리고 ligand 선택과 바인딩, 농축, 활성화 및 셀-농축 (보충 파일 1-상자 1)에 대 한 영향의 속성을 공부.
따라서, 몇몇의 항 원 특정 CD8 + T 세포 확장에 농축 및 확장 프로시저 결과 thousand-fold 항 원 특정 비율 60% 높은 생산 고, 모두 인간과 murine 설정 (보조 파일 2-상자 2에서 에서 사용할 수 있습니다. ). 이러한 높은 숫자와 비율 항 ...

많은 immunotherapies의 증가 함께 특성화 및 면역 반응을 제어할 수 있을 필요가 있다. 특히, 적합 한 면역 반응 특이성 및 셀의 내구성 때문에 관심사의 이다. 최근, 공상 항 원 수용 체 T 세포 치료 암 치료; 대 한 승인 되었습니다. 그러나, 항 원 수용 체는 일반적인 세포 표면 항 원 CD19, 특정 암1항 대신 떨어져 근거한 다. 특이성, 넘어 immunotherapies 제어, 그리고 제한 된 암이 나 자가 면역 내 동적 면역 반응을 이해의 부족에서 또한 겪을 수 있다.
항 원 특정 응답을 공부 하는 과제 중 하나는 그들의 매우 낮은 주파수, 예를 들어., 항 원 특정 T 세포는 모든 10의 14 106 T 세포2,3. 따라서, 조사는 T 세포가 존재 하거나, 셀 중 농축 하 고 확장 될 필요가 그들의 신호 증폭 될 필요가. 그것은 비싼 고 항 원 특정 셀의 확장에 초점을 현재 기법을 사용 하 여 피더 세포를 유지 하기 어렵다입니다. 항 원 특정 T의 신호 증폭에 초점 현재 기술을 세포, 효소 연결 된 immunospot (ELISPOT) 분석 결과 처럼, 다시 그 T 세포4의 사용 제한. 마지막으로, 낮은 감도 때문에 종종 이러한 두 기술이 필요 항 원 특정 열거형에 대 한 결합.
이러한 문제를 해결 하는 자기 나노 입자 기반 인공 항 원 제시 세포 (aAPC)5,6,7,8개발 했습니다. aAPC와 항 원 특정 신호 펩 티 드 로드 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)-co-stimulatory 분자-functionalized 수예., 안티 CD28 항 체-둘 다 풍부 항 원 특정 T 세포 그리고 그 후 (그림 1) 그들의 확장을 자극. 따라서 입자는 비용 효율적인 상용 제품을 수 모두 항 원 특정 stimulations를 충족 하도록 사용자 정의 아직 실험 및 환자 표준화 수 있다. 농축 및 확장 수행 항 원 특정 CD8 + T 세포의 수천 배 확장 수백에서 결과 처리 하 고 주파수에서 발생할 수 있습니다 최대 60% 단지 1 주일 후 특성 또는 대형의 치료 사용 셀의 수입니다. 여기, 우리는 나노 aAPCs, 나노 속성 선택에 몇 가지 중요 한 디자인 고려 사항을 확인 하는 방법을 설명 하 고에서 분리 하 고 확장 하는 희귀 한 항 원 특정 CD8 + T 세포에이 입자를 활용 하 여 몇 가지 전형적인 결과 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>DimerX I: 재조합 용해성 이합체 인간 HLA-A2:Ig 융합 단백질</td><td>BD Biosciences</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I: 재조합 용해성 이합체 마우스 H-2D[b]:Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>551323</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I: 재조합 용해성 이합체 마우스 H-2K[b]:Ig Fusion Protein</td><td>BD Biosciences</td><td>550750</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 MWCO 50 000</td><td>GE Life Sciences</td><td>28932362</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO 50 000</td><td>GE 생명 과학</td><td>28932257</td><td></td></tr><tr><td>정제 된 인간 베타 2 마이크로 글로불린</td><td>바이오 라드</td><td>PHP135</td><td></td></tr><tr><td>nanomag-d-spio, NH2, 100 nm 나노 입자</td><td>Micromod</td><td>79-01-102</td><td></td></tr><tr><td>Super Mag NHS 활성 비드, 0.2 &micro; m</td><td>오션 나노텍</td><td>SN0200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-637</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC Crosslinker&nbsp;</td><td>ProteoChem</td><td>c1109-100mg</td><td></td></tr><tr><td>2-Iminothiolane hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6256 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 절반 면적 마이크로 플레이트, 검은 폴리스티렌</td><td>Corning</td><td>3875</td><td></td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 Ig, &lambda; 1, &람다; 2, & &람다; 3 라이트 체인&nbsp; 복제 &nbsp; R26-46&nbsp; &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553434</td><td></td></tr><tr><td>FITC 마우스 안티-아르메니아 및 시리아 햄스터 IgG&nbsp; 복제 &nbsp; G192-1</td><td>BD 생명과학</td><td>554026</td><td></td></tr><tr><td>B6. Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J(형질전환 PMEL) 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005023</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J(B6 와일드타입) 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CD8a+ T 세포 분리 키트, 마우스</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>MS 열</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td> LS 열 Miltenyi 130-042-401 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE</td><td>Biolegend</td><td>405203</td><td></td></tr><tr><td>N52 디스크 자석 0.75 인치&nbsp;</td><td>케이& J Magnetics</td><td>DX8C-N52</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티-마우스 CD8a 항체, 클론 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100711</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정 가능한 녹색 데드 셀 스테인 키트, 488 nm 흥분용&nbsp;</td><td>써모피셔</td><td>L-34969</td><td></td></tr></tbody></table>

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 t 세포

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

우리는 모두 풍부 하 고 항 원 특정 T 세포를 확장 하는 도구를 개발 했습니다. 이 B) 항 원 특정 응답의 역학 조사, A) 항 원 특정 T 세포의 존재를 검출 하는 C) 이해에 같은 경우에 도움이 될 수 항 원 특정 응답 자가 면역 질병 상태에 영향을, 어떻게 D) demystify 이기종 항 원 특정 T 세포, 또는 전자에 대 한 응답) 치료에 대 한 항 원 특정 셀을 사용합니다. 도구 자성 입자에에 따라 우리 항 원 특정 및 T 셀 co-stimulatory 신호, 켤레는 우리가 인공 항 원 제시 세포 (aAPCs)으로 기간. 따라서, 기술 생산 간단 이기 때문에, 그것은 쉽게 채택 될 수; 다른 실험실에 의해 따라서, 우리의 목적을 여기 제조와는 aAPCs 사용 자세하게에서 설명 이다. 우리는 aAPCs를 항 원 특정 및 co-stimulatory 신호를 연결 하는 방법, 항 원 특정 T 세포에 대 한 풍부 하 게 그들을 활용 하는 방법 및 항 원 특정 T 세포를 확장 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 엔지니어링 디자인 고려 사항 항 원 특정 T 세포 특성화와 우리의 경험의 실험 및 생물 정보에 따라 강조 표시 됩니다.

성공적인 농축 및 항 원 특정 T 세포의 확장을 완료 하려면 로드 펩 티 드 MHC-Ig와 co-stimulatory 분자 해야 성공적으로 연결할 수 aAPC 입자. 입자 부착의 3 방법에 따라, 우리 성공적 활용 절차 결과 (그림 5a)에 대 한 몇 가지 대표적인 데이터를 제공 합니다. 실제로, ligand 밀도가 너무 낮은 경우 다음 되지 것입니다이 선형 간격 100 ligands 주위에 발생 하는 항 원 특정 CD8 + T 세포의 효과적인 자극 우리의 경험 (그림 5b)7nm.
외 양적 형광 항 체 정보 및 유전자 변형 CD8 + T 세포 확장, 나노 aAPCs 동족 유전자 변형 항 원 특정 CD8 + T 세포...

항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

그래서 우리의 새로운 기술의 주요 장점은, 우리는 농축 플러스 확장을 의미 E 플러스 E라고, 우리는 농축 플러스 확장을 의미, 우리는 농축하고 이러한 세포를 확장 할 수 있다는 것입니다, 희귀 항원 특정 세포, 동시에. 이것은 우리가 다른 설정에서 그리고 다른 임상 조정에서 그들의 역할을 조사하기 위하여 이용될 수 있을 세포의 충분한 수를 개발하는 것을 허용하거나 조차 우리가 전에 는 없었던 방식으로 면역 요법을 위해 이용할 수 있는 세포의 지금 많은 수를 개발할 수 있습니다. 우리가 개발한 방법, 이 E 플러스 E는, 신유전학의 존재에 관하여 기본적인 면역학에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다.신유전학이란 무엇입니까? 그(것)들은 우리가 지금 암 면역 요법 및 또한 항원 특정 역학의 관점에서 지금 아주 중요하고 이 요인이 질병 상태 및 효과적인 세포 치료에 어떻게 영향을 미치는지 알고 있는 개인화한 전형입니다. 이 기술의 의미는 나노 입자 인공 항원 제시 세포가 개별 적인 참을성 있는 면역 반응에 쉽게 맞추어진 기성 품일 수 있기 때문에 면역 요법으로 확장됩니다.나노입자 인공 항원 제시 세포를 생성하기 위해, 리오필화된 입자를 재서스펜션 버퍼의 1밀리리터로 재보중단하고 골재가 보이지 않게 될 때까지 적어도 15분 동안 현탁액을 적극적으로 소용돌이시킵니다. 단백질과의 반응 전에 충분히 소용돌이및 재중단되지 않은 입자는 해리될 수 없는 더 큰 응집입자를 초래할 것이다. 마그네틱 입자를 마그네틱 스탠드에 놓고 상체를 제거하고 0.5 밀리리터의 신선한 재서스펜션 버퍼로 재보힙니다.입자 현탁액을 골재가 보이지 않게 될 때까지 소용돌이를 위해 유리 신경병 병으로 옮기고, 재중단 된 입자의 1 밀리그램당 총 자극 신호 0.1 밀리그램을 추가합니다. 소용돌이 후, 서스펜션이 회전기에서 혼합과 실온에서 2.5 시간 동안 반응 할 수 있도록, 혼합과 실온에서 추가 30 분 배양에 대한 담금질 버퍼의 0.1 밀리리터의 추가. 두 번째 반응의 끝에서, 마그네틱 스탠드에 신경병 유리병을 놓고 재서스펜션 버퍼 1밀리리터로 입자를 4번 세척하고, 세척 후 깨끗이 회전할 때 버퍼를 제거하고 자석에 대한 후속 세척을 위한 신선한 재서스펜션 버퍼로 교체한다.마지막 세척 후 용액을 흡인하고 마그네틱 스탠드에서 입자를 제거한 다음 입자를 최대 6개월 동안 섭씨 4도에 신선한 재서스펜션 버퍼 1밀리리터에 보관합니다. 항원 별

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를...

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

이 비디오는 자기 분리기를 사용하여 음성 선택을 통해 마우스의 비장에서 T 세포를 농축하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 특정 세포 표면 항원에 대한 항체 또는 리간드를 사용하여 고갈을 위해 샘플의 다른 세포를 표적으로 삼는 것을 포함합니다.

T-세포 농축: 자기 분리를 통해 혼합 세포 집단에서 T-세포를 분리하는 기술

이 비디오는 항원 펩타이드가 로드된 MHC-Igs 및 항-CD28 항체로 기능화된 자기 나노입자 기반 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하여 희귀 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. aAPC와 항원 펩타이드 표적 T 세포 수용체를 특이적으로 발현하는 CD8+ T 세포의 상호 작용 후 in vitro 확장은 이 CD8+ T 세포 집단의 농축 및 확장을 초래합니다.

항원 특이적 CD8+ T 세포의 나노 입자 기반 농축 및 증식

여기에, 우리는 강한 자기 모멘트 강한 근적외선 (NIR) 흡수와 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 특정 분자 표적을 필요로 다양한 생물 의학 응용 프로그램의 Fc 부분을 통해 나노 입자에 항체 접합을 포함한다.

Immunotargeted의 합성 자기 - 플라즈 모닉 나노 클러스터

여기에서는 쥐의 비장에서 많은 수의 쥐 불변 자연 살해 T 세포를 생성하는 데 사용할 수 있는 적응된 프로토콜을 제시합니다. 의정서는 비장 iNKT 세포가 한정된 수의 동물 및 시약을 사용하여 시험관 내에서를 위해 풍성하게 하고, 고립되고 확장될 수 있는 접근 방식을 개략적으로 설명합니다.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

코발트 도핑된 마그네토페리틴의 합성 및 양이온화를 위한 프로토콜과 양이온화된 마그네토페리틴으로 줄기세포를 빠르게 자화하는 방법을 제시합니다.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.

체외 및 생체 내 연구를 위한 마우스 불변 천연 킬러 T 세포의 정화 및 확장

자사는 자기 비드 기반 T 세포 농축 및 펩타이드:주요 조직 적합성 복합체(MHC) 사량체를 통해 쥐 폐에서 희귀 항원 특이적 T 세포 집단을 분리하고 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

학습하세요 자성 나노입자를 이용한 E plus E 기법으로 희귀 항원 특이 T 세포를 풍부하게 확장하는 방법. 이 기술은 면역요법 및 기초 면역학 연구에 활용됩니다.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

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